專利名稱：一種沙眼衣原體的pcr熒光定量快速檢測試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒及其方法。
背景技術(shù)：
沙眼衣原體是一類能通過濾菌器，嚴(yán)格真核細胞內(nèi)寄生，有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物。它能引起沙眼，包涵體包膜炎，泌尿生殖道感染以及性病淋巴肉芽腫。注射沙眼衣原體疫苗后，可以誘發(fā)局部特異性免疫，但其保護作用僅能維持1-2年?！恫舷到y(tǒng)手冊》(1984)的記載，將沙眼衣原體Chlamydia trachomatis分為3個生物型，即小鼠生物型(biovar mouse)，沙眼生物型(biovar trachoma)和性病淋巴肉芽腫生物型 (biovarlymphogranulomavenereum, LGV)，后二者與人類疾病有關(guān)。用間接微量免疫熒光試驗，沙眼生物型又分A. B. Ba. C. D. Da. E. F. G. H. I. Ia. J. K14個血清型，LGV生物型又有 Li. L2. L2a. L34個血清型。沙眼生物變種D K血清型和沙眼衣原體LGV生物變種可以導(dǎo)致男性非淋球菌性尿道炎.女性宮頸炎.輸卵管炎.不孕癥等。目前衣原體感染已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的社會問題。一方面衣原體已成為性病中最多見的一種病原體，另一方面是它可出現(xiàn)嚴(yán)重的持續(xù)性感染現(xiàn)象。最高可有70%的婦女宮頸炎和50%的男性尿道感染是無癥狀的攜帶者，因無自覺癥狀，這些人在社會上是一個高危的潛在傳染源。有學(xué)者報道，經(jīng)衣原體陽性母親產(chǎn)道出生的嬰兒，有50% 70%的機會可以獲得衣原體感染。有鑒于此，西方國家法定衣原體感染是一項孕婦產(chǎn)前必查的常規(guī)項目。所以提早診斷衣原體感染，對優(yōu)生優(yōu)育有著極大的意義。另外，CT的脂多糖可以誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，刺激吞噬細胞活性，從而導(dǎo)致組織損傷。CT是HIV傳播的輔助因子，感染CT的女性發(fā)生HIV感染較無CT感染的女性高3 5 倍，治療CT可降低HIV的傳播。作為成人泌尿生殖道的一種常見的寄生微生物，CT可引起人類感染多種疾病。目前已經(jīng)有多種方法可以利用一定的實驗室條件對CT作出及時，準(zhǔn)確的診斷。用宮頸或尿道拭子做衣原體培養(yǎng)是檢測衣原體的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性可達100%，敏感性為80% 90%。最常用的方法是將樣本接種于經(jīng)過環(huán)已米特(放線菌酮)處理的McCoy 細胞。培養(yǎng)需要48 72h，用碘染色或吉姆薩染色觀察包涵體。如直接免疫熒光法.酶免疫測定(EIA)等，也是用宮頸或尿道拭子做樣本。直接免疫熒光法是通過熒光標(biāo)記特異抗體直接測定衣原體的脂多糖或主要外膜蛋白抗原，特異性96% 100%，敏感性80% 85%。EIA直接測定衣原體脂多糖抗原，與樣本中的其它革蘭氏陰性菌脂多糖抗原有交叉反應(yīng)，敏感性相當(dāng)于培養(yǎng)法的60% 80%，特異性96% 100 %。上述方法若用于尿檢時，敏感性只有40 % 50 %，因此不適用于篩查。DNA擴增技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，可以直接檢測樣本中沙眼衣原體質(zhì)?；蛲饽さ鞍椎暮塑账嵝蛄?。RNA擴增法擴增的是衣原體核糖體RNA?？梢圆扇∧驑幼鰳颖荆舾行?4% 100%，特異性98% 100%，可用于篩查試驗。目前細胞培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)地位正在被PCR和LCR法所取代。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增試驗、酶放大免疫反應(yīng)、半巢式PCR-微空板雜交法、巢式PCR、實時熒光PCR定量檢測等方法都在應(yīng)用，提高了檢測的準(zhǔn)確性和敏感性，為臨床提供了無創(chuàng)、靈敏、快速的檢測手段，可用于篩查試驗。目前，國內(nèi)主要從事CT核酸檢測的研發(fā)生產(chǎn)公司多采用熒光PCR方法進行CT-DNA 定量檢測，該法操作簡便，靈敏度高，結(jié)果便于分析。華美生物公司采用傳統(tǒng)PCR技術(shù)先對 CT目標(biāo)基因進行擴增，再將擴增產(chǎn)物結(jié)合ELISA方法與固定在酶標(biāo)板的特異性探針進行雜交，之后采用ELISA法進行顯色滴定以進行CT-DNA定量，該法的優(yōu)點在于不需要添置額外的熒光PCR儀，但該法操作繁瑣，易造成操作污染。Roche公司最早推出的產(chǎn)品是電泳法分析擴增產(chǎn)物，爾后，在試劑的技術(shù)性上有了很大改進，其最明顯的是對產(chǎn)物檢測的方法的改進，繼其電泳法試劑之后正式推出了基于ELISA原理的PCR試劑盒。目前，又有許多公司在研制基于熒光能量轉(zhuǎn)移原理的CTPCR試劑盒，至此，PCR技術(shù)用于沙眼衣原體的檢測已經(jīng)發(fā)展到非常成熟的階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種適用于臨床樣本中沙眼衣原體的快速檢測的試劑盒，可用于沙眼衣原體感染的輔助診斷及療效監(jiān)控。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液含有引物和熒光探針；所述引物分為上游引物和下游引物；上游引物5，-CTGTACATTAGGAGCCACCA-3，；下游引物5，-CAACAGATTGATCAAAGCTC-3，；熒光探針5，-FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3，。作為本發(fā)明的進一步設(shè)置，所述試劑盒還包括DNA聚合酶、陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、陽性定量參比品、DNA提取液。作為本發(fā)明的進一步設(shè)置，引入了一個人工構(gòu)建的內(nèi)參照系統(tǒng)用于避免檢測結(jié)果假陰性，內(nèi)參照系統(tǒng)包括內(nèi)參探針、引物和內(nèi)參DNA，所述內(nèi)參照系統(tǒng)包括上游引物序列 SEQ ID NO. 4、下游引物序列=SEQ ID NO. 5和探針序列=SEQ ID NO. 6。作為本發(fā)明的進一步設(shè)置，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)。作為本發(fā)明的進一步設(shè)置，所述陽性質(zhì)控品濃度為10倍梯度IO6Copies/ mL-107copies/mL，所述弱陽性質(zhì)控品濃度為 10 倍梯度 103copies/mL-104copies/mL。作為本發(fā)明的進一步設(shè)置，所述DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。本發(fā)明的另一個技術(shù)方案為提供一種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測方法， 其中PCR擴增所用引物為上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如SEQ ID N0. 2，熒光探針序列如SEQ ID N0. 3。作為上述方法的進一步設(shè)置，所述熒光探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團，3’端標(biāo)記 TAMRA淬滅基團。本發(fā)明的CT熒光PCR定量檢測試劑盒和方法，利用了 Taqman核心技術(shù)平臺和擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，并可有效去除抑制PCR擴增的抑制物，使定量更為準(zhǔn)確。與實驗室單純PCR定量檢測相比，本產(chǎn)品準(zhǔn)確性高、特異性強，而且在重復(fù)性、穩(wěn)定性、靈敏度和精密度都有了很大的改進，提高，顯示其具備以下性能(1)準(zhǔn)確性檢測企業(yè)內(nèi)控參比品Zl-ZlO樣本，結(jié)果全陰陽性符合率為100%。(2)特異性檢測企業(yè)內(nèi)控參比品Tl-TlO樣本結(jié)果全部為陰性。(3)靈敏度能穩(wěn)定檢測CT-DNA的最低檢出限為5. 0 X 102COpieS/mL。(4)精密度檢測企業(yè)內(nèi)控參比品S1-S4，每個樣本重復(fù)5次，計算批內(nèi)差和批間差均CV值彡10%。(5)穩(wěn)定性產(chǎn)品有效期為6個月，在有效期內(nèi)產(chǎn)品性能穩(wěn)定。


圖1 靈敏度參比品檢測結(jié)果圖；圖2 精密度參比品檢測結(jié)果圖；圖3 陽性準(zhǔn)確性Z1-Z5參比品檢測結(jié)果圖；圖4 :Z6-Z10陰性準(zhǔn)確性參比品檢測結(jié)果圖；圖5 特異性Tl-TlO參比品檢測結(jié)果圖；圖6 :Z6-Z10陰性準(zhǔn)確性內(nèi)參照參比品檢測結(jié)果7 特異性Tl-TlO內(nèi)參照參比品檢測結(jié)果圖；圖8 試劑盒中陽性對照、臨界陽性對照、陰性對照參比品檢測結(jié)果圖；圖9 試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品Ie4_le7參比品檢測結(jié)果圖；圖10 標(biāo)準(zhǔn)曲線Ie4_le7參比品檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式本試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及熒光標(biāo)記探針技術(shù)，快速檢測臨床樣品中沙眼衣原體特有序列，從而判斷沙眼衣原體的存在。對保守序列我們共設(shè)計多對引物，并進行了詳細的比較，最后選擇了靈敏度、特異性和選擇性均較好的引物。在引物擴增片段內(nèi)我們設(shè)計了檢測CT基因的通用雙環(huán)探針，使用FAM標(biāo)記，并且對探針進行全面的質(zhì)控和初步實驗。雙擴增體系中所需要的通用標(biāo)簽序列，我們在設(shè)計時，隨機設(shè)計20條GC含量在 55%左右，ATGC四種堿基隨機分布的、堿基數(shù)量在18-22bp間的寡核苷酸序列，使用軟件 Primer 5. 0分析引物自身結(jié)構(gòu)以及與突變特異引物和雙環(huán)探針間的交叉二聚體形成情況， 從中選擇出自身二級結(jié)構(gòu)最少，交叉二聚體AG較低的引物，然后在NCBI網(wǎng)站上Blast確定標(biāo)簽引物的無種屬性和無相似核酸序列存在。實施例1試劑盒的組成及配置1.主要原材料來源及制備方法本試劑盒的CT引物和探針序列如下上游引物5‘ -CTGTACATTAGGAGCCACCA-3 ‘；下游引物5‘ -CAACAGATTGATCAAAGCTC-3 ‘；熒光探針5' -FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3'。
本試劑盒的內(nèi)參照(Sue)引物上游引物序列SEQ ID NO. 4、下游引物序列SEQ ID NO. 5和探針序列=SEQ ID NO. 6，具體如下上游引物5‘ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 ‘；下游引物5‘ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 ‘；熒光探針5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。所述試劑盒還包括DNA聚合酶、強陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品.陰性質(zhì)控品、陽性定量參比品、DNA提取液。1. 1.引物用于PCR反應(yīng)的引物，紫外檢測結(jié)果A260nm A280nm彡1. 5可視為合格引物。_20°C保存。1. 2.探針CT探針在寡核苷酸5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記BHQ，紫外檢測結(jié)果 A260nm A280nm彡1. 5，在FAM熒光素的激發(fā)波長520nm處有吸收峰。-20°C保存。SUC II探針在寡核苷酸5，端標(biāo)記HEX，3，端標(biāo)記BHQ，紫外檢測結(jié)果 A260nm A280nm彡1. 5，在HEX熒光素的激發(fā)波長555nm處有吸收峰。-20°C保存。1. 3. DNA 聚合酶(含 10 X PCR buffer. MgC12)濃度5U/μ 1，含10XPCR Buffer. 25mmol/LMgCl2，根據(jù)供應(yīng)商質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本品具有 DNA聚合酶活性，無3’一 5’核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94°C保溫1小時后仍保持50 %活性。-20 0C保存。1. 4. dN(U) TP包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。根據(jù)供應(yīng)商質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為HPLC純，無DNase和RNase 污染。_20°C保存。1. 5. UNG 酶使用Fermentashtenational INC. (MBI 公司)產(chǎn)品。核對其技術(shù)參數(shù)SDS-PAGE 檢測，純度> 95%，具有特異降解DNA鏈中dUTP位點的特性，95°C 10分鐘后可將其滅活。 UNG酶的質(zhì)檢與引物同時進行，檢測性能符合引物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方可用于產(chǎn)品生產(chǎn)。1. 6.純水使用泰普公司制備的純水，肉眼觀察清澈無雜質(zhì)，經(jīng)DDB-305型電導(dǎo)率儀測定其電阻率取值在1. OM Ω/cm以上。純水的質(zhì)檢與引物質(zhì)檢同時進行，性能檢測符合引物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方可用于產(chǎn)
品生產(chǎn)。2. PCR反應(yīng)液的制備2. 1配液前準(zhǔn)備(l)dN(U) TP將購買的IOOmM 的 dATP、dUTP、dGTP、dCTP，按照 1 : 1· 5 : 1 : 1 (體積比)混合，混合液各成分濃度分別為10mM. 15mM. IOmM. IOmM取0. 5mL離心管，分裝成每管100 μ L dN(U) TP的母液。(3)引物
將合成的引物13000rpm離心lmin，加入適量純水(根據(jù)合成量計算)將引物溶解成100 μ M，取0. 5mL離心管，分裝成每管100 μ L的引物母液。進行生產(chǎn)前需加入適量純水配制成10 μ M使用液。(3)探針將合成的探針13000rpm離心lmin，加入適量純水(根據(jù)合成量計算)將探針溶解成100 μ M，取0. 5mL離心管，分裝成每管100 μ L的探針母液。進行生產(chǎn)前需加入適量純水配制成10 μ M使用液。2. 2. PCR反應(yīng)液配液1.如表1為本發(fā)明PCR反應(yīng)液配方。表1 CT-PCR反應(yīng)液配方
權(quán)利要求
1.一種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液含有引物和熒光探針；所述引物分為上游引物和下游引物上游引物5’ -CTGTACATTAGGAGCCACCA-3’ ；下游引物5，-CAACAGATTGATCAAAGCTC-3，；熒光探針5，-FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3，。
2.按權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括DNA聚合酶、陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、陽性定量參比品、DNA 提取液。
3.按權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，其特征在于，引入了一個人工構(gòu)建的內(nèi)參照系統(tǒng)用于避免檢測結(jié)果假陰性，內(nèi)參照系統(tǒng)包括內(nèi)參探針、引物和內(nèi)參DNA。
4.按權(quán)利要求3所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)包括上游引物序列SEQ ID NO. 4、下游引物序列 SEQ ID NO. 5 和探針序列SEQ ID NO. 6。
5.按權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性質(zhì)控品濃度為10倍梯度106COpies/mL-107COpies/mL，所述弱陽性質(zhì)控品濃度為10倍梯度 103copies/mL_104copies/mLo
6.按權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。
7.—種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測方法，其特征在于，其中PCR擴增所用引物為上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如SEQ ID NO. 2，熒光探針序列如SEQ ID NO. 3。
8.按權(quán)利要求7所述的沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測方法，其特征在于，所述熒光探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團，3’端標(biāo)記TAMRA淬滅基團。
全文摘要
本發(fā)明目的是提供一種適用于臨床樣本中沙眼衣原體的快速檢測的試劑盒，可用于沙眼衣原體感染的輔助診斷及療效監(jiān)控。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種沙眼衣原體的PCR熒光定量快速檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液含有引物和熒光探針；所述引物分為上游引物和下游引物，所述試劑盒還包括DNA聚合酶、強陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、陽性定量參比品、DNA提取液。本發(fā)明的CT熒光PCR定量檢測試劑盒和方法，利用了Taqman核心技術(shù)平臺和擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，檢測的靈敏度更高。并且準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、靈敏度和精密度相對現(xiàn)有產(chǎn)品有了提高。
文檔編號C12Q1/68GK102329866SQ201110279330
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者何東華, 蔡曉沂 申請人:泰普生物科學(xué)(中國)有限公司