專利名稱：建蘭開(kāi)花整合基因-CeFT基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在建蘭中表達(dá)的開(kāi)花整合基因-CeFT基因、含有該基因的重組植物表達(dá)載體，以及CeFT基因在縮短植物童期，促進(jìn)植物提前開(kāi)花中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
FT (FLOWERING LO⑶S T)基因是花期調(diào)控途徑中的關(guān)鍵基因。它位于花發(fā)育途徑中的匯集點(diǎn)，整合來(lái)自光周期途徑、春化途徑和自主途徑等不同花發(fā)育途徑的信號(hào)，在植物花發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。擬南芥的FT基因?qū)儆贔T/TFL1基因家族，又稱為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白 (phosphatidyletha nolamine-binding protein,PEBP)基因家族，因其蛋白易與磷脂酰乙醇胺結(jié)合而得名。根據(jù)PEBP基因家族成員在擬南芥和水稻中的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系以及對(duì)開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控作用，將其分為3個(gè)亞家族(I)FT亞家族(FT-Iike)，包括FT基因、TSF基因， 起促進(jìn)開(kāi)花作用，TSF與FT功能部分冗余；(2) MFT亞家族(MFT-Iike)，包括MFT基因，在開(kāi)花時(shí)間調(diào)控上與FT功能冗余；(3) TFLl亞家族(TFLl-Iike)，包括了 TFL1、BFT和ATC基因， 起開(kāi)花抑制作用(Chardon and Damerv al，2005)。在植物PEBP基因家族中，F(xiàn)T和TFLl基因是研究最為清楚的兩個(gè)成員。FT為開(kāi)花促進(jìn)因子，TFLl為開(kāi)花抑制因子，它們?cè)跊Q定開(kāi)花時(shí)間的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。FT蛋白和TFLl的晶體結(jié)構(gòu)存在一定差異，這種差異導(dǎo)致它們成花過(guò)程中起相反功能。Hanzawa等000 研究表明替換一個(gè)氨基酸，即FT中的Tyr85 和TFLl中的His88，便能使FT與TFLl功能互換。這兩個(gè)基因通過(guò)抑制莖端分生組織形成花原基，來(lái)延長(zhǎng)植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程，從而延遲植株的生殖生長(zhǎng)進(jìn)程。FT蛋白是成花素的主要組成部分，在不同的開(kāi)花遺傳途徑中，上游關(guān)鍵基因調(diào)控FT基因，使FT蛋白從韌皮部移動(dòng)到莖頂端分生組織(SAM)，與帶堿性亮氨酸拉鏈蛋白 (basic region-leucine zipper, b-ZIP)轉(zhuǎn)錄因子 FD (FLOWERING LOCUS D)在莖尖通過(guò)蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活花分生組織特性基因API (APETALA1)來(lái)啟動(dòng)花發(fā)育過(guò)程。在擬南芥中超表達(dá)以下植物的FT同源基因，均能顯著促進(jìn)開(kāi)花擬南芥(Abe et al.，2005)，楊樹(shù)(Hsu et al.，2006)，番茄(Lifschitz et al.，2006)，矮牽牛(Hayama et al.，2007)，葡萄(Carmona et al.，2007)，南瓜(Lin et al.，2007)以及水稻(Kojima et al·，2002)等。而在番茄(Lifschitz et al.，2006)，楊樹(shù)(Bohlenius et al. ,2006 ；Hsu et al.，2006)，小麥(Yan et al.，2006)，矮牽牛(Hayama et al. ,2007)等植物中異源表達(dá)FT或FT同源基因同樣也能引起早花現(xiàn)象。尤其是在木本植物楊樹(shù)中，野生型需要經(jīng)過(guò) 8-20年才能開(kāi)花，而超表達(dá)PtFTl的毛果楊在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)四周后便可觀察到柔荑花序 (Bohlenius et al. ,2006) 反之，在擬南芥和水稻中，采用RNAi或miRNA手段使FT基因的表達(dá)下調(diào)后，植株的開(kāi)花時(shí)間延遲(Kojima et al. ,2002 ；Komiya et al.，2008)。這些結(jié)果表明FT及其同源基因是植物開(kāi)花所必需的。
FT不僅在成花轉(zhuǎn)變過(guò)程中起重要作用，而且還參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的一些過(guò)程。如調(diào)控?cái)M南芥果莢和種子的發(fā)育過(guò)程，F(xiàn)T mRNA在子葉中表達(dá)量比較高，而在頂端分生組織表達(dá)量非常低。另外，在楊樹(shù)中，F(xiàn)T同源基因PtFTl表達(dá)水平還是秋季生長(zhǎng)停滯和芽休眠的一個(gè)關(guān)鍵性決定因素，秋季短日照通過(guò)調(diào)控PtFTl的活性從而誘導(dǎo)不同緯度的林木群體生長(zhǎng)停滯和芽休眠的啟動(dòng)。建蘭(Cymbidiumensifolium)是蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)中的小花型地生種，其花香馥郁，色澤淡雅，花姿秀美，葉態(tài)飄逸，備受歡迎，為我國(guó)傳統(tǒng)銘花之一， 具有很好的市場(chǎng)價(jià)值。建蘭的幼年期較長(zhǎng)，約3年左右，生產(chǎn)成本高，因此如何花期調(diào)控縮短建蘭的童期，使其提早開(kāi)花有很重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)意義。此外我國(guó)對(duì)花卉的傳統(tǒng)消費(fèi)期主要集中在春節(jié)和其它重要節(jié)假日，要實(shí)現(xiàn)建蘭的產(chǎn)業(yè)化還要能夠應(yīng)節(jié)上市，其商品價(jià)值才會(huì)更高。建蘭的花期通常在6-10月，一年可多次開(kāi)花，但在春節(jié)、元旦等重要節(jié)日中卻不能開(kāi)花，此外，建蘭的花期一般只有1個(gè)月，作為年宵花卉還需在花期和延長(zhǎng)開(kāi)花時(shí)間上進(jìn)行調(diào)控。目前，在建蘭以及相關(guān)的國(guó)蘭的花期調(diào)控方面的研究比較少，潘瑞熾和葉慶生發(fā)現(xiàn)低溫可促進(jìn)墨蘭和春蘭的花芽分化和發(fā)育，高溫(30/25°C和25/20°C )有利于建蘭花芽分化與發(fā)育。但有關(guān)建蘭的成花機(jī)理與相關(guān)基因克隆和功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種在建蘭中表達(dá)的開(kāi)花整合基因-CeFT基因及其編碼蛋白和含有該基因的重組植物表達(dá)載體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供CeFT基因在縮短植物童期，促進(jìn)植物提前開(kāi)花中的應(yīng)用，如縮短擬南芥童期，促進(jìn)其提前開(kāi)花。本發(fā)明以建蘭“金絲馬尾”(C. ensifolium ‘Jin Si Ma Wei，)的花芽為材料，提取其總RNA，再將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA第一鏈模板，根據(jù)FT的同源基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RACE的方法擴(kuò)增拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列，該cDNA序列長(zhǎng)度為77!3bp， 其序列如SEQ ID NO. 1所示，其開(kāi)放閱讀框?yàn)樽?，端第87位至第617位堿基，共531bp，將此開(kāi)放閱讀框命名為CeFT基因，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有176個(gè)氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示，將該蛋白命名為CeFT蛋白。將建蘭的CeFT基因編碼的蛋白質(zhì)序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示CeFT 蛋白具有FT類蛋白的兩個(gè)保守基序即14個(gè)保守氨基酸序列(LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/1YN 三聯(lián)體，從第25到163個(gè)氨基酸中還含有一個(gè)保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，它與文心蘭OnFT的同源性為94%;與水稻Hd3a、擬南芥FT的氨基酸序列同源性分別為79%，74%，由此可見(jiàn)，CeFT 基因是一個(gè)新的開(kāi)花整合基因FT基因。本發(fā)明人將上述CeFT基因與植物表達(dá)載體連接，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有CeFT基因的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中，經(jīng)篩選培養(yǎng)獲得含有CeFT基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥花期提前，10個(gè)轉(zhuǎn)化株的平均開(kāi)花時(shí)間為22天，而野生型的平均開(kāi)花時(shí)間為31天。由此表明，外源CeFT基因?yàn)榫哂泄δ艿慕Y(jié)構(gòu)基因，其在宿主擬南芥中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)，它縮短了轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花時(shí)間。
從上述結(jié)果分析可以表明，本發(fā)明的CeFT基因是一個(gè)新的開(kāi)花整合基因，該基因能縮短開(kāi)花時(shí)間，從而影響植株的發(fā)育。因此可以將本發(fā)明的CeFT基因應(yīng)用到縮短植物童期，促進(jìn)植物開(kāi)花中。本發(fā)明的 CeFT基因與植物表達(dá)載體連接，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞、組織或器官，通過(guò)組織培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因的植物轉(zhuǎn)化體，從而實(shí)現(xiàn)縮短植物童期生長(zhǎng)期，促進(jìn)植物開(kāi)花。所述的植物表達(dá)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如PBI系列載體、pBin系列載體、Gateway 系列載體、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體等，上述載體均為公開(kāi)銷售的商品。本發(fā)明首次從建蘭中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該基因能夠影響植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，縮短了童期，并促使植物提前開(kāi)花。因此，本發(fā)明提供的建蘭 CeFT基因?yàn)榛蚬こ谈牧贾参锏纳L(zhǎng)進(jìn)程，對(duì)植物的花期進(jìn)行調(diào)控提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1是建蘭CeFT基因推導(dǎo)的氨基酸序列與文心蘭OnFT (EU583502)、水稻 Hd3a(BAB61028. 1)、擬南芥AtFT (BAA77838. 1)等同源基因的氨基酸序列比較圖(具有一致性和相似性的氨基酸分別用黑色和灰色陰影表示)；圖2是通過(guò)RT-PCR檢測(cè)在沒(méi)有發(fā)育花梗的成年建蘭植株的根、莖、葉和腋芽中的 CeFT基因表達(dá)量的電泳顯示圖，其中1為根；2為假鱗莖；3為葉；4為腋芽；圖3是通過(guò)RT-PCR檢測(cè)花梗長(zhǎng)度達(dá)IOcm的成年植株的根、莖、葉、腋芽、花梗和花蕾中的CeFT基因表達(dá)量的電泳顯示圖，其中1為根；2為假鱗莖；3為葉；4為腋芽；5為花梗；6為花蕾；圖4是表達(dá)載體pBI121-3k_CeFT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR鑒定圖，其中M為Marker 2000，1-3為篩選到的陽(yáng)性克隆編號(hào)、+為連接載體pBI121-35s-CeFT質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；-為空載體質(zhì)粒PBI121陰性對(duì)照。圖5是轉(zhuǎn)基因(CeFT)擬南芥的PCR鑒定圖，其中M為Marker 2000、1-14為CeFT 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系編號(hào)、+為連接載體pBI121-35S-CeFT質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；-為野生型擬南芥陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅以用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》、F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》 中所述條件，或按照所用產(chǎn)品生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明。實(shí)施例1 一、建蘭CeFT基因的克隆及其同源性分析。(1)以建蘭品種“金絲馬尾” (C. ensifolium ‘Jin Si Ma Wei，)的花芽為試驗(yàn)材料，植物材料在溫室正常條件下生長(zhǎng)(L/D，16h/8h ；25-28°C )。(2) RNA提取用Trizol reagent (購(gòu)自hvitrogen公司)進(jìn)行試驗(yàn)材料的總RNA提取，整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照Trizol試劑的RNA提取流程說(shuō)明。(3)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自ftOmgra公司)逆轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA第一鏈，方法按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。(4)基因的克隆以逆轉(zhuǎn)錄的建蘭花芽cDNA第一鏈為模板，利用引物FT-IF和 FT-IR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，測(cè)序，獲得2(^bp的核心片段。引物FT-IF:5' -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3 ‘FT-IR 5' -TCACTTGGACTTGGAGCAT-3‘采用Golden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說(shuō)明書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性％iin，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s,51°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸 5min。利用該2(^bp的核心片段，根據(jù)RACE方法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增3’端序列的引物FT3A和 FT3B,以及擴(kuò)增5，端序列的引物FT5A和FT5B，引物為FT3A 5' -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3‘FT3B 5' -TTCAGCAGTAGTGGAGCAG-3‘FT5A 5' GGCTGCTCCACTACTGCTGAAGGCT 3‘FT5B 5' CAAGTACATCACCAATCACTCGTCC 3‘3，端序列 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椴捎?Golden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說(shuō)明書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性3min，隨后30個(gè)循環(huán)反應(yīng) (94°C 30s，53°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸 5min。5，端序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椴捎肎olden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說(shuō)明書，其PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性lmin，接著5個(gè)循環(huán)反應(yīng) (94°C 30s,72°C ^iin)，再接著 5 個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 1.5min)，最后 30 個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 1. 5min)，72°C延伸 lOmin，4°C終止反應(yīng)。回收擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)5’端和3’端序列的擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，最后與核心片段拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示，該序列長(zhǎng)度為77!3bp，該序列的開(kāi)放閱讀框?yàn)镾EQ ID NO. 1的自5，端第87位至第617位堿基，共531bp，將該開(kāi)放閱讀框命名為CeFT 基因，該基因編碼由176個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，命名為CeFT蛋白，蛋白質(zhì)的pI/Mw分別為6. 42/19848. 3。將建蘭CeFT基因編碼的氨基酸(CeFT蛋白)序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示CeFT蛋白包含區(qū)分FT和TFLl蛋白的關(guān)鍵氨基酸殘基Tyr(Y)，以及140 位的另一個(gè)決定性氨基酸殘基Gln (Q)，另外還具有FT類蛋白的兩個(gè)保守基序即14個(gè)保守氨基酸序列(LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/IYN三聯(lián)體，還有一個(gè)保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，它與文心蘭OnFT的同源性最高，為94% ；與水稻Hd3a、擬南芥FT的氨基酸序列同源性分別為79%， 74%，具體比對(duì)見(jiàn)圖1。二、建蘭CeFT基因表達(dá)模式分析在建蘭未開(kāi)花期和開(kāi)花時(shí)期，用Trizol reagent (Invitrogen)分別提取建蘭植株的未開(kāi)花期的根、假鱗莖、葉和腋芽以及開(kāi)花期的根、假鱗莖、葉、腋芽、花梗和花蕾的總RNA,測(cè)定0D260后定量取出2 μ gRNA,然后再使用oligo-dT引物和PrimeScript Reverse Transcriptase (購(gòu)自Takara公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(方法參考說(shuō)明書)， 以擴(kuò)增 FT 核心片段的特異引物 FT-IF 5 ‘ -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3 ‘，F(xiàn)T-IR 5 ‘ -TCACTTGGACTTGGAGCAT-3 ‘進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該引物跨越內(nèi)含子。采用Go 1 den DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說(shuō)明書，其反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性 ^iin,隨后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s,54°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物以1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)果如圖2和3所示，其中對(duì)照為來(lái)自建蘭的ACTIN基因，擴(kuò)增該對(duì)照的ACTIN基因的引物為ACTPF:5' -CCTCTCAATCCCAAGGCAAACA-3‘ ,ACTPR 5' -GACCTCGGGGCACCTAAATCTC-3‘，采用 Golden DNA polymerase (TIANGEN)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，加樣體系參照酶的說(shuō)明書，其反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性％iin，隨后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94°C 30s,54°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸5min。從圖2和圖3中可以看出，CeFT基因在建蘭各器官中均有表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，CeFT表達(dá)水平較低，生殖生長(zhǎng)階段，表達(dá)水平較高。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期CeFT基因在腋芽的表達(dá)量最高(圖2、；生殖生長(zhǎng)期CeFT基因在花蕾的表達(dá)量最高， 在花梗、腋芽中的表達(dá)量次之，在根和葉中的表達(dá)量最低(圖3)。三、建蘭CeFT基因在擬南芥中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定。(1)含目的基因CeFT表達(dá)載體的構(gòu)建以前面逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用Takara公司的LA Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系按說(shuō)明書，擴(kuò)增引物為CeFT-F 5’ CCGTCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTCTTTG 3’CeFT-R 5’ CTTGAATTCTCAATCCTGCATCCTTCTTCCGCC 3’反應(yīng)程序?yàn)?4 °C 4min ； 94°C 30sec，60°C 45sec，72°C 2min, 35cycles ；72 °C 5min。將擴(kuò)增得到的CeFT基因回收后，與Takara公司的pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中。提取含有CeFT基因的T載體質(zhì)粒，利用酶切位點(diǎn))(ba I和EcoR I將CeFT基因從T載體上切下，與帶有3 啟動(dòng)子和nos終止子的植物表達(dá)載體PBI121同樣用)(ba I和 EcoR I酶切后連接，連接酶用T4 DNALigase (購(gòu)自Takara公司)，具體操作按說(shuō)明書方法進(jìn)行，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-3k-CeFT。(2)將重組表達(dá)載體pBI121-35s-CeFT采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌GV3101中。>從_701中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍，加入5μ 1重組表達(dá)載體 pBI121-;35s-CeFT，輕輕混勻，冰浴 30min。>將此混合物轉(zhuǎn)移置研缽中，液氮速凍lmin，迅速轉(zhuǎn)入37°C金屬浴中，將其融化， 約 2-3min。>向混合物中加入Iml LB,于搖床200rpm培養(yǎng)2_4h。所述的LB液體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。>將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB+Kan (卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的平板上，吹干，封口，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。>挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，如圖4所示，以質(zhì)粒pBI121-3k_CeFT為陽(yáng)性(+) 對(duì)照，以空載體質(zhì)粒PBI121為陰性(-)對(duì)照，1、2、3都是篩選到的含有目的基因(CeFT基因)的根瘤農(nóng)桿菌GV3101克隆陽(yáng)性克隆。(3)利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥>挑取一個(gè)陽(yáng)性克隆，接種于LB+Kan (卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的液體培養(yǎng)基中，28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)24-36h,使OD600 = 0 . 8左右。>將菌液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的50ml離心管中，5000rpm，15min離心收集菌種，再用同等體積的滲透培養(yǎng)基(1/2MS+0. 5g/L MES+5% Sucrose, pH5. 7)重懸農(nóng)桿菌，并加入表面活性劑 Silwet，使其終濃度達(dá)到0.02% ΟΟΟμΙ/L)。所述的MS培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考(Murashige T and Skoog F，1962)。>取剛開(kāi)花的擬南芥植株(花苞)于此溶液中浸泡lmin。斜置晾干多余的菌液。>將浸染菌液的擬南芥花序蓋膜保濕，黑暗培養(yǎng)8小時(shí)左右，再揭膜置于光照下正常管理成熟收獲種子。(4)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定。收集當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株種子(Ttl代)，滅菌(10% NaClO IOmin,滅菌水漂洗6次) 后播種于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選。將生長(zhǎng)10天左右的綠色抗性植株轉(zhuǎn)栽到盆缽里，基質(zhì)為泥炭土與蛭石比為3 1(體積比)。收集T1代種子。 將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)分離比，選取符合3 存活1死亡分離比的轉(zhuǎn)基因株系植株移栽至缽里進(jìn)行栽培，收集T2代種子，將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，種子在培養(yǎng)基上全部為綠苗，T2代種子為純合系。以質(zhì)粒pBI121-3k-CeFT為陽(yáng)性(+)對(duì)照，以擬南芥野生型葉片DNA為陰性(_)對(duì)照，用35S啟動(dòng)子序列及插入目的基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)單插入株系中目的基因的表達(dá)。引物序列如下35SFT-F 5 ‘ -TTGCGATAAAGGAAAGGC-3 ‘，35SFT-R 5' -ACGAAGACGAAGCGGTGT-3 ‘，鑒定結(jié)果如圖5所示，選取陽(yáng)性植株，由此而獲得轉(zhuǎn)入 pBI121-35s-CeFT表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥。(5)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。將轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株和野生型擬南芥同等條件下進(jìn)行培養(yǎng)，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥抽薹及開(kāi)花時(shí)蓮座葉僅有4片葉，轉(zhuǎn)基因植株都比野生型煙草提前開(kāi)花，同等培養(yǎng)條件下，野生型擬南芥需要31天開(kāi)花，而轉(zhuǎn)入CeFT基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥僅需要22天開(kāi)花。根據(jù)結(jié)果表明，外源CeFT基因在宿主擬南芥中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因提前開(kāi)花。試驗(yàn)結(jié)果表明，建蘭CeFT基因?yàn)橛泄δ艿幕?，可以影響植株的發(fā)育，具有促進(jìn)生殖生長(zhǎng)，從而縮短開(kāi)花時(shí)間的作用。由上述結(jié)果分析表明，本發(fā)明的CeFT基因是一個(gè)新的開(kāi)花整合基因FT基因，該基因能促進(jìn)植物的生殖生長(zhǎng)，縮短開(kāi)花時(shí)間，從而影響植株的發(fā)育。
權(quán)利要求
1.一種建蘭開(kāi)花整合基因-CeFT基因，其特征在于，所述的CeFT基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1中的第87位至617位堿基所示。
2.一種由權(quán)利要求1所述的建蘭開(kāi)花整合基因-CeFT基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于， 所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的CeFT基因的重組植物表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組植物表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組植物表達(dá)載體中的載體為PBI載體、pBin載體、Gateway 載體或pCAMBIA載體。
5.權(quán)利要求1所述的CeFT基因在縮短植物童期，促進(jìn)植物提前開(kāi)花中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種建蘭開(kāi)花整合基因CeFT及其應(yīng)用。CeFT基因的序列如SEQ ID NO.1中的第87位至第617位堿基所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明首次從建蘭中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該基因能夠影響植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，縮短了童期，并促使植物提前開(kāi)花。因此，本發(fā)明提供的建蘭CeFT基因?yàn)榛蚬こ谈牧贾参锏纳L(zhǎng)進(jìn)程，對(duì)植物的花期進(jìn)行調(diào)控提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102382843SQ20111036200
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者吳坤林, 張建霞, 曾宋君, 段俊, 黃瑋婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院華南植物園