專(zhuān)利名稱(chēng)：制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制種玉米病害診斷技術(shù)和病原鑒定，尤其涉及制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法。
背景技術(shù)：
甘肅省以獨(dú)特的自然條件已成為全國(guó)玉米制種大省，隨玉米種質(zhì)資源的廣泛引進(jìn)，新的自交系和雜交種不斷問(wèn)世，危害玉米生產(chǎn)的新病害不斷涌現(xiàn)。病害的發(fā)生已成為制約著玉米的生產(chǎn)、造成產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降的關(guān)鍵。為此，根據(jù)地域特點(diǎn)，加強(qiáng)玉米新病害的研究尤為重要。近幾年來(lái)，發(fā)生在河西走廊制種玉米新病害——玉米裂軸病已成為玉米制種業(yè)的嚴(yán)重制約因素，而且還會(huì)嚴(yán)重威脅全國(guó)玉米的安全生產(chǎn)。玉米裂軸病[Nigrospora oryzae(Berk. et Br.)Petch.]是甘肅省自交系、雜交種玉米發(fā)現(xiàn)的新病害，目前對(duì)該玉米裂軸病的防治尚無(wú)良策，而對(duì)癥狀表現(xiàn)、病原菌鑒定等研究國(guó)內(nèi)尚處空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快捷、方便的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節(jié)期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現(xiàn)和病征表現(xiàn)，判定——當(dāng)玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發(fā)黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內(nèi)側(cè)有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時(shí)，即判定為果穗發(fā)霉；當(dāng)脫去玉米籽粒的穗軸發(fā)軟，剖開(kāi)所述穗軸后其內(nèi)側(cè)表面出現(xiàn)黑色霉?fàn)钗?，顯微鏡檢測(cè)為病菌菌絲體和分生孢子時(shí)，即判定為穗軸發(fā)霉；當(dāng)玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無(wú)光澤；或籽粒為糠粒，果穗開(kāi)裂時(shí)，即判定為籽料秕瘦；當(dāng)玉米果穗開(kāi)裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質(zhì)，顯微鏡檢測(cè)為黑色分生孢子時(shí)，即判定為籽料粉化；當(dāng)玉米葉片正反面可見(jiàn)黑色煤污狀的斑點(diǎn)，隨斑點(diǎn)擴(kuò)大，病斑邊緣出現(xiàn)黃色暈圈時(shí)，即判定為葉片污斑；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發(fā)分離將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段， 用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上皿蓋，在 20 25°C保溫保濕培養(yǎng)Mh，觀察有無(wú)菌體生長(zhǎng)若有菌絲出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當(dāng)分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無(wú)分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為 13. 4 17. 8 μ m 時(shí)，即判定為稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch.；若無(wú)菌體生長(zhǎng)，則采用下述方法進(jìn)行判定a、組織分離將新發(fā)病株或新收玉米種子在無(wú)菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質(zhì)量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無(wú)菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落；其中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是指每IOOOml培養(yǎng)基含200g馬鈴薯、20g瓊脂、20g 葡萄糖的培養(yǎng)基；b、病原菌的純化挑取所述步驟a所得的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接于瓊脂平板上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個(gè)分生孢子于斜面所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)上，獲得單孢培養(yǎng)物；C、致病性測(cè)定將所述步驟b所得的單孢培養(yǎng)物用無(wú)菌水清洗后，用無(wú)菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個(gè)分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中，在壓力為1.5磅士0.01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無(wú)菌麥粒；在無(wú)菌條件下，將孢子懸浮液接種于無(wú)菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 IOd后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項(xiàng)穴接所述麥粒接菌體4g ；同時(shí)，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對(duì)照，分不同生育期測(cè)定發(fā)病癥狀，若發(fā)病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌；d、病原菌種類(lèi)的鑒定依據(jù)培養(yǎng)性狀和顯微鏡檢測(cè)、致病性測(cè)定結(jié)果，即判定為稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。所述步驟中的無(wú)菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下滅菌 30分鐘的水。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明采用田間癥狀觀察，觀察時(shí)期和方式系統(tǒng)，識(shí)別關(guān)鍵性特征明顯，克服了以往采用一個(gè)生育期表現(xiàn)的特征診斷病害而造成誤診的現(xiàn)象，因此，田間癥狀診斷方法準(zhǔn)確、系統(tǒng)。2、由于本發(fā)明采用誘發(fā)保溫培養(yǎng)和組織分離技術(shù)，需要時(shí)間短，方法簡(jiǎn)單，易于操作，且能準(zhǔn)確的分離得到引起病害的病原菌，分離率較高，因此，病原菌診斷方法簡(jiǎn)單易操作、快速且準(zhǔn)確。3、由于本發(fā)明采用麥粒接種體接種，接種材料易獲得、易于消毒滅菌、消毒滅菌徹底，接種效率較高，因此為種子帶菌檢驗(yàn)、土壤帶檢驗(yàn)、病株殘?bào)w組織檢驗(yàn)提供了較好檢驗(yàn)方法。
具體實(shí)施方式
制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節(jié)期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現(xiàn)和病征表現(xiàn)，判定——當(dāng)玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發(fā)黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內(nèi)側(cè)有黑色粉末， 且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時(shí)，即判定為果穗發(fā)霉。當(dāng)脫去玉米籽粒的穗軸發(fā)軟，剖開(kāi)所述穗軸后其內(nèi)側(cè)表面出現(xiàn)黑色霉?fàn)钗?，顯微鏡檢測(cè)為病菌菌絲體和分生孢子時(shí)，即判定為穗軸發(fā)霉。當(dāng)玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無(wú)光澤；或籽粒為糠粒，果穗開(kāi)裂時(shí)，即判定為籽料秕瘦。當(dāng)玉米果穗開(kāi)裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質(zhì)，顯微鏡檢測(cè)為黑色分生孢子時(shí)，即判定為籽料粉化。當(dāng)玉米葉片正反面可見(jiàn)黑色煤污狀的斑點(diǎn)，隨斑點(diǎn)擴(kuò)大，病斑邊緣出現(xiàn)黃色暈圈時(shí)，即判定為葉片污斑。(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發(fā)分離將步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上皿蓋，在20 25°C保溫保濕培養(yǎng)Mh，觀察有無(wú)菌體生長(zhǎng)若有菌絲出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當(dāng)分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無(wú)分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m，頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為 13. 4 17. 8μπι 時(shí)，即判定為稻黑孢菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br.)Petch·。若無(wú)菌體生長(zhǎng)，則采用下述方法進(jìn)行判定a、組織分離將新發(fā)病株或新收玉米種子在無(wú)菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質(zhì)量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無(wú)菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落。其中無(wú)菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下的高壓滅菌鍋中滅菌30分鐘的水。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)是指每IOOOml培養(yǎng)基含200g馬鈴薯、20g 瓊脂、20g葡萄糖的培養(yǎng)基。b、病原菌的純化挑取步驟a所得的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接于瓊脂平板上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個(gè)分生孢子于斜面馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基) 上，獲得單孢培養(yǎng)物。C、致病性測(cè)定將所述步驟b所得的單孢培養(yǎng)物用無(wú)菌水清洗后，用無(wú)菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個(gè)分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中，在壓力為1.5磅士0.01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無(wú)菌麥粒；在無(wú)菌條件下，將孢子懸浮液接種于無(wú)菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 IOd后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項(xiàng)穴接所述麥粒接菌體4g;同時(shí)，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對(duì)照，分不同生育期測(cè)定發(fā)病癥狀，若發(fā)病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌。 d、病原菌種類(lèi)的鑒定依據(jù)培養(yǎng)性狀和顯微鏡檢測(cè)、致病性測(cè)定結(jié)果，即判定為稻漂抱菌 Nigrospora oryzae (Berk, et Br. )Petch。
權(quán)利要求
1.制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節(jié)期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現(xiàn)和病征表現(xiàn)，判定——當(dāng)玉米苞葉葉尖枯死，苞葉發(fā)黃枯死，在果穗和貼近果穗的苞葉內(nèi)側(cè)有黑色粉末，且果穗籽粒上或者籽粒行間有白色絲狀物——即病菌的菌絲體時(shí)，即判定為果穗發(fā)霉；當(dāng)脫去玉米籽粒的穗軸發(fā)軟，剖開(kāi)所述穗軸后其內(nèi)側(cè)表面出現(xiàn)黑色霉?fàn)钗?，顯微鏡檢測(cè)為病菌菌絲體和分生孢子時(shí)，即判定為穗軸發(fā)霉；當(dāng)玉米果穗上形成籽料為20 80粒，且種子表皮皺縮，籽粒無(wú)光澤；或籽粒為糠粒，果穗開(kāi)裂時(shí)，即判定為籽料秕瘦；當(dāng)玉米果穗開(kāi)裂的籽粒及其籽粒行間有粉末狀物質(zhì)，顯微鏡檢測(cè)為黑色分生孢子時(shí)， 即判定為籽料粉化；當(dāng)玉米葉片正反面可見(jiàn)黑色煤污狀的斑點(diǎn)，隨斑點(diǎn)擴(kuò)大，病斑邊緣出現(xiàn)黃色暈圈時(shí)，即判定為葉片污斑；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定保濕誘發(fā)分離將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒，剪成30 50mm的小段，用清水沖冼干凈，置于鋪有2 3層吸水濾紙或脫脂棉的120mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上皿蓋，在20 25°C保溫保濕培養(yǎng)Mh，觀察有無(wú)菌體生長(zhǎng)若有菌絲出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，顯微鏡檢判斷是否氣生菌絲分枝且有隔當(dāng)分生孢子梗與菌絲分化不明顯，孢梗短，無(wú)分枝，單生，具隔，頂端略膨大，孢梗粗4. 1 7. 9 μ m， 頂生分生孢子，圓形或近圓形，初黃褐色，后深褐色，呈黑色包，分生孢子大小為13. 4 17. 8μπι時(shí)，即判定為稻黑孢菌；若無(wú)菌體生長(zhǎng)，則采用下述方法進(jìn)行判定a、組織分離將新發(fā)病株或新收玉米種子在無(wú)菌條件下，先用體積濃度為75%的酒精溶液消毒60min士aiiin，然后在質(zhì)量濃度為0. 的升汞溶液中消毒20 30s，其次用無(wú)菌水沖洗3遍，最后均勻擺放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，每皿10粒，25°C 士2°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7d后觀察——呈絮狀，初期灰綠色，后期暗綠色至黑色，即得到菌落；其中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是指每IOOOml培養(yǎng)基含200g馬鈴薯、20g瓊脂、20g葡萄糖的培養(yǎng)基；b、病原菌的純化挑取所述步驟a所得的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接于瓊脂平板上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后，在顯微鏡下挑取單個(gè)分生孢子于斜面所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，獲得單孢培養(yǎng)物；c、致病性測(cè)定將所述步驟b所得的單孢培養(yǎng)物用無(wú)菌水清洗后，用無(wú)菌水配制成濃度為1. 5 X IO6 2. OX IO6個(gè)分生孢子/ml的孢子懸浮液；然后將冼凈麥粒放入三角瓶中， 在壓力為1. 5磅士0. 01磅、溫度為120 121°C條件下滅菌30min士aiiin，制成無(wú)菌麥粒；在無(wú)菌條件下，將孢子懸浮液接種于無(wú)菌麥粒上，放入25°C 士2°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 IOd 后得到麥粒接菌體；在田間每穴播不同玉米種子2粒，20穴，每項(xiàng)穴接所述麥粒接菌體4g ； 同時(shí)，用同樣方法在消毒土中盆栽10株，接4g所述麥粒接菌體，以不接菌的土壤處理為對(duì)照，分不同生育期測(cè)定發(fā)病癥狀，若發(fā)病特征與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征一致，判定為該菌是引起病害的病原菌；若引起癥狀與制種玉米裂軸病的癥狀診斷步驟中描述的各生育期表現(xiàn)特征不一致，判定為該菌不是引起病害的病原菌； d、病原菌種類(lèi)的鑒定依據(jù)培養(yǎng)性狀和顯微鏡檢測(cè)、致病性測(cè)定結(jié)果，即判定為稻黑孢菌。
2.如權(quán)利要求1所述的制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，其特征在于所述步驟 (2) c中的無(wú)菌水是指蒸餾水在壓力為1. 5磅、溫度為120°C條件下滅菌30分鐘的水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制種玉米裂軸病診斷與病原鑒定方法，該方法包括以下步驟(1)制種玉米裂軸病的癥狀診斷分別在制種玉米田苗期——拔節(jié)期、抽雄期、穗期、收獲期、貯藏期觀察葉片、果穗、種子的部位癥狀表現(xiàn)和病征表現(xiàn)來(lái)進(jìn)行判定；(2)制種玉米裂軸病的病原鑒定將所述步驟(1)診斷后的新鮮病葉、病粒采用保濕誘發(fā)分離的方式來(lái)進(jìn)行判定。本發(fā)明簡(jiǎn)單易操作、快速且準(zhǔn)確，克服了以往采用一個(gè)生育期表現(xiàn)的特征診斷病害而造成誤診的現(xiàn)象。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102321727SQ20111028941
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月24日
發(fā)明者閆治斌, 雷玉明 申請(qǐng)人:甘肅省敦煌種業(yè)股份有限公司玉門(mén)市種子公司