專利名稱：一種基因組dna提取方法
技術領域：
本發(fā) 明涉及一種基因組DNA提取方法，尤其涉及一種一次性獲取較多DNA的提取方法。
背景技術：
提取基因組DNA用于PCR分離基因、Southern雜交、基因組文庫構建等。由于提取基因組DNA花費時間長，因此，通常會通過一次性提取較多DNA節(jié)約人力物力，而對于DNA 需求量較大的實驗如基因組文庫構建，一次性獲取較多DNA就相當必要了。提取基因組DNA的方法很多，如濃鹽法、陰離子去污劑法、酚氯仿抽提法、水抽提法等，但總的方法步驟和原理為DNA分離根據(jù)濃鹽法、陰離子去污劑法、酚氯仿抽提法或水抽提法提供的試劑將已破碎細胞的溶液中的基因組DNA與蛋白質、脂類、糖類、RNA等分離，獲得DNA水溶液；DNA析出在DNA水溶液中加入0. 8倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇使DNA 析出；DNA洗滌干燥析出DNA后，通過離心棄上清獲取DNA沉淀，再將沉淀用70%乙醇洗滌2-3次，并于室溫干燥；DNA 溶解保存加入水或 TE 溶液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA · 二鈉、pH 8. 0)溶解已干燥的DNA，放-20°C存放。為獲取較多DNA首要采用的方法是增加用于提取DNA的材料的量，與之相適應，提取DNA時選擇容積較大的容器，一般采用5-50ml離心管(提取少量DNA時一般使用1. 5ml 離心管)。當然，通過實驗過程中的操作規(guī)范和一些操作方法的改進也會適當增加DNA提取的量?，F(xiàn)有文獻中，由高等教育出版社2007年出版、魏群主編的《分子生物學實驗指導》 (第2版)的第二篇實驗九植物基因組DNA的提取，采用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，采用 50ml離心管為容器以一次性提取較多的實驗材料；由武漢大學出版社2009年出版、嚴海燕主編的《基因工程與分子生物學實驗教程》的實驗一植物基因組DNA的提取和酶切，采用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，采用7ml離心管為容器以一次性提取較多的實驗材料。但是， 由于一次性提取的DNA量較多，在最后加入水或TE溶液溶解DNA時，大量DNA成團無法溶解。雖然可以采用高溫水浴加熱或用槍頭吸打溶液的方法促使DNA溶解，但一般謹慎采用， 因為高溫水浴加熱所需時間長、會造成DNA降解、而且溶解仍不完全；槍頭吸打溶液會造成 DNA機械性剪切，使DNA長度達不到后續(xù)實驗要求。DNA不能快速充分溶解直接造成其濃度低，則DNA的有效質量低，無法滿足后續(xù)實驗對DNA質量的要求，尤其是構建基因組文庫。并且，在現(xiàn)有提取基因組DNA方法中，沒有對DNA做質量預測，也沒有對DNA做濃度預測的具體方法的提出，在溶解DNA時加入的水或TE溶液的體積僅憑運氣或憑經驗、無法掌控，極易造成濃度達不到后續(xù)實驗要求的濃度范圍而使DNA提取實驗功虧一簣。因此，很有必要尋找一種在不影響DNA長度的情況下，使DNA快速充分溶解，且保證DNA濃度達后續(xù)實驗要求的提取方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種基因組DNA提取方法，在不影響DNA長度的前提下可以使DNA快速、充分溶解，且保證DNA濃度達后續(xù)實驗要求。 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是一種基因組DNA提取方法，包括DNA分離、DNA析出、DNA洗滌干燥和DNA溶解保存，所述DNA分離得到的DNA水溶液平均分裝到多個1. 5-5ml小離心管中；所述DNA溶解保存前對所述小離心管中DNA進行質量預測。DNA水溶液通過分裝后再分別進行DNA析出、DNA洗滌干燥和DNA溶解保存，由于每個小離心管中DNA的量少，則DNA溶解保存時加入少量水或TE溶液即可快速溶解干燥的DNA，該方法利用增加溶質與溶劑接觸面積提高溶解速度和溶解程度的原理，甚至不需吹打、不需加熱就能使DNA快速充分溶解，從而解決DNA溶解難的問題；不吹打不加熱也降低了 DNA斷裂的幾率，保證了 DNA的長度。通過平均分裝，使DNA質量預測成為可能，以便控制DNA濃度達后續(xù)實驗要求。優(yōu)選的，所述DNA水溶液平均分裝到多個1. 5ml小離心管中。1. 5ml小離心管底部尖細，離心時有利于DNA沉積并貼于管底，且加入少至5 μ 1體積的溶劑就能覆蓋管底、覆蓋 DNA,即使DNA干燥后肉眼不易看見也能保證其被完全覆蓋而溶解。所述DNA質量預測為向所述DNA洗滌干燥后的任一只小離心管中加入5_50 μ 1的水或TE溶液后檢測DNA濃度，并根據(jù)此濃度和體積得到DNA的質量。由于平均分裝，每個小離心管中DNA的量大致相同，根據(jù)預測的質量向其余小離心管加入合適的水或TE溶液可以保證濃度達后續(xù)實驗的要求，不至于盲目地或憑經驗地加入水或TE溶液溶解DNA而導致濃度達不到后續(xù)實驗要求。DNA濃度的可控制節(jié)約了實驗時間和實驗成本，大大提高了實驗的成功率。所述DNA質量預測還可以為向所述DNA洗滌干燥后的任意2_4只小離心管中各加入相同體積的水或TE溶液后檢測DNA濃度并取平均值，并根據(jù)此濃度和體積得到DNA的平均質量。平均質量的獲取使DNA濃度的控制更為準確。所述檢測DNA濃度可以通過測定吸光值0D26(I/0D28(i或者通過瓊脂糖凝膠電泳得到。本發(fā)明通過分裝DNA水溶液，在DNA溶解保存時增加了 DNA與溶劑的總的接觸面積，在不影響DNA長度的前提下即可使提取的DNA快速充分溶解；通過分裝，還使得DNA質量預測變?yōu)榭赡?，則可以保證提取的DNA的濃度達后續(xù)實驗要求。與現(xiàn)有技術相比，DNA溶解保存時其溶解速度大大提高，溶解程度更是由現(xiàn)有技術的成團不易溶解變?yōu)橥耆芙猓?DNA質量的可預測，使得在DNA溶解保存時其濃度可控制，解決了現(xiàn)有技術盲目地或憑經驗地加入溶劑溶解DNA導致濃度達不到要求而失敗的問題。


圖1為本發(fā)明實施方式提取DNA的流程圖；圖2為本發(fā)明實施例所提取DNA的電泳圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發(fā)明范圍之內。本發(fā)明提取DNA步驟如圖1，具體步驟如下

DNA分離根據(jù)濃鹽法、陰離子去污劑法、酚氯仿抽提法或水抽提法提供的試劑將已破碎細胞的溶液中的基因組DNA與蛋白質、脂類、糖類、RNA等分離，獲得DNA水溶液；DNA水溶液分裝將分離得到的DNA水溶液平均分裝到1. 5_5ml小離心管中。DNA 水溶液通過分裝，每個小離心管中DNA的量少，則DNA溶解保存時DNA與水或TE溶液總的接觸面積增大，提高了 DNA的溶解速度和溶解程度，甚至不需吹打、不需加熱就能使DNA快速充分溶解，從而也解決了 DNA溶解難的問題；不吹打不加熱也降低了 DNA斷裂的幾率，保證了 DNA的長度。尤其是1. 5ml離心管，其底部尖細，更有利于DNA沉積管底，而且加入少至5μ 1體積的溶劑就能覆蓋管底、覆蓋DNA，有利于DNA溶解。DNA析出在分裝了 DNA水溶液的小離心管中加入0. 8倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇使DNA析出；DNA洗滌干燥析出DNA后，離心并傾倒上清則DNA沉積于管底，再用70%乙醇洗滌DNA2-3次，并于室溫干燥；DNA質量預測對于平均分裝得到的DNA，洗滌干燥后，向任一只小離心管中加入 5-50 μ 1的水或TE溶液，取部分通過測定吸光值OD26tZOD28tl或者通過瓊脂糖凝膠電泳得到 DNA濃度，也可以是向任意2-4只小離心中加入水或TE溶液測定DNA濃度并取平均值，根據(jù)得到的濃度和體積得到DNA的質量。DNA溶解保存根據(jù)預測的質量和后續(xù)實驗的濃度要求，向其余小離心管中加入合適體積的水或TE溶液，放-20°C存放。通過對DNA質量預測，可以控制DNA的濃度，不至于盲目地或憑經驗地加入水或TE溶液溶解DNA而導致濃度達不到后續(xù)實驗要求。節(jié)約了實驗時間和實驗成本，大大提高了實驗的成功率。與現(xiàn)有技術相比，DNA溶解保存時其溶解速度大大提高，溶解程度更是由現(xiàn)有技術的成團不易溶解變?yōu)橥耆芙?；DNA質量的可預測，使得在DNA溶解保存時其濃度可控制， 解決了現(xiàn)有技術盲目地或憑經驗地加入溶劑溶解DNA導致濃度達不到要求而失敗的問題。實施例以酚氯仿抽提法結合本發(fā)明方法提取蝗蟲基因組DNA，具體步驟如下101. DNA分離取新鮮的蝗蟲大腿肌肉在液氮中迅速研成粉末；向一 50ml離心管中加入體積約1. 5ml所述粉末，再加入15mlDNA裂解液(0. lmol/L NaCl,0. 01mol/L EDTA · 二鈉、0. lmol/L Tris,2% SDS、pH 8. 0)，輕輕吹打使粉末完全溶解；加入RNA酶使終濃度為20 μ g/mL,加入蛋白酶K使終濃度為100 μ g/mL, 50°C溫育3小時，裂解細胞，消化蛋白；再加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合物(體積比25 24 1)，輕輕混勻，分層后，以轉速為6500rpm離心10分鐘，吸取上層于另一 50ml離心管中；在獲得的上層溶液中加入等體積的氯仿、異戊醇混合物(體積比24 1)，輕輕混勻，分層后，轉速6500rpm離心10分鐘， 上層即為DNA水溶液(約IOml)。102. DNA水溶液分裝將101得到的DNA水溶液平均分裝到25個1. 5ml離心管中，每管溶液約400μ 1。與現(xiàn)有技術將上清全裝入一個50ml離心管中相比，通過分裝每個離心管中的DNA的量少，有利于之后DNA在TE溶液中的充分溶解和快速溶解；通過平均分裝， 每個離心管的溶液所含DNA的量相同，則在DNA洗滌并干燥后，對其中1只或幾只小離心管中的DNA進行濃度檢測、計算DNA重量，可以控制其余小離心管中DNA的濃度達后續(xù)實驗要求。103. DNA析出向所述分裝的1. 5ml離心管各加入800 μ 1無水乙醇，于_20°C放置 8-12小時使DNA析出。104. DNA洗滌干燥將放置8-12小時的1. 5ml離心管于4°C、IOOOOrpm離心10分
鐘，傾去上清，DNA沉淀聚集并貼于管底；用少量的70%乙醇漂洗沉淀2次，4°C、6500rpm離心10分鐘，沉淀貼于管底，傾倒上清，并于室溫風干沉淀。105. DNA質量檢測向其中一只1. 5ml離心管加入20 μ ITE溶解，并取1_2 μ 1檢測吸光值0D260/0D280值，得到濃度約為300mg/ml，計算得該1. 5ml離心管中DNA重量為 6mg。與現(xiàn)有技術相比，1. 5ml離心管管底尖細，沉淀貼于管底，加入少至5 μ ITE溶液足以覆蓋沉淀，即使DNA風干后肉眼不易看見也能使其完全覆蓋而溶解；通過測量其中一只1. 5ml 離心管中DNA的量獲得合適的TE溶液的體積，可使其余1. 5ml離心管中的DNA濃度達到后續(xù)實驗的要求，不至于因為濃度的原因導致實驗失敗。106. DNA溶解保存根據(jù)105得到的小離心管中DNA的重量，以及后續(xù)實驗對 DNA濃度要求，若后續(xù)實驗要求DNA濃度為500-1000mg/ml，則可以向其余小離心管加入 10 μ ITE溶液，濃度為600mg/ml達到要求，可以將DNA溶液合并于1只離心管中，_20°C保存待用。 以上述方法得到濃度約為600mg/ml的DNA溶液共240 μ 1 ； 0D260/0D280值為 1. 86，純度高；觀察DNA電泳圖如圖2 (Μ為Low Range PFG DNAMarker, 1為提取的DNA樣品)，提取的DNA長度在80-200kb。該方法得到的DNA純度高、長度長，能夠較好地適用于 PCR分離基因、Southern雜交、基因組文庫構建等。本發(fā)明所舉實施方式或者實施例對本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點進行了進一步的詳細說明，所應理解的是，以上所舉實施方式或者實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內對本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明保護范圍之內。
權利要求
1.一種基因組DNA提取方法，包括DNA分離、DNA析出、DNA洗滌干燥和DNA溶解保存， 其特征在于，所述DNA分離得到的DNA水溶液平均分裝到1. 5-5ml小離心管中；所述DNA溶解保存前對所述小離心管中DNA進行質量預測。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述小離心管為1.5ml。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質量預測方法為向所述DNA洗滌干燥后的任一只小離心管中加入5-50 μ 1的水或TE溶液后檢測DNA濃度，根據(jù)DNA濃度和體積得至丨J DNA的質量。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質量預測方法為向所述DNA洗滌干燥后的任意2-4只小離心管中各加入相同體積的水或TE溶液后檢測DNA濃度并取平均值，根據(jù) DNA濃度和體積得到DNA的質量。
5.如權利要求3或者4所述的方法，其特征在于，所述DNA濃度通過測定吸光值OD26tl/ OD28tl 得到。
6.如權利要求3或者4所述的方法，其特征在于，所述DNA濃度通過瓊脂糖凝膠電泳得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因組DNA提取方法，包括DNA分離、DNA析出、DNA洗滌干燥和DNA溶解保存，所述DNA分離得到的DNA水溶液平均分裝到1.5-5ml小離心管中；所述DNA溶解保存前對所述小離心管中DNA進行質量預測。本發(fā)明通過分裝得到多份少量DNA，則DNA溶解保存時增加了DNA與溶劑的總的接觸面積，在不影響DNA長度的前提下即可使提取的DNA快速充分溶解；所述DNA溶解保存前對平均分裝的小離心管中DNA進行質量預測，通過質量預測可以控制DNA的濃度達后續(xù)實驗要求。
文檔編號C12N15/10GK102382821SQ20111036880
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權日2011年11月18日
發(fā)明者向瀏欣, 蔡應繁 申請人:重慶郵電大學