專利名稱：一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種報告基因系統(tǒng)，尤其是涉及一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其為一種通過構(gòu)建雙模態(tài)成像報告基因系統(tǒng)，來非入侵式監(jiān)測內(nèi)源microRNA表達水平的方法。背景技術(shù)：
microRNA是一類長度在22個核苷酸(nt)左右的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)完全或不完全互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯。大量科學研究表明，microRNA在一系列的生物學過程如發(fā)育、增殖、代謝及凋亡等中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能?，F(xiàn)今監(jiān)測microRNA表達水平的傳統(tǒng)方法主要有Norhtern雜交、原位雜交、實時定量PCR或基因芯片等。然而這些監(jiān)測方法不僅耗費時間和人力，更為重要的是，它們在操作過程中要求固定或裂解細胞，導致細胞死亡，因而不能在活體狀態(tài)下研究microRNA的表達水平以及監(jiān)測其在生命活動中的調(diào)控作用。雖然目前也有報道活體研究microRNA表達的成像技術(shù)，但都是基于單一模態(tài)的成像技術(shù)，不能獲得完整清晰的活體的全部信息。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其提供了 microRNA表達調(diào)控相關(guān)研究的分子成像報告基因系統(tǒng)，為深入研究microRNA 在組織細胞內(nèi)的表達水平及其對生命活動的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于(1) 利用人鈉/碘共同轉(zhuǎn)運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用于核素成像的特性， 將hNIS基因克隆到質(zhì)粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS ；(2) 利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用于生物發(fā)光成像的特性，將Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA與靶標mRNA通過堿基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA_16 完全互補配對的三段串聯(lián)重復序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0在步驟(1)中，通過PCR擴增全長hNIS基因，然后克隆到pcDNA3. 1的HindIII和 EcoRI酶切位點之間，從而得到質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS。在步驟(2)中，通過PCR擴增全長Fluc基因，然后克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位點之間，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步驟(3)中，通過化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯(lián)重復序列，然后克隆到Fluc - hNIS融合基因的下游EcoRV和BioI之間，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
在步驟(1)中，PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1，使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物；將hNIS基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒 pcDNA3. 1-hNISο在步驟(2)中，PCR擴增全長Fluc基因，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. l_hNIS膠回收產(chǎn)物；將 Fluc基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產(chǎn)物與"Γ4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在 16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。在步驟(3)中，化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯(lián)重復序列，并且合成的重復序列兩端帶有EcoRV和BioI酶切位點，然后進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產(chǎn)物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. l-Fluc-hNIS 膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下
本發(fā)明的雙模態(tài)成像報告基因，能夠?qū)icroRNA的表達水平同時進行生物發(fā)光成像和核素PET成像兩種成像模態(tài)，打破了目前對microRNA成像只有單一模態(tài)的局限，這對于采用分子影像技術(shù)在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA的表達水平及闡述microRNA在生命活動中的調(diào)控機制和生物學功能具有非常重要的意義。四

圖1為雙模態(tài)成像報告基因結(jié)構(gòu)模式圖
圖2為報告基因Fluc體外螢光素酶測定和報告基因hNIS體外放射性碘攝取測定結(jié)果
圖
圖3為報告基因FH-3xmirl6TS在動物體內(nèi)的生物發(fā)光和核素PET雙模態(tài)成像結(jié)果圖五具體實施例方式
本發(fā)明為一種利用hNIS基因可用于核素成像和Fluc基因可用于生物發(fā)光成像的特性，將hNIS基因和Fluc基因克隆到pcDNA3. 1載體中進行融合表達，進而建立在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
(1)利用人鈉/碘共同轉(zhuǎn)運體基因(humansodium/iodide symporter, hNIS)能夠吸收放射性碘而作為報告基因用于核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質(zhì)粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS; (2)利用螢光蟲螢光素酶(firefly luciferase, Flue)可以作為報告基因用于生物發(fā)光成像的特性，將Fluc基因克隆到pcDNA3. 1-hNIS上， 使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3)利用microRNA與靶標mRNA通過堿基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA-16完全互補配對的三段串聯(lián)重復序列(總長約70bp)克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0實施例
1.質(zhì)粒PCDNA3. Ι-hNIS的克隆
PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用HindIII 和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1，使用HindIII和 EcoRI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物；將hNIS基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒 pcDNA3. 1-hNISο2.質(zhì)粒 pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS 的克隆
PCR擴增全長Fluc基因(不含終止密碼子)，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS， 使用NheI和HindIII進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1-hNIS膠回收產(chǎn)物；將 Fluc基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產(chǎn)物與"Γ4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在 16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。3.報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS_3xmirl6TS 的克隆
化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯(lián)重復序列(總長約70bp)，并且合成的重復序列兩端帶有EcoRV和BioI酶切位點，然后進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質(zhì)粒pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. Ι-Fluc-hNIS膠回收產(chǎn)物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS 膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH_3xmirl6TS)，參見圖 1。4.鑒定
4. 1報告基因Fluc體外螢光素酶測定(參見圖2A)
為了驗證報告基因Fluc的活性，在6孔板中培養(yǎng)人胃癌細胞系SGC 7901，之后將雙模態(tài)報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS (FH-3xmirl6TS)分別與 microRNA-16 (mir-16) RNA mimics及對照ctrl mimics共轉(zhuǎn)染到SGC 7901細胞中，或者只轉(zhuǎn)染 FH-3xmirl6TS質(zhì)粒和對照空載質(zhì)粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901細胞中，培養(yǎng) 48小時后，收集細胞，采用生物發(fā)光檢測儀測定細胞中的螢光素酶含量。結(jié)果參見圖2A，與對照組相比，不論是將FH-3xmirl6TS與mir_16共轉(zhuǎn)染，還是只轉(zhuǎn)染質(zhì)粒FH-3xmirl6TS，細胞中的螢光素酶活性都大大降低，分別約為對照組的16%和31%。4. 2報告基因hNIS體外放射性碘攝取測定(參見圖2B)
為了測定報告基因hNIS的活性，在6孔板中培養(yǎng)SGC 7901細胞，之后將FH-3xmirl6TS 分別與mir-16 RNA mimics及對照ctrl mimics共轉(zhuǎn)染到SGC 7901細胞中，或者只轉(zhuǎn)染 FH-3xmirl6TS質(zhì)粒和對照空載質(zhì)粒pcDNA3. l-Fluc-hNIS (FH)到SGC 7901細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)M小時后，吸棄培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗3次，然后每孔加入含NaiwI 74 Mq的Hanks 培養(yǎng)液1 ml，之后細胞繼續(xù)培養(yǎng)1小時后，收集細胞，使用g計數(shù)器計數(shù)測定各孔中的放射性碘含量。結(jié)果參見圖2B，與對照組相比，不論是將FH-3xmirl6TS與mir-16共轉(zhuǎn)染，還是只轉(zhuǎn)染質(zhì)粒FH-3xmirl6TS，細胞中的放射性碘攝取量都明顯降低，分別約為對照組的和 72%。
4. 3報告基因FH-3xmirl6TS在動物體內(nèi)的生物發(fā)光和核素PET雙模態(tài)成像(參見圖3)生物發(fā)光成像培養(yǎng)SGC 7901細胞，將報告基因FH-3xmirl6TS和對照質(zhì)粒ΠΙ分別轉(zhuǎn)染SGC 7901細胞，24小時后，采用G418抗生素進行篩選，篩選3周后，得到穩(wěn)定表達ΠΙ和FH-3xmirl6TS的SGC 7901細胞系，G418濃度為600 ug/ml。之后分別將FH禾口 FH-3xmirl6TS細胞收集、計數(shù)，調(diào)整濃度為IxlO7個細胞/ml，然后分別將這些細胞注入6 周大小的雌性BALB/c裸鼠(重量約20-25g)的左右兩腿皮下，左側(cè)為 轉(zhuǎn)染的細胞，右側(cè)為FH-3xmirl6TS轉(zhuǎn)染的細胞。M小時后，以洲異氟烷吸入麻醉小鼠，注射底物150 mg/kg 的 D-Iuciferin，采用生物發(fā)光成像系統(tǒng)(Xenogen IVIS Kinetic, Caliper, CA, USA)進行生物發(fā)光信號的獲取。結(jié)果參見圖3A，小鼠右側(cè)的生物發(fā)光信號比左側(cè)的信號要弱的多，表明報告基因FH-3xmirl6TS在體內(nèi)受到了內(nèi)源microRNA-16表達的抑制。
核素PET成像將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 ra和FH-3xmirl6TS的SGC 7901細胞系分別注入小鼠左右肩皮下，左側(cè)為FH-3Xmirl6TS轉(zhuǎn)染的細胞右側(cè)為Hl轉(zhuǎn)染的細胞，培養(yǎng)三周，使小鼠成瘤。之后通過小鼠尾靜脈注射18. 5 MBq 124I,采用2%異氟烷麻醉小鼠后，將小鼠放在microPET成像系統(tǒng)上進行不同位置的信號采集。結(jié)果參見圖3B，分別做了小鼠的水平面(horizontal )、冠狀面(coronal)和矢狀面(sagittal)成像，可以看到小鼠左側(cè)信號 (FH-3xmirl6TS轉(zhuǎn)染組)比右側(cè)信號(!7H轉(zhuǎn)染組)要弱的多，表明報告基因FH-3xmirl6TS在體內(nèi)受到了內(nèi)源microRNA-16表達的抑制。
權(quán)利要求
1.一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于 (1)利用人鈉/碘共同轉(zhuǎn)運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用于核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質(zhì)粒pcDNA3. 1多克隆位點上，從而得到質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS ； (2) 利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用于生物發(fā)光成像的特性，將Fluc基因克隆到 pcDNA3. Ι-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ； (3) 利用microRNA與靶標mRNA通過堿基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA_16 完全互補配對的三段串聯(lián)重復序列克隆到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
2.根據(jù)權(quán)利要求書所述的一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于在步驟(1)中，通過PCR擴增全長hNIS基因，然后克隆到pcDNA3. 1的 HindIII和EcoRI酶切位點之間，從而得到質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS。
3.根據(jù)權(quán)利要求書所述的一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于在步驟(2)中，通過PCR擴增全長Fluc基因，然后克隆到pcDNA3. 1-hNIS 的NheI和HindIII酶切位點之間，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS。
4.根據(jù)權(quán)利要求書所述的一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于在步驟(3)中，通過化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯(lián)重復序列，然后克隆到Fluc - hNIS融合基因的下游EcoRV和B10I之間，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TS0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于步驟(1)中，PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1，使用 HindIII和EcoRI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物；將hNIS基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. 1膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒 pcDNA3. 1-hNIS。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其特征在于步驟(2)中，PCR擴增全長Fluc基因，凝膠電泳及膠回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物使用 NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產(chǎn)物；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1-hNIS,使用 NheI和HindIII進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1-hNIS膠回收產(chǎn)物；將Fluc基因雙酶切產(chǎn)物和pcDNA3. Ι-hNIS膠回收產(chǎn)物與T4 DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的質(zhì)粒 pcDNA3. 1-Fluc-hNIS ；步驟(3)中，化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯(lián)重復序列，并且合成的重復序列兩端帶有EcoRV和B10I酶切位點，然后進行雙鏈的退火反應，得到退火的雙鏈序列；提取質(zhì)粒pcDNA3. 1-Fluc-hNIS,使用EcoRV和BioI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產(chǎn)物；將退火的雙鏈序列和pcDNA3. 1-Fluc-hNIS膠回收產(chǎn)物與jM DNA連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，然后挑單克隆，提質(zhì)粒，測序，從而得到正確的雙模態(tài)成像報告基因 pcDNA3. l-Fluc-hNIS-3xmirl6TSo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在體無創(chuàng)監(jiān)測microRNA表達的雙模態(tài)成像報告基因的方法，其提供了microRNA表達調(diào)控相關(guān)研究的分子成像報告基因系統(tǒng)，為深入研究microRNA在組織細胞內(nèi)的表達水平及其對生命活動的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為(1)利用人鈉／碘共同轉(zhuǎn)運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用于核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質(zhì)粒pcDNA3.1多克隆位點上，從而得到質(zhì)粒pcDNA3.1-hNIS;(2)利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用于生物發(fā)光成像的特性，將Fluc基因克隆到pcDNA3.1-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3.1-Fluc-hNIS；(3)利用microRNA與靶標mRNA通過堿基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA-16完全互補配對的三段串聯(lián)重復序列克隆到pcDNA3.1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態(tài)成像報告基因pcDNA3.1-Fluc-hNIS-3xmir16TS。
文檔編號C12N15/66GK102533834SQ201110334119
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者曹豐, 梁繼民, 王慎旭, 王福, 田捷 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學, 西安電子科技大學