專利名稱：一種紅海欖根際纖維素降解真菌新種Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種紅海欖根際纖維素降解真菌新種 Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36及其在生產纖維素酶和制備生物有機質降解菌肥中的應用。
背景技術：
紅樹林為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60 75%熱帶和亞熱帶海岸，對維護海灣河口的生態(tài)平衡起重要作用，是海洋生產力的重要組成部分(Holguin et al.，2001 ；龍寒等，200 ，被認為是具有較高生產力的生態(tài)系統(tǒng)之一。 該生態(tài)系統(tǒng)具有較高的有機質水平(全球每年凋落物為IOOTg C)，為毗連的沿岸水域和相關的生物群落生境提供有機物(Holguin et al.，2001 ；Lugomela and Bergman，2002)。由于紅樹林沉積物具有強還原性、強酸性、高含鹽量、營養(yǎng)豐富(Takeuchi M et al.，1998 ；林鵬，1997)等特征。因此，這里蘊涵了大量獨特的微生物、酶和基因資源。近年，紅樹林獨特的生態(tài)環(huán)境和豐富的物種多樣性引起了更多海洋科學工作者的關注。但紅樹林區(qū)的微生物學研究起步較晚，研究較為薄弱。目前，紅樹林區(qū)微生物學研究主要集中在紅樹林微生物區(qū)系研究；凋落物分解過程中的微生物學研究；紅樹林根際放線菌研究；紅樹林區(qū)微生物污染生態(tài)學研究(Yuan KP et al.，2005 ；Muniswaran A. et al. 1994)。隨著化石燃料的短缺，能源是人類面臨的重大問題。尋找和開發(fā)可再生能源和新能源關系到經濟的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。纖維素與石化燃料不同，它是一種可再生的資源。地球上每年光合作用可產生大約100億噸的植物干物質，其中一半以上是纖維素和半纖維素(Campbell BA et al.，1998)。另外，人類活動產生的廢棄物中也含有大量的纖維素物質，如農業(yè)廢棄物(稻草、稻殼、秸稈、花生殼、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等)、食品加工廢棄物(果皮、果渣等)、木材廢棄物(木屑、樹皮)以及城市廢棄物(40% 60%固體廢物是垃圾和廢紙)等。如果能有效地利用生物轉化技術將這些纖維素資源轉化成簡單糖，再發(fā)酵產生乙醇等能源物質，不僅可以變廢為寶，而且還可以避免由于化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境污染，同時可以緩解或解決石化能源短缺乃至枯竭所帶來世界性能源危機。由于微生物在纖維素利用方面的獨特優(yōu)勢，尋找新的纖維素利用菌種和開發(fā)高產纖維素酶菌種，是纖維素資源高效利用的關鍵。能夠利用和分解纖維素的物種不僅有真核微生物如綠色木霉(T. virid)、黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichogerma reesei)等主要產纖維素酶的真菌，其中木霉屬是研究最廣泛的纖維素酶產生菌，世界纖維素酶市場中20 %的纖維素酶來自木霉屬和曲霉屬，但近年來，新的纖維素降解菌株的研究報道也日漸增多(Mario CNS et al. ,2008 ；Revankar MS et al. ,2006) 另外，還有一些原生動物和細菌也能分解纖維素類物質，但由于細菌分泌的纖維素酶量少，而且產生的酶屬胞內酶或者吸附于細胞壁上，故工業(yè)上較少用細菌做纖維素酶的生產菌種。此外，有的動物如白蟻、小龍蝦等也能產生完全不同于其內共生微生物群落所產的纖維素酶。由于纖維素降解真菌在能源利用方面有著其重要的作用，為此很多科學工作者對這類真菌進行了大量的研究并取得了顯著的成果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種從中國海南省三亞市紅海欖植物根際沉積物中篩選出的，具有較高的纖維素降解活性的真菌新種炭團菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36, 該菌于2011年05月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號 CGMCC No :4872。本發(fā)明的紅海欖根際纖維素降解真菌新種炭團菌(Hypoxylon sp. )DPZ-SYz-36, 是從中國海南省三亞市紅海欖植物根際沉積物中篩選出的。其菌學特性描述如下菌種描述如圖1所示，菌株營養(yǎng)菌絲壁光滑，具分隔，分枝，寬1.5_3.6μπι。未見任何類型孢子。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長較快，25°C黑暗條件下14天菌落直徑 40-45mm,白色，絮狀，氣生菌絲茂盛；菌落背面中到暗褐色，無水溶性色素，對多種抗生素有明顯抗性。將該菌株接種到以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為主要碳源的平板上，在30°C培養(yǎng) 3天后，可形成直徑19mm的水解透明圈(圖1D)，表明該菌株具有較高的纖維素等生物質降解活性。常規(guī)方法從炭團菌(Hypoxylon sp. ) DPZ-SYz-36的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，運用rDNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4，通過PCR擴增和測序分析得到ITS 序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。運用β微管蛋白(β-tubulin)序列特定的引物Bth/ Bt2b，通過PCR擴增和測序分析得到β -tubulin序列，其序列如SEQ ID N0. 2所示。運用 28s rDNA序列特定的引物LR0R/LR7，通過PCR擴增和測序分析得到^s rDNA序列，其序列如SEQ ID N0. 3所示。通過GenBank中的BLAST軟件將ITS序列、β -tubulin序列和28s rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，在數據庫中沒有找到完全相似的序列，表明這3條基因序列為首次發(fā)現的新基因序列。在GenBank數據庫中選取了部分與測定序列相似性較高的代表性基因序列，通過ClustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構建系統(tǒng)進化樹(見圖2、3、4)， 進行系統(tǒng)發(fā)育分析。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出炭團菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36與已知的真菌具有較大的差異性。其rDNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)序列測序分析表明與其親緣關系較近的 Hypoxylonmonticulosum(FM209467. 1)序列相似性達到 99%，與 Hypoxylon sp. (DQ631939. 1)序列相似性達到98 % ；但其β微管蛋白(β -tubulin)序列除與 Hypoxylon monticulosum(AY951737. 1)具有97%的相似性外，與其他菌株的相似性都小于 90%。另外，與其^s rDNA序列親緣關系最近的一株內生真菌(EF420088. 1)序列相似性只有96%，它在進化樹中單獨形成一個分支。結合其形態(tài)學特征，我們將其歸入炭團菌屬 (Hypoxylon)，是一株炭團菌屬的新種，命名為炭團菌(Hypoxylon sp. ) DPZ-SYz-36 0對菌株Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36的纖維素酶活(CMC酶活)研究表明炭團菌 (Hypoxylon sp.) DPZ-SYz-36在30°C、pH 7. O條件下，液體發(fā)酵，發(fā)酵液的纖維素酶活在10 天左右達到121. 1U/L(圖5)。同時用含有Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36的菌液制劑進行紅海欖樹葉降解試驗。結果表明經過10天的降解處理紅海欖樹葉失重率達到68.9%，由此說明Hypoxylon sp. DPZ_SYz_36具有較好的纖維素等生物質降解活性。因此本發(fā)明的第二個目的是提供炭團菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36在產纖維素酶中的應用。本發(fā)明的第三個目的是提供炭團菌(Hypoxylon sp. )DPZ-SYz_36在制備生物有機質降解菌肥中的應用。本發(fā)明提供了一種紅海欖根際纖維素降解真菌新種炭團菌(Hypoxylon sp.) DPZ-Sk-36，該菌具有產纖維素酶活性，可用于生產纖維素酶，因此對纖維素酶的生產和利用具有重要的價值。進一步可以用于制作生物有機質降解菌肥。本發(fā)明的炭團菌(Hypoxylon sp. )DPZ-SYz-36于2011年05月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No :4872.


圖1是Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36菌落在麥芽汁培養(yǎng)基上生長情況(A)、光學顯微鏡照片(B和C)以及Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36菌落在CMC-剛果紅平板上脫色情況(D)；圖2是Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36在rDNA內轉錄間隔區(qū)(IT。無根系統(tǒng)發(fā)育樹中位置圖；圖3是Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36在β微管蛋白(β -tubulin)無根系統(tǒng)發(fā)育樹中位置圖；圖4是Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36在^s rDNA無根系統(tǒng)發(fā)育樹中位置圖；圖5是Hypoxylon sp. DPZ-SYz-36液體發(fā)酵纖維素酶活(CMC酶活)圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1 1、材料1. 1 土樣采集樣品與2010年9月采自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹林區(qū)紅海欖(Rhizophora stylosa)根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室4°C低溫保存。1. 2培養(yǎng)基1.2. 1初篩培養(yǎng)基每升初篩培養(yǎng)基的配制方法如下馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮，挖芽眼，洗凈，切片。稱200g放入IOOOml自來水中，用文火煮沸30min，雙層紗布過濾，濾液加水補至 1000ml) 800ml，蔗糖，20. Og ；NaCl, 1. 5g ；瓊脂，15g，土壤浸提液，200ml ； 121 °C 滅菌后等培養(yǎng)基冷卻至60°C加入過濾除菌的100 μ g/ml的氨芐青霉素和100 μ g/ml的硫酸鏈霉素各 Iml。1.2.2 復篩培養(yǎng)基(g/L)每升復篩培養(yǎng)基的配制方法如下=CMC-Na 10. Og ；蛋白胨0. 5g ；酵母提取物0. 5g ； 蔗糖 0. 5g ；KNO3 1. Og ；K2HPO4 0. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；NaCl 1. 5g ；瓊月旨 15g,水 IOOOmL0 121°C滅菌備用。
1.2.3保藏培養(yǎng)基每升保藏培養(yǎng)基的配制方法如下馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮，挖芽眼，洗凈，切片。稱200g放入IOOOml自來水中，用文火煮沸30min，雙層紗布過濾，濾液加水補至 1000ml) 1000ml，蔗糖，20. Og ；NaCI, 1. 5g ；瓊脂，15g。121°C滅菌備用。1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基每升發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法如下CMC_Na 5. Og ；蛋白胨1. Og ；酵母提取物1. Og ； 蔗糖 1. Og ；KNO3 1. Og ；K2HPO4 0. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；NaCl 1. 5g ；水 1000mL。121°C 滅菌備用。1. 2. 5紅海欖樹葉降解實驗培養(yǎng)基每升紅海欖樹葉降解實驗培養(yǎng)基的配制方法如下蛋白胨0.5g，酵母粉l.Og， 蔗糖 0. 5g，可溶性淀粉 0. 5g，紅海欖樹葉 3. 3g，NaCl 2. 0g, CaCO3 1. 0g, MgSO4 1. Og,水 IOOOmL0 121°C 滅菌備用。2、方法2. 1菌株的分離篩選從樣地選取三株紅海欖(lihizophora stylosa)，采集它們的根際沉積物樣品50g， 將三份樣品混勻后取約5g置于含50ml滅菌蒸餾水的三角瓶中37°C、150r/min震蕩搖勻 15min,靜置30sec后取Iml的液體梯度稀釋至10_3、10_4、10_5，接種量為0. 05mL,涂布于初篩培養(yǎng)基上，每一處理設8個重復。37°C培養(yǎng)3-5天，挑取形態(tài)典型的單一菌落進行點接純化2-3次得到純培養(yǎng)物。將得到純培養(yǎng)物接種到復篩培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)3天，在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質量濃度為lmg/mL的剛果紅溶液10 15min后，倒去剛果紅溶液，再加入濃度為lmol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此時，產生纖維素酶的菌落周圍將會出現透明圈。根據初步脫色效果辨別具有產纖維素酶的菌株，測量透明圈直徑和菌落直徑，篩選效果較好的菌株進行下一步研究。由此而獲得一株菌株純培養(yǎng)物，命名為 DPZ-SYz-36，將其保存于保藏培養(yǎng)基中。2. 2菌株形態(tài)學特征鑒定菌株的形態(tài)學特征及初步的鑒定依據《真菌鑒定手冊》。上一步驟篩選得到的菌株DPZ-SYz-36，其菌種形態(tài)學特征描述如下如圖1所示， 菌株營養(yǎng)菌絲壁光滑，具分隔，分枝，寬1.5-3. 6 μ m。未見任何類型孢子。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長較快，25°C黑暗條件下14天菌落直徑40-45mm，白色，絮狀，氣生菌絲茂盛；菌落背面中到暗褐色，無水溶性色素，對多種抗生素有明顯抗性。將該菌株接種到以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為主要碳源的平板上，在30°C培養(yǎng)3天后，可形成直徑19mm的水解透明圈 (圖1D)，表明該菌株具有較高的纖維素等生物質降解活性。2. 3菌株分子生物學鑒定對獲得的純培養(yǎng)物菌株DPZ-SYz-36使用上海生工公司基因組抽提試劑盒提取 DNA，然后用于目的基因的擴增。真菌ITS區(qū)部分序列的擴增采用通用引物ITS1/ITS4(T. J.White，T.Bruns，et al 1990)ITSl 5' —TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3‘，ITS4 5' —TCCTCCGCTTAT TGATATGC—3'。
β-微管蛋白(β-tubulin)序列的擴增采用通用引物Bt2a/ Bt2b (Glass&Donaldson, 1995)Bt2a 5' —GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC—3‘，Bt2b 5' —ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC—3‘；28s rDNA 序列的擴增采用通用引物 LR0R/LR7 (Vilgalys, R. &M. Hester. 1990.)LROR 5' -ACCCGCTGAACTTAAGC-3‘，LR7 5' -TACTACCACCAA GATCT-3'。PCR反應體系和反應條件如下PCR反應體系包括 PCR反應程序是
權利要求
1.一種炭團菌(Hypoxylon sp.)DPZ-Sk-36，其保藏編號為CGMCC No :4872。
2.權利要求1所述的炭團菌(Hypoxylonsp.)DPZ-SYz-36在產纖維素酶中的應用。
3.權利要求1所述的炭團菌(Hypoxylonsp.)DPZ-SYz-36在制備生物有機質降解菌肥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅海欖根際纖維素降解真菌新種Hypoxylon sp.DPZ-SYz-36及其應用。炭團菌(Hypoxylon sp.)DPZ-SYz-36于2011年05月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC No4872。該菌具有產纖維素酶活性，可用于生產纖維素酶，因此對纖維素酶的生產和利用具有重要的價值。進一步可以用于制作生物有機質降解菌肥。
文檔編號C12N9/42GK102337222SQ201110303628
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者凌娟, 張偲, 張燕英, 潘虎, 董俊德, 陳蕾, 龍麗娟 申請人:中國科學院南海海洋研究所