專利名稱：枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及枸杞(Lycium chinense Miller)中胡蘿卜素β -羥化酶基因LmChyB 的克隆，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在胡蘿卜素分子中引進羥基、酮基、甲氧基和酯鍵等即可將其轉(zhuǎn)化成含氧衍生物， 胡蘿卜素β-羥化酶(Carotene β-hydroxylase，ChyB)可在β -胡蘿卜素中引進兩個羥基，將其催化成玉米黃質(zhì)。目前為止，已從土豆、番茄、辣椒、擬南芥、玉米、野生煙草等植物中分離到類胡蘿卜素代謝途徑中的一些基因。類胡蘿卜素是C40的碳氫化合物，廣泛存在于植物、一些光合細菌以及藻類中的脂溶性色素，主要包括胡蘿卜素(carotenes)和它們的氧化衍生物葉黃素(xanthophylls) 兩大類。類胡蘿卜素在植物光合作用中起著至關(guān)重要的作用，它們是光合天線和光反應(yīng)中心復(fù)合體不可缺少的結(jié)構(gòu)成分，還可以保護葉綠素免受強光導(dǎo)致的光氧化破壞。類胡蘿卜素是維生素A的前體，具有增強免疫、抗氧化、增進細胞縫間聯(lián)接交流、預(yù)防、延緩及治療癌癥的功能。Aluru等將細菌crtB (pds)和crtl基因串聯(lián)在一起，在玉米胚乳中特異性表達， 胚乳中類胡蘿卜素含量提高34倍，并積累了大量的維生素A的前體β -胡蘿卜素。生物系統(tǒng)中一旦形成高度活潑的具有損傷能力的自由基后，就會對細胞遺傳物質(zhì)和細胞膜進行強烈的破壞，導(dǎo)致細胞功能下降，機體衰老以及疾病的發(fā)生。類胡蘿卜素，尤其是胡蘿卜素能抑制、清除體內(nèi)自由基，可以延緩衰老和預(yù)防腫瘤、血栓、動脈粥樣硬化等疾病。類胡蘿卜素能增加免疫系統(tǒng)中B細胞的活力、消滅外源入侵的病原菌，能提高淋巴輔助T細胞的活力，協(xié)助B細胞產(chǎn)生抗體，并提高其他免疫組分的活性；還能增加自然殺傷細胞的數(shù)目，以消除機體內(nèi)被感染的細胞或癌細胞。據(jù)報道，除胡蘿卜素外，番茄紅素等也有增加免疫力的功能。隨著人類對類胡蘿卜素藥用價值及醫(yī)療保健作用的不斷發(fā)現(xiàn)，對類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量的需求也將越來越大，然而，類胡蘿卜素很難用化學(xué)方法合成?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究手段的發(fā)展，使得類胡蘿卜素生物合成途徑中的一系列關(guān)鍵酶的基因被陸續(xù)分離鑒定， 為通過DNA重組技術(shù)和遺傳工程調(diào)控生產(chǎn)類胡蘿卜素開辟了道路，特別是通過類胡蘿卜素基因工程獲得“金色水稻”和“金油菜”，極大地增強了人們開展植物類胡蘿卜素基因工程的信心。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種枸杞胡蘿卜素羥化酶基因。本發(fā)明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的用途。
本發(fā)明提供了一種枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列構(gòu)成。本發(fā)明提供了一種上述枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB編碼的蛋白質(zhì)，如序列表中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了一種上述枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB重組克隆載體 pMD18-T-LmChyB。含有上述的枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因LmChyB的重組載體，這些重組載體包括質(zhì)粒。所述的質(zhì)粒表達載體大腸桿菌表達載體PET28a-LmChyB。含有上述枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB完整編碼閱讀框序列的宿主細胞， 如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞。本發(fā)明提供了一種含有LmChyB基因工程菌。上述枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因LmChyB的應(yīng)用包括該LmChyB基因編碼的蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用；本發(fā)明的技術(shù)方案具體概述如下本發(fā)明提供的一種枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，還包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明提供的一種枸杞胡蘿卜素羥化酶基因LmChyB編碼的蛋白，如序列表 SEQ IDN0. 2所示氨基酸序列。本發(fā)明的克隆方法由下述步驟組成從枸杞葉片中提取總RNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組Unigene序列中枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因核苷酸序列設(shè)計上游引物L(fēng)mChyBF :5，-ATGGCTGCCGGAATTTCAGGC-3，，然后利用3 ‘ RACE 方法擴增得到完整的基因序列為939bp。本發(fā)明構(gòu)建含枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB的大腸桿菌表達載體 PET28a-LmChyB,由下述步驟組成1)構(gòu)建含有枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因LmChyB的中間載體pMD18-T_LmChyB 設(shè)計由SEQ ID NO. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID N0.4所示的下游引物P2，以枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物連接于PMD18-T載體，獲得含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的LmChyB基因的中間載體 pMD18-T-LmChyB。2)構(gòu)建大腸桿菌表達載體pET28a_LmChyB 設(shè)計由SEQ ID NO. 5所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0. 6所示的下游引物P4， 以質(zhì)粒pMD18-T-LmChyB為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XhoI酶切后， 將大腸桿菌表達載體pET28a經(jīng)BamHI和BioI酶切，二者進行連接反應(yīng)，得到大腸桿菌表達載體 pEI^8a-LmChyB。本發(fā)明提供了一種枸杞胡蘿卜素羥化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用，首次從枸杞中分離出編碼胡蘿卜素羥化酶的完整cDNA，連接到大腸桿菌表達載體上，利用外源表達系統(tǒng)驗證枸杞LmChyB基因在蛋白水平表達的產(chǎn)物具有酶的活性。本發(fā)明通過提取新鮮枸杞葉片總RNA，用3' RACE技術(shù)克隆了枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB，得到完整的基因序列為939bp。構(gòu)建了大腸桿菌表達載體 PET28a-LmChyB，應(yīng)用大腸桿菌異源表達系統(tǒng)，對克隆的枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因 LmLycB編碼的酶活性進行了鑒定，胡蘿卜素β-羥化酶LmOffB能夠在β -胡蘿卜素中引進兩個羥基，將胡蘿卜素催化成玉米黃質(zhì)。本發(fā)明所述的枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因可望用于制備轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜植株。


圖 lpMD18-T-LmChyB 載體示意圖。圖2pET28a_LmChyB酶切驗證結(jié)果。圖3LmChyB在大腸桿菌中的表達。圖4表達LmCHYB的大腸桿菌HPLC檢測結(jié)果。
具體實施例方式實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1枸杞胡蘿卜素β -羥化酶基因LmChyB的克隆以 RNeasy Plant Mini Kit ^!IAGEN，German)試劑盒，從 IOOmg 新鮮枸杞葉片中提取Total RNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的Unigene序列設(shè)計上游引物，枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因 LmChyB 上游引物為LmChyBF :5，-ATGGCTGCCGGAATTTCAGGC-3，。利用 3' -FULLRACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa, Japan)試劑盒擴增得到完整的基因序列。具體步驟①以Total RNA 為模板，使用3' RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成1st Strand cDNA，反應(yīng)體系如
下RNA 2 μ 13' RACE Adaptor 1 μ 15XM-MLV Buffer 2μ 1dNTP Mixture 1 μ 1RNase Inhibitor 0.25 μ 1Reverse Transcriptase M-MLV 0.25 μ 1RNase Free dH20 3. 5 μ 1反應(yīng)條件42°C，60min；70°C，15min。②根據(jù)基因的上游引物與試劑盒提供的下游引物3' RACE out primer 5，-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，，以 1st Strand cDNA 為模板，進行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系如下1st PCR 產(chǎn)物2μ1
dNTP Mixture 8 μ 1LmChyBF 2μ 13' RACE out primer 2μ 110XLA PCR Buffer II :4 μ 1MgCl2 3μ 1TaKaRa LA Taq 0. 25 μ 1dH20 28. 75 μ 1反應(yīng)條件94°C，3min；94°C,30sec ；55°C,30sec ；72 °C, Imin ；72 °C，lOmin，30 個循環(huán)。實施例2克隆載體pMD18-T_LmChyB的構(gòu)建過程將序列表所示的LmChyB基因與pMD18_T載體連接，反應(yīng)體系如下目的PCR 片段4μ1pMD18_T 載體1μ 1SolutionI 5μ 1反應(yīng)條件16°C，30min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E-Coli. T0P10，涂布于含氨芐的LB平板。 以目的基因為引物進行 PCR(反應(yīng)條件:94°C,3min ；94°C，30sec ；54°C,30sec ；72°C, Imin ； 72°C，10min，30個循環(huán)。)得到PCR產(chǎn)物，電泳條帶正確，然后送華大基因公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進行Blast，表明為該基因。實施例3大腸桿菌表達載體PET28a-LmChyB的構(gòu)建過程首先，以pMDIS-T-LmChyB為模版，P3和P4分別為上下游引物擴增LmChyB片段， 其反應(yīng)條件為 94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C，2min ；72°C，lOmin，30 個循環(huán)。 在P3中引入BamHI酶切位點(GGATCC)，在P4中引入BioI酶切位點(CTCGAG)。然后，PCR 產(chǎn)物與pET28a質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI和BioI雙酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接16°C，l^irs，連接 (2 μ 1 10XT4buffer,0. 5μ 1 T4DNA 連接酶，5 μ 1 載體 DNA，7. 5 μ 1 外源 DNA，5 μ 1 ddH20)。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E coli.ToplO，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因為引物進行PCR得到 939bp產(chǎn)物，酶切鑒定得到目的條帶如圖2所示，最后送華大基因測序公司測序，結(jié)果表明載體pET28a-LmChyB構(gòu)建正確。將構(gòu)建好的植物表達載體PEI^8a-LmChyB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。實施例4LmChyB基因在大腸桿菌中的功能驗證在大腸桿菌中共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACCAR16 Δ crtX(氯霉素抗性)和表達載體 PET28a-LmChyB(卡那霉素抗性)，具體步驟為①向E. coli(BL21)感受態(tài)細胞中加入兩種質(zhì)粒DNA各1 μ L，混勻，冰上放置30min ；②42°C熱激90s，然后冰上放置2_;3min ；③加 800 μ L，37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)45min ；④吸取50 μ L上述培養(yǎng)液于含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，涂板；⑤倒置平板，37°C，培養(yǎng) 12hrs。枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB編碼的酶可以將橘黃色的β -胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的玉米黃質(zhì)，表現(xiàn)為大腸桿菌菌落顏色由橘黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如圖3所示Α為轉(zhuǎn)化
6質(zhì)粒 pACCAR16 Δ crtX ；B 為共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pACCAR16 Δ crtX 和表達載體 pEI^8a_LmChyB。LB 液體培養(yǎng)基組成為10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物。大腸桿菌類胡蘿卜素的提?、匐x心收集菌體，菌體質(zhì)量不超過0. Sg ；②加20ml 甲醇到菌體中，重懸；③加^ι1，60% Κ0Η，重懸；④60°C溫浴20min，再將樣品冷卻至室溫； ⑤將樣品與20ml含有10%乙醚的石油醚(bp. 40-60°C )轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，充分混合，萃取；⑥若樣品與乙醚/石油醚分層效果不好，可以加入適量的飽和NaCl溶液和少量乙醇； ⑦收集上層有機相；⑧通氮氣，吹干樣品。大腸桿菌類胡蘿卜素的HPLC檢測將樣品溶于40yL丙酮，使用nucleosil 100-3c250X4. 6mm (MN ,Germany)色譜柱，蘭博(進口 SSI)四元梯度泵。按照 Sander (LaneC. Sander, Katherine Epler Sharpless, et al, Development of Engineered Stationary Phases for the Seperation of Carotenoid Isomers, Anal. Chem,1994,66 :1667-1674) 等(1994)的方法進行高效液相色譜分析。流動相為乙腈甲醇異丙醇=85 10 5， 流速為1. OmL/min，同時用Thermo 二極管陣列(diode-array detector,DAD)檢測器，全波長掃描類胡蘿卜素譜圖。如圖4所示A和B分別為為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PACCAR16 Δ crtX和共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACCAR16 Δ crtX和表達載體pET28a_LmChyB的提取物譜圖。
權(quán)利要求
1.一個枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因，其特征在于選自以下核苷酸序列之一1)具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的枸杞胡蘿卜素羥化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的枸杞胡蘿卜素羥化酶基因全序列或部分片段。
4.一種權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于它是質(zhì)粒表達載體大腸桿菌表達載體 pET28a-LmChyB0
5.一種權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于它是重組載體的大腸桿菌BL21。
6.一種宿主細胞，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的枸杞胡蘿卜素羥化酶基因全序列或部分片段。
7.—種權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于它是大腸桿菌細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應(yīng)用。選自以下核苷酸序列之一1)具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通過提取新鮮枸杞葉片總RNA，用3′RACE技術(shù)克隆枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmChyB，得到完整的基因序列為939bp。構(gòu)建了大腸桿菌表達載體pET28a-LmChyB，應(yīng)用大腸桿菌異源表達系統(tǒng)，對克隆的枸杞胡蘿卜素β-羥化酶基因LmLycB編碼的酶活性進行了鑒定，枸杞胡蘿卜素β-羥化酶LmCHYB能夠在β-胡蘿卜素中引進兩個羥基，將β-胡蘿卜素催化成玉米黃質(zhì)。
文檔編號C12N15/70GK102559713SQ201110417010
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者關(guān)春峰, 吳疆, 季靜, 李招娣, 王罡, 金超 申請人:天津大學(xué)