專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地講，是在纖維二糖和木糖為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)油微生物細(xì)胞內(nèi)積累超過(guò)細(xì)胞干重20%以上的油脂。該油脂含有一種或多種長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物，可用于制備生物柴油或其他高附加值產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
某些酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類(lèi)等在一定條件下，能夠以碳水化合物、碳?xì)浠衔锏葹樘荚矗隗w內(nèi)合成并貯存大量油脂，凡是可以在胞內(nèi)油脂積累超過(guò)細(xì)胞干重20%的微生物稱(chēng)為產(chǎn)油微生物(Ratledge C,ffynn JP. Adv Appl Microbiol, 2002, 51 :1 52)。某些產(chǎn)油微生物的甚至可以積累超過(guò)其細(xì)胞干重的70%的微生物油脂。微生物油脂，尤其是酵母產(chǎn)生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸組成與商品化的動(dòng)植物油脂相似，以C14-C22長(zhǎng)鏈脂肪酸為主。相對(duì)于動(dòng)植物油脂，微生物油脂生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)與氣候限制，原料來(lái)源廣，基本不占用額外耕地資源，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，被認(rèn)為是很有潛力的新型油脂資源。因此，微生物油脂不僅可能作為食用油或其他功能性油脂的替代品，還可能在可再生液體燃料生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮重要作用(趙宗保.中國(guó)生物工程雜志，2005，25 (2) :811)。
當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖和木糖時(shí)，絕大部分微生物優(yōu)先利用葡萄糖；只有當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)才開(kāi)始利用木糖，稱(chēng)為葡萄糖效應(yīng)(Dien BS, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2003,63 258 266)。葡萄糖效應(yīng)的直接結(jié)果就是微生物培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)油微生物斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi (孔祥莉,等.生物加工過(guò)程，2007, 5 (2) :3641)、發(fā)酵性絲抱酵母 Trichosporon fermentans (Huang C, etal. Bioresour Technol, 2009,100 (19) :4535 4538)等在利用葡萄糖和木糖的混合物時(shí),優(yōu)先利用葡萄糖。當(dāng)產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)基存在葡萄糖和其他碳源時(shí)，菌體出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)、效率降低、生產(chǎn)成本提高。
木質(zhì)纖維素材料來(lái)源廣泛、資源總量豐富，其化學(xué)成份主要是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素完全水解主要產(chǎn)物為葡萄糖；半纖維素水解可得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、 半乳糖、甘露糖等的混合物。利用木質(zhì)纖維素水解液培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使規(guī)?；苽湮⑸镉椭脑牧系玫奖Ｕ?。然而，當(dāng)前木質(zhì)纖維素的水解技術(shù)得到以葡萄糖和木糖等單糖為主要成分的水解產(chǎn)物。由于微生物，包括產(chǎn)油微生物，普遍存在葡萄糖效應(yīng)，利用木質(zhì)纖維素水解液培養(yǎng)微生物存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、效率低、成本高的共性技術(shù)問(wèn)題。
關(guān)于規(guī)避微生物培養(yǎng)的葡萄糖效應(yīng)，已有文獻(xiàn)報(bào)道。在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中將葡萄糖濃度控制在較低水平，并采用合適的稀釋速率可實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖同步利用(Kastner J，et al. J Ind Microbiol Biot, 1998, 20 (6) :339343)。利用葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶突變株， 也可解除葡萄糖抑制，實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖同步利用(Nichols NN, et al. Appl Microbiol Biotechnol,2001,56 :120 125)。以上方法通過(guò)改變過(guò)程操作條件或改造菌株遺傳特性，達(dá)到了葡萄糖和木糖得被同步利用的目的；但是，這些方法不具備普遍實(shí)用性。
為了充分利用木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素資源，并顯著改善利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性，必須尋找其他方法規(guī)避葡萄糖效應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道， 細(xì)胞膜上表達(dá)β -葡萄糖苷酶的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因工程菌株,可以同時(shí)利用纖維二糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇(Nakamura N, et al. Enzyme Microb Technol, 2008,43:233 236)。另外，通過(guò)表達(dá)纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和內(nèi)源β -葡萄糖苷酶的方式獲得的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae工程菌株，也可利用纖維二糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇 (Ha S-J，et al. PNAS，2011，108(2) :504 509)。
纖維二糖由兩分子葡萄糖通過(guò)β_1，4-糖苷鍵連接形成的二糖，也可以認(rèn)為是纖維素的基本重復(fù)結(jié)構(gòu)單位。纖維二糖經(jīng)酸催化或β_葡萄糖苷酶催化水解得到葡萄糖。通過(guò)控制水解條件，如降低催化劑的濃度或活性，可以使木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含有大量纖維二糖，而葡萄糖含量較低。因此，可以水解木質(zhì)纖維素原料獲取以纖維二糖和木糖為主要成分的水解產(chǎn)物。篩選高效利用纖維二糖的產(chǎn)油微生物，具有重要應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容
規(guī)避產(chǎn)油微生物的葡萄糖效應(yīng)可顯著促進(jìn)碳源有效利用，縮短發(fā)酵周期，改善微生物油脂的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。因此，發(fā)明人對(duì)產(chǎn)油微生物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)油微生物能夠有效利用纖維二糖作為碳源生長(zhǎng)并積累油脂。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)可利用纖維二糖和木糖的混合糖培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，并且在培養(yǎng)過(guò)程中混合糖消耗速度快，所得到的菌體富含油脂?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出一種產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)新方法，其特點(diǎn)在于培養(yǎng)基的碳源中纖維二糖的質(zhì)量含量為20% -90%，并且木糖的質(zhì)量含量為5^-75 ^該方法使產(chǎn)油微生物培養(yǎng)更高效地利用木質(zhì)纖維素來(lái)源的原料，提高微生 物油脂生產(chǎn)的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性，具有廣闊應(yīng)用前景。 該方法獲得的微生物油脂含有一種或多種脂肪酸及其衍生物，可用于制備生物柴油或其他聞附加值廣品。
本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
1、制備產(chǎn)油培養(yǎng)基。通過(guò)下述方法的一種或它們的必要組合方法獲得培養(yǎng)基
A.將碳源物質(zhì)纖維二糖、木糖和其他微生物培養(yǎng)常見(jiàn)的碳源物質(zhì)，葡萄糖、蔗糖、 阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖或甘油制成水溶液，其中纖維二糖和木糖分別占總碳源物質(zhì)的20% -90%和5% -75%，其他碳源物質(zhì)占總碳源物質(zhì)的0% -20%，添加其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源、磷源、硫源、無(wú)機(jī)鹽、維生素或它們的組合，調(diào)整PH 4. 0-8.0，滅菌后備用；
B.將木質(zhì)纖維素原料水解，得到主要成分為纖維二糖和木糖的水解液，其中纖維二糖和木糖分別占總碳源物質(zhì)的20% -90%和5% _75%，添加其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源、磷源、硫源、無(wú)機(jī)鹽、維生素或它們的組合，調(diào)整PH 4. 0-8.0，滅菌后備用；
C.將木質(zhì)纖維素原料水解，所得水解液添加適量纖維二糖或木糖，制成水溶液，其中纖維二糖和木糖分別占總碳源物質(zhì)的20% -90%和5% _75%，添加其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源、磷源、硫源、無(wú)機(jī)鹽、維生素或它們的組合，調(diào)整PH 4. 0-8.0，滅菌后備用；
2、木質(zhì)纖維素水解液的制備。為了獲得以纖維二糖和木糖為主要成分的木質(zhì)纖維素水解液，本發(fā)明采用文獻(xiàn)方案通過(guò)部分去除商品纖維素酶制劑中β-葡萄糖苷酶活性 (Homma T et al. Biotechnol Bioeng, 1993,41 :405 410)、或水解過(guò)程中使用 β-葡萄糖苷酶抑制劑(Kim Μ, Day D F. ApplBiochem Biotechnol, 2010,162 :1379 1390)、或通過(guò)纖維素酶回收復(fù)用的方法(夏黎明，岑沛霖.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33 (4) :381 385)，或通過(guò)不添加 β _葡萄糖苷酶組分的酶混合物(Zhou et al. Bioresour Technol,2009,100 819 825), 水解木質(zhì)纖維素原料，使水解中間產(chǎn)物纖維二糖進(jìn)一步降解為葡萄糖的速度顯著降低，水解液中纖維二糖相對(duì)含量高，用于制備產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基。
3、產(chǎn)油微生物培養(yǎng)。向步驟I所述培養(yǎng)基中接種產(chǎn)油微生物種子液(每毫升含 IO5 IO8個(gè)活細(xì)胞)，接種量2% -20% (v/v)，在20°C _37°C下通空氣培養(yǎng)，至發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L，終止發(fā)酵，收集菌體。
4、生物量和油脂量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)(Li YH, et al. Enzyme Microb Technol, 2007,41 312 317)的方法，發(fā)酵液經(jīng)離心、洗滌，收集菌體沉淀。菌體在105°C干燥至恒重， 即得干菌體。參照文獻(xiàn)(李植峰，等.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28 ￠) 72 75)使用酸熱-有機(jī)溶劑法抽提獲得油脂，計(jì)算菌體油脂含量。
5、生物柴油的制備。參照文獻(xiàn)(Liu B, Zhao Z B. J Chem Technol Biotechnol, 2007，82 (8) :775 780)的方法，直接利用產(chǎn)油微生物菌體為原料，在酸催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油；或參照文獻(xiàn)(里偉，等.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2007，7 (I) :137 140)的方法，利用提取的微生物油脂，在酶催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油。
本發(fā)明所述的微生物油脂主要為長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物的甘油酯，經(jīng)轉(zhuǎn)酯化后， 可制成生物柴油。微生物油脂含有的不飽和脂肪酸還可用于制備其他高附加值產(chǎn)品。
本發(fā)明所述的其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源、磷源、硫源和維生素， 為微生物培養(yǎng)過(guò)程普遍使用的物質(zhì)，如酵母粉、蛋白胨、銨鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硫胺素等或它們的組合，其中氮源質(zhì)量為碳源總質(zhì)量的O.1 % -25 %、磷源質(zhì)量為碳源總質(zhì)量的0.01% -25%、硫源質(zhì)量為碳源總質(zhì)量的O. 01% -10%。
本發(fā)明所述的木質(zhì)纖維素原料為含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物質(zhì)材料， 如玉米稻桿、麥桿、稻草、林業(yè)生產(chǎn)下腳料、松木、云杉中的一種或二種以上組合。
本發(fā)明所述產(chǎn)油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過(guò)細(xì)胞干重20%的真核微生物，它們包括但不限于，油脂酵母，如斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi ;紅酵母，如圓紅冬抱酵母 Rhodosporidium toruloides、粘紅酵母 Rhodotorula glutinis 和擲抱酵母Sporobolomyces roseus ;絲抱酵母，如皮狀絲抱酵母Trichosporon cutaneum和發(fā)酵性絲抱酵母Trichosporon fermentans ;隱球酵母，如白色隱球酵母Cryptococcus albidus和彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌，如伯頓擬內(nèi)抱霉Endomycopsis burtoni1、健強(qiáng)地霉 Geotrichum robustum、深黃被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉Mucor circinelloides ;產(chǎn)油微藻，如布朗葡萄藻Botryococcus brauni1、寇氏隱甲藻 Crypthecodinium cohni1、原殼小球藻 Chlorella protothecoides 和裂殖壺菌 Schizochytrium limacinum。這些菌株可以直接從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 (CGMCC)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、或澳大利亞CSIRO微藻研究中心等菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買(mǎi)或從自然界中分離，也可以使用與原來(lái)菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。
本發(fā)明的有益效果是
I)本發(fā)明以纖維二糖和木糖為主要碳源，為培養(yǎng)產(chǎn)油微生物并制備微生物油脂提供了一種新方法；
2)木質(zhì)纖維素原料含有纖維素和半纖維素，通常水解后得到以葡萄糖和木糖為主的水解產(chǎn)物；然而，利用葡萄糖和木糖混合物培養(yǎng)微生物，通常出現(xiàn)葡萄糖效應(yīng)，即微生物先利用葡萄糖，再利用木糖，結(jié)果造成發(fā)酵周期長(zhǎng)，效率低。本發(fā)明將木質(zhì)纖維素原料水解為以纖維二糖和木糖為主的水解產(chǎn)物，用于培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，培養(yǎng)過(guò)程規(guī)避了葡萄糖效應(yīng)， 發(fā)酵周期縮短，糖利用效率和生產(chǎn)強(qiáng)度提高，成本降低，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益；
3)在木質(zhì)纖維素原料水解所用的酶制劑中通常需要使用活性較高的β -葡萄糖苷酶，以使纖維素酶水解中間產(chǎn)物纖維二糖完全水解得到葡萄糖。由于本發(fā)明采用以纖維二糖和木糖為主要碳源的產(chǎn)油微生物培養(yǎng)技術(shù)，水解產(chǎn)物中纖維二糖含量較高。因此，可在制備木質(zhì)纖維素原料水解的酶制劑時(shí)不使用或減量使用β_葡萄糖苷酶。所以，應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素原料，可降低原料處理過(guò)程酶用量，降低成本，具有明顯的綜合技術(shù)優(yōu)勢(shì)；
4)與充分水解木質(zhì)纖維素原料得到以葡萄糖和木糖為主的水解產(chǎn)物，再用于培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明總體上具有發(fā)酵時(shí)間短、原料利用效率高、成本低的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可更有效地將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為微生物油脂，用于制備生物柴油及其他高附加值產(chǎn)品。因此，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為對(duì)比例I中底物消耗、生物量和油脂量曲線。
圖2為實(shí)施例1中底物消耗、生物量和油脂量曲線。具體實(shí)施例
對(duì)比例I
I)將葡萄糖和木糖配制成混合糖溶液，葡萄糖47g/L，木糖23g/L，添加O. 5g/L酵母粉，1. Og/L硫酸銨，1. Og/L七水硫酸鎂，1. Og/L磷酸氫二鉀，余量為水，pH 5. 8，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中接入斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)，30°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)40h，得種子液(每毫升含107個(gè)活細(xì)胞);
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量10% (v/v)，在30°C下通氣培養(yǎng)14 4h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余的葡萄糖和木糖濃度分別為0g/L和2. 5g/L，發(fā)酵過(guò)程中首先觀察到葡萄糖濃度下降，當(dāng)葡萄糖濃度很低時(shí)木糖濃度開(kāi)始下降；固液分離收集菌體，得干菌體23. 6g/L，油脂量12. 6g/L。
實(shí)施例1
I)將纖維二糖和木糖配制成混合糖溶液，纖維二糖47g/L，木糖23g/L，添加0. 5g/ L酵母粉，1. 0g/L硫酸銨，1. 0g/L七水硫酸鎂，1. 0g/L磷酸氫二鉀，余量為水，pH 5. 8，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560在YEPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖 20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)40h，得種子液；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液(每毫升含 IO7個(gè)活細(xì)胞)，接種量10% (v/v)，在30°C下通氣培養(yǎng)108h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖和木糖濃度分別為O. 5g/L和Og/L，發(fā)酵過(guò)程中，纖維二糖和木糖濃度同時(shí)下降；固液分離收集菌體，得干菌體26. 7g/L，油脂量 13. 2g/L。
通過(guò)比較對(duì)比例I和實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，在總糖濃度以及發(fā)酵條件相同情況下，實(shí)施例1到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)所需時(shí)間為108h，是對(duì)比例I發(fā)酵時(shí)間的76%，發(fā)酵時(shí)間明顯縮短。實(shí)施例1發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)菨舛葹镺. 5g/L，比對(duì)比例I濃度更低，表明在纖維二糖和木糖共發(fā)酵條件下，總糖消耗速率提高；同時(shí)，與對(duì)比例I比較，實(shí)施例1獲得的油脂量更高， 提高了 4. 8%，實(shí)施例1獲得的非油生物量是對(duì)比例I的1. 23倍，而非油生物體適合作為飼料。因此，采用實(shí)施例1的方案培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的生產(chǎn)效率和原料利用效率提高，成本降低。
實(shí)施例2
I)將纖維二糖和木糖配制成混合糖溶液,纖維二糖35g/L,木糖35g/L,添加O. 5g/ L酵母粉，O. 5g/L硫酸銨，1. Og/L七水硫酸鎂，7. Og/L磷酸二氫鉀，2. 0g/L磷酸氫二鈉，余量為水，pH 5. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)擲抱酵母Sporobolomyces roseus IAM 13481 (購(gòu)自日本JCM菌株保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，硫酸銨5g/L，酵母粉O. 5g/L，磷酸二氫鉀lg/L，七水硫酸鎂O. 5g/L)中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得種子液(每毫升含5 X IO6個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量15% (v/v)，在30°C下通氣培養(yǎng)103h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖和木糖濃度分別為3. 8g/L和1. lg/L ;固液分離收集菌體，得干菌體22. 9g/L，油脂量9. 8g/L。
實(shí)施例3
I)將纖維二糖和木糖配制成混合糖溶液，纖維二糖23g/L，木糖47g/L，添加1. Og/ L酵母粉，2. Og/L硫酸銨，O. 5g/L七水硫酸鎂，2. Og/L磷酸氫二鉀，余量為水，pH 4. 0，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)健強(qiáng)地霉Geotrichum robustum CICC 1256 (購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)28h,得種子液(每暈升含8 X IO5個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量5% (v/v)，在28°C下通氣培養(yǎng)120h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖和木糖濃度分別為O. 5g/L和2. 3g/L ;固液分離收集菌體，得干菌體21. 7g/L,油脂量8. 4g/L。
實(shí)施例4
I)將纖維二糖、木糖、葡萄糖和果糖配制成混合糖溶液，纖維二糖25g/L，木糖35g/L,葡萄糖5g/L,果糖5g/L,添加1. Og/L酵母粉,0. lg/L氯化銨，1. Og/L氯化鎂,0. lg/ L硫酸鈉，11. 8g/L磷酸二氫鉀，3. 7g/L磷酸氫二鈉，余量為水，pH 6. O，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)皮狀絲抱酵母Trichosporon cutaneum AS 2. 571 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)在YEH)液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，32°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)20h ；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量15% (v/v)，在32°C下通氣培養(yǎng)112h，得種子液；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖和木糖的濃度分別為3. 8g/L和O. 5g/L ； 固液分離收集菌體，得干菌體19. lg/L，油脂量8. 4g/L。
實(shí)施例5
I)將纖維二糖、木糖和蔗糖配制成混合糖溶液，纖維二糖40g/L，木糖25g/L，蔗糖 5g/L，甘油3g/L，添加O. 5g/L酵母粉，1. Og/L硫酸銨，1. Og/L七水硫酸鎂，2. 7g/L磷酸二氫鉀，O. 9g/L磷酸氫二鈉，余量為水，pH 5. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)白色隱球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298 (購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，20°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)28h,得種子液(每暈升含8 X IO7個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量12% (v/v)，在20°C下通氣培養(yǎng)144h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和蔗糖的濃度分別為O. 7g/L，1.5g/L和O. 4g/L ;固液分離收集菌體，得干菌體21. 9g/L，油脂量11. Og/L。
實(shí)施例6
I)將纖維二糖、木糖和乳糖配制成混合糖溶液，纖維二糖10g/L，木糖10g/L，乳糖 2g/L，添加2. Og/L酵母粉，O. lg/L硫酸銨，1. 5g/L七水硫酸鎂，1. Og/L磷酸氫二鉀，余量為水，pH 6. 5所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)圓紅冬抱酵母Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中， 37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得種子液(每毫升含4X IO7個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量20% (v/v)，在37°C下通氣培養(yǎng)48h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖為2. lg/L ;固液分離收集菌體，得干菌體 5. 7g/L，油脂量 1.5g/L。
實(shí)施例7
I)將纖維二糖、木糖、乳糖和半乳糖配制成混合糖溶液，纖維二糖30g/L，木糖 10g/L,乳糖2g/L,半乳糖2g/L,添加2g/L酵母粉，2g/L朽1檬酸鈉，2g/L磷酸氫二鉀,0. 5g/L 硫酸鎂，余量為水，PH 6. O所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)深黃被孢霉Mortierella isabellina AS 3. 3410 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖80g/L，尿素3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫二鉀Ig/ L)中，25°C，200rpm振蕩培養(yǎng)36h，得種子液(每毫升含8 X IO6個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量5% (v/v)，在25°C下通氣培養(yǎng)72h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖、乳糖和半乳糖濃度分別為1.1g/ L，0. 5g/L，0. 5g/L和O. lg/L ;固液分離收集菌體，得干菌體10. 7g/L，油脂量3. 8g/L。
實(shí)施例8
I)將纖維二糖、木糖和阿拉伯糖配制成混合糖溶液，纖·維二糖40g/L，木糖17g/L， 阿拉伯糖3g/L，添加O. 5g/L酵母粉，O. lg/L硫酸銨，2g/l磷酸氫二鉀，O. 5g/L七水硫酸鎂，0.2g/L氯化鈣，O. O lg/L七水硫酸亞鐵，O. O lg/L七水硫酸鋅，lmg/L硫酸錳，O. 5mg/L五水硫酸銅，余量為水，PH 5. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)卷枝毛霉Mucor circinelloides AS 3. 2208 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)在PDA液體培養(yǎng)基中，280C，200rpm振蕩培養(yǎng)30h ；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量10% (v/v)，在25°C下通氣培養(yǎng)120h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和阿拉伯糖的濃度分別為1. Sg/ L，0. 5g/L和1. 2g/L ;固液分離收集菌體，得干菌體15. 7g/L，油脂量6. lg/L。
實(shí)施例9
I)將纖維二糖、木糖和葡萄糖配制成混合糖溶液，纖維二糖15g/L，木糖40g/L，葡萄糖5g/L，添加2. Og/L酵母粉，O. 3g/L氯化銨，O. 5g/L七水硫酸鎂，1. Og/L磷酸氫二鉀，微量元素溶液I % (v/v)，余量為水，pH 5. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)粘紅酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 703 (購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，34°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)28h,得種子液(每暈升含6 X IO7個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量10% (v/v)，在34°C下通氣培養(yǎng)96h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和葡萄糖濃度分別為O. lg/L,1.lg/L和O. 5g/L ;固液分離得干菌體15. 7g/L，油脂量6. 6g/L。
實(shí)施例10
I)將纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纖維二糖 27. 5g/L，木糖5g/L，阿拉伯糖1. 4g/L，半乳糖0. 7g/L，甘露糖0. 4g/L，添加0. lg/L甘氨酸， 0. 7g/L磷酸二氫鉀，0. 3g/L磷酸氫二鉀，0. 3g/L七水硫酸鎂，3. 0mg/L氯化鈣，2. 0mg/L硫酸亞鐵，10 μ g/L維生素B1，余量為水，pH 6. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)原殼小球藻Chlorella protothecoides CS-41 (菌株來(lái)源于澳大利亞CSIRO微藻研究中心)在液體培養(yǎng)基(甘氨酸5g/L，磷酸二氫鉀0. 7g/L，磷酸氫二鉀0. 3g/L，七水硫酸鎂0. 3g/L，七水硫酸亞鐵3mg/L，維生素B1 10 μ g/L)中，28°C光照自養(yǎng)培養(yǎng)，制成種子液；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量2% (v/v)，在28°C下通氣培養(yǎng)96h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖濃度分別為3. 4g/L，0g/L，l.1g/L，0. lg/L和0g/L ;固液分離收集菌體，得干菌體8. 8g/L，油脂量3. 6g/L。
實(shí)施例11
I)將纖維二糖、木糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纖維二糖20g/L，木糖15g/L，甘露糖5g/L，添加1. Og/L酵母粉，O. 5g/L蛋白胨，O. 2g/L玉米漿，18g/L氯化鈉，1. Og/L硝酸鈉,0. 5g/L氨基乙酸,1. 2g/L硫酸鎂，O. 7g/L磷酸二氫鉀,O. 3g/L氯化隹丐，1. O μ g/L維生素 B12，余量為水，pH 7.8，所得培養(yǎng)基1211滅菌151^11后備用；
2)裂殖壺菌Schizochytrium limacinum SR21 (購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心) 在液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L)中，25°C，170rpm振蕩培養(yǎng)36h ；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量10% (v/v)，在26°C下通氣培養(yǎng)96h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和甘露糖的濃度分別為2. 4g/L，2.lg/L和O. lg/L ;固液分離收集菌體，得干菌體13. 8g/L，油脂量5. lg/L。
實(shí)施例12
I)將纖維二糖、木糖和甘油配制成混合糖溶液，纖維二糖40g/L，木糖20g/L，甘油 5g/L，添加2g/L酵母粉，3g/L硝酸鉀，lg/L磷酸二氫鉀，O. 6g/L七水硫酸鎂，5. 8g/L氯化鈉,O. lg/L 二水氯化H 6. 7mg/L七水硫酸鋅，14mg/L六水氯化鐵,O. 4mg/L五水硫酸銅 ,余量為水，pH 6. O所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)寇氏隱甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30556 (購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)在液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉lg/L，蛋白胨lg/L，磷酸二氫鉀2g/L，七水硫酸鎂O. 5g/L，氯化鈉2g/L，二水氯化鈣O. 2g/L，)中，25°C，200rpm振蕩培養(yǎng)72h，得種子液 (每毫升含2 X IO5個(gè)活細(xì)胞)；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量15% (v/v)，在28°C下通氣培養(yǎng)96h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和甘油的濃度分別為1.3g/L，O.8g/L和1. 5g/L ;固液分離收集菌體，得干菌體14. 7g/L，油脂量5. 3g/L。
實(shí)施例13
I)將纖維二糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纖維二糖38g/L,木糖20g/L,葡萄糖8g/L,阿拉伯糖2. 7g/L,半乳糖O. 8g/L,甘露糖O. 5g/L,添加O. 5g/L酵母粉，1. Og/L硫酸銨，1. 0g/L七水硫酸鎂，1. 0g/L磷酸氫二鉀，余量為水，pH 6. 5，所得培養(yǎng)基121°C滅菌15min后備用；
2)彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)在YEro液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，28°C，200rpm 振蕩培養(yǎng)24h ；
3)向步驟(I)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量10% (v/v)，在28°C下通氣培養(yǎng)112h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的濃度分別為1. 5g/L、0.1g/L、0. lg/L、1. 4g/L、0. lg/L和Og/L ;固液分離收集菌體，得干菌體 22. lg/L，油脂量 11.6g/L。
對(duì)比例2
I)參照文獻(xiàn)(Tucker MP, et al. Appl Biochem Biotechnol, 2003,105 :165178)， 以玉米秸桿為原料，洗凈，干燥，粉碎過(guò)60目篩，用O. 98 %的硫酸浸潰4h，然后自然風(fēng)干成 50% (w/w)的稻桿,硫酸濃度達(dá)到1. 0%, 190C處理90s后,稀釋至料液比為5% (w/w),調(diào) pH 4. 8 ；
2)加入25FPU/g干秸桿的纖維素酶制劑(杰能科公司)、60CBU/g干秸桿的β -葡萄糖苷酶(諾維信公司)和O. 01g/g干秸桿的木聚糖酶(杰能科公司)，50°C，200r/min水浴搖床中反應(yīng)48h后過(guò)濾，濾液濃縮，水解液總還原糖濃度為60g/L，其中葡萄糖37g/L，木糖19g/L，纖維二糖1. 7g/L其他糖2. 3g/L。在此糖液中加入2. Og/L酵母粉，O. 4g/L硫酸銨，1.Og/L七水硫酸鎂，2. 7g/L磷酸二氫鉀，0. 9g/L磷酸氫二鈉，調(diào)pH 6. 0,121°C滅菌15min 后備用;
3)以15% (v/v)接種量接入斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi AS2. 1560(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)種子液(每毫升含2X108個(gè)活細(xì)胞)，于30°C通氣培養(yǎng) 144h ；
4)終止發(fā)酵， 此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、木糖和纖維二糖濃度分別為0. lg/L、2.4g/L和0g/L，最終得干菌體18. 7g/L，油脂量7. 4g/L。
實(shí)施例14
I)按照對(duì)比例2步驟I)的方法處理玉米秸桿；
2)參照文獻(xiàn)(Homma T et al. Biotechnol Bioeng, 1993,41 :405410)的方法，將纖維素酶制劑(杰能科公司)通過(guò)親和層析濾除部分β_葡萄糖苷酶后，參照文獻(xiàn)(夏黎明，岑沛霖.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33 (4) =381385)的方法制備玉米秸桿水解液，將水解液濃縮至總還原糖濃度為60g/L，其中纖維二糖30g/L，木糖19g/L，葡萄糖8. 5g/L，其他糖2. 5g/ L0在此糖液中加入2. Og/L酵母粉，O. 4g/L硫酸銨，1. Og/L七水硫酸鎂，2. 7g/L磷酸二氫鉀，0.9g/L磷酸氫二鈉，調(diào)pH 6.0，1211滅菌151^11后備用；
3)以15% (v/v)接種量接入斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi AS2. 1560(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，于30°C通氣培養(yǎng)96h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和葡萄糖濃度分別為1. lg/L、 O. lg/L和Og/L，最終得干菌體21. 5g/L，油脂量8. 7g/L。
通過(guò)比較對(duì)比例2和實(shí)施例14的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，在總糖濃度及發(fā)酵條件相當(dāng)情況下，實(shí)施例14到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)所需時(shí)間為96h，是對(duì)比例2發(fā)酵時(shí)間的66%，發(fā)酵時(shí)間明顯縮短；并且發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)實(shí)施例14總殘?zhí)菨舛雀?。同時(shí)，實(shí)施例14獲得了更高的菌體和油脂量。因此，采用實(shí)施例14的方案，以玉米秸桿為基礎(chǔ)原料，培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的生產(chǎn)效率和原料利用效率提高，成本降低。
實(shí)施例15
I)參照文獻(xiàn)(Zhang J, et al. Bioresour Technol, 2011,102 :44804488),以稻草為原料，洗凈，干燥，粉碎過(guò)60目篩，并用2. 5%的硫酸浸潰18h，190C蒸汽處理3min后，稀釋至料液比為10% (w/w),調(diào)pH 4. 8 ；
2)參照文獻(xiàn)(Homma T et al. Biotechnol Bioeng, 1993,41 :405410)的方法，除去纖維素酶制劑(杰能科公司)的β -葡萄糖苷酶活性，參照文獻(xiàn)(Kim Μ, Day D F. Appl Biochem Biotechnol, 2010,162 =13791390)的方法制備稻草水解液，將水解液濃縮至總還原糖濃度為45g/L，其中纖維二糖20g/L，木糖15g/L，葡萄糖6g/L，其他糖3g/L。在此糖液中加入纖維二糖25g/L，酵母粉O. 5g/L，硫酸銨1. Og/L,磷酸二氫鉀2. 7g/L，磷酸氫二鈉O. 9g/ L，肌醇六磷酸鈉1.0g/L，調(diào)pH 5. 5，121°C滅菌15min后備用；
3)以10 % (v/v)接種量接入彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ATCC20509(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)種子液(每毫升含4X IO7個(gè)活細(xì)胞)，于25°C 通氣培養(yǎng)144h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和葡萄糖濃度分別為2.7g/L、 O. lg/L和Og/L,最終得干菌體22. lg/L,油脂量8. 8g/L。
實(shí)施例16
I)參照文獻(xiàn)(Krishnan C, et al. Biotechnol Bioeng, 2010,107 :441450),以云杉為原料，洗凈，干燥，粉碎過(guò)60目篩，2 I (w/w)的氨水和云杉，120°C氨膨脹處理30min，調(diào)整料液比為10% (w/w)，調(diào)pH 4. 8 ；
2)參照文獻(xiàn)(Zhou J et al. Bioresour Technol, 2009,100 :819825)的方法，對(duì)纖維素酶(杰能科公司)進(jìn)行分離純化，將得到的內(nèi)切β_1，4-葡聚糖酶和纖維二糖水解酶按質(zhì)量比2 I混合，按20FPU/g干秸桿加入混合酶組分，按0.01g/g干秸桿加入木聚糖酶(杰能科公司)，500C, 200r/min水浴搖床中反應(yīng)48h后過(guò)濾,制備云杉水解液，將水解液濃縮至總還原糖濃度為60g/L，其中纖維二糖35g/L，木糖17g/L，葡萄糖3g/L，其他糖5g/L。 在此糖液中加入1. Og/L酵母粉，O. 5g/L七水硫酸鎂，1. Og/L磷酸二氫鉀，O. 4g/L的EDTA， 調(diào)pH 6. O0 121°C滅菌15min后備用；
3)以 12 % (v/v)接種量接入發(fā)酵性絲抱酵母 Trichosporon fermentansCICC 1368(購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)種子液，于28°C通氣培養(yǎng)120h ；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余纖維二糖、木糖和葡萄糖濃度分別為0.5g/L、 2.7g/L和Og/L,最終得干菌體17. 7g/L，油脂量6. 7g/L。
實(shí)施例17
參照文獻(xiàn)(LiuB, Zhao Z B. J Chem Technol Biotechnol, 2007,82 (8) :775 780) 的方法，以實(shí)施例1獲得的干菌體1. Og為材料，制備生物柴油，得生物柴油O. 46g，收率為 93 %，所得生物柴油的辛烷值為59，適合作為柴油的替代品。
實(shí)施例18
參照文獻(xiàn)(LiYH, et al. Enzyme Microb Technol，2007，41 :312317)的方法，從實(shí)施例14獲得菌體中提取微生物油脂，得到O. 30g。參照文獻(xiàn)(里偉，等.過(guò)程工程學(xué)報(bào)， 2007，7 (I)，137140)的方法，取O. 25g油脂在酶催化條件下轉(zhuǎn)酯化制備和純化生物柴油，得到O. 22g，生物柴油收率88%，所得生物柴油的辛烷值為58，適合作為柴油的替代品。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基的碳源中包括碳源總重量20% -90%的纖維二糖和碳源總重量5% -75%的木糖，培養(yǎng)基pH 4. 0-8. O。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基的碳源除含有纖維二糖和木糖外，還含有質(zhì)量含量為5-20 %以內(nèi)的其他微生物培養(yǎng)常用碳源有機(jī)物，其他微生物培養(yǎng)常用碳源為葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖或甘油中的一種或二種以上組合。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基除含有碳源夕卜，還含有其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其他微生物培養(yǎng)常用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括質(zhì)量為碳源總質(zhì)量O. 1% -25%的氮源、質(zhì)量為碳源總質(zhì)量O. 01% -25%的磷源、或質(zhì)量為碳源總質(zhì)量O.01% -10%的硫源或它們中的二種或三種的組合。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基的碳源來(lái)自木質(zhì)纖維素原料的水解液，或來(lái)自添加有纖維二糖和/或木糖的木質(zhì)纖維素原料的水解液。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述木質(zhì)纖維素原料為含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物質(zhì)材料。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述木質(zhì)纖維素原料為玉米秸桿、麥桿、稻草、林業(yè)生產(chǎn)下腳料、松木、云杉中的一種或二種以上組合。
7. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物為經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體油脂含量可超過(guò)細(xì)胞干重20%的真核微生物，包括下述微生物中的一種或二種以上，油脂酵母中的斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi ;紅酵母中的圓紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides、粘紅酵母 Rhodotorula glutinis 和擲抱酵母Sporobolomyces roseus ;絲抱酵母中的皮狀絲抱酵母Trichosporon cutaneum和發(fā)酵性絲抱酵母Trichosporon fermentans ；隱球酵母中的白色隱球酵母Cryptococcusalbidus和彎曲隱球酵母Cryptococcus curvatus ;霉菌中的伯頓擬內(nèi)抱霉Endomycopsisburtoni1、健強(qiáng)地霉 Geotrichum robustum、深黃被抱霉 Mortierella isabellina 和卷枝毛霉Mucor circinelloides ;產(chǎn)油微藻中的布朗葡萄藻Botryococcus brauni1、寇氏隱甲藻 Crypthecodinium cohni1、原殼小球藻 Chlorella protothecoides 和裂殖壺菌Schizochytrium Iimacinum0
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述產(chǎn)油微生物經(jīng)培養(yǎng)后得到的菌體積累含有一種或多種長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物的油脂，培養(yǎng)溫度20°C-37°C，并且油脂含量占細(xì)胞干重的20%以上；所述產(chǎn)油微生物菌體內(nèi)積累的油脂，可以作為制備生物柴油的原料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種產(chǎn)油微生物培養(yǎng)的新方法，即利用纖維二糖和木糖混合物為主要碳源物質(zhì)，添加其他必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通氣培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，并制備微生物油脂。纖維二糖和木糖混合物可以由木質(zhì)纖維素原料水解制備。木質(zhì)纖維素原料完全水解通常得到由葡萄糖和木糖為主要成份的水解液，用于培養(yǎng)微生物時(shí)存在葡萄糖效應(yīng)，發(fā)酵周期長(zhǎng)。本發(fā)明規(guī)避了葡萄糖效應(yīng)，培養(yǎng)周期縮短，生產(chǎn)效率和原料利用率提高，成本降低，改善了微生物油脂的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源制備微生物油脂和生物柴油。
文檔編號(hào)C12P7/64GK103013834SQ20111028114
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者趙宗保, 龔志偉, 沈宏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所