專利名稱：地衣芽孢桿菌及用其制備凝乳酶凍干粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種地衣芽孢桿菌及用其制備凝乳酶凍干粉的方法。
背景技術(shù)：
凝乳酶是干酪制作過(guò)程中一種關(guān)鍵性酶，其主要作用是專一性的剪切酪蛋白Phe 105-Met 106的肽鍵，形成穩(wěn)定的副κ -酪蛋白及親水性的糖巨肽；當(dāng)總酪蛋白被水解掉約85 %時(shí)，在Ca2+存在下通過(guò)在酪蛋白膠粒間形成的化學(xué)鍵形成凝塊或凝固的乳，從而使變化的凝乳酶、酪蛋白膠粒發(fā)生沉淀。凝乳酶主要有三種來(lái)源，分別為動(dòng)物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動(dòng)物凝乳酶中使用最廣泛的是小牛皺胃酶。采用小牛皺胃酶生產(chǎn)干酪時(shí)具有較好的凝乳效果，所產(chǎn)干酪具有硬度和彈性均符合工藝要求，出品率較高，不產(chǎn)生苦味等特點(diǎn)， 因此長(zhǎng)期以來(lái)小牛皺胃酶一直得到人們的青睞。隨著干酪工業(yè)的發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年要宰殺5000萬(wàn)頭小牛，以獲得凝乳酶，造成全球性小牛短缺，凝乳酶的來(lái)源不穩(wěn)定，而且價(jià)格昂貴。另外，素食者認(rèn)為用牛凝乳酶生產(chǎn)的乳酪是不可以接受的。植物蛋白酶分布于植株的果實(shí)、葉、莖和根等部位，均可提取相應(yīng)的蛋白酶。許多植物蛋白酶含有能使乳凝固的作用，如木瓜、無(wú)花果、波蘿、南瓜和生姜等。木瓜蛋白酶是從番木瓜中提取的，可以使牛乳凝固，其對(duì)牛乳的凝乳作用比蛋白酶分解力強(qiáng)，脂肪損失少， 收率較高，但制成的干酪?guī)в幸欢ǖ目辔叮淮蠖鄶?shù)植物蛋白酶在干酪生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白質(zhì)分解活性過(guò)強(qiáng)，使干酪產(chǎn)生苦味，而且成品得率較低，質(zhì)地也稍軟，致使商品價(jià)值很低。自1964年Arima首先發(fā)現(xiàn)了微小毛霉iMucor fflicrom)可以產(chǎn)凝乳性的蛋白酶， 并對(duì)其作了詳細(xì)的研究以來(lái)，微生物凝乳酶就成為動(dòng)物性凝乳酶替代品的研究重點(diǎn)。微生物具有生長(zhǎng)周期短，生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)條件易于控制，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，目前各國(guó)的發(fā)酵工業(yè)都比較發(fā)達(dá)，發(fā)酵產(chǎn)物的提取工藝比較完善。因此，對(duì)由微生物所分泌的凝乳酶的研究和開(kāi)放有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種地衣芽孢桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用地衣芽孢桿菌制備凝乳酶凍干粉的方法。本發(fā)明中的地衣芽孢桿菌D3. 11從甘肅省天祝藏族自治縣放牧牦牛生活環(huán)境土壤中篩選得到，分類命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) D3. 11，于2009年 09月23日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)CGMCC No :3289ο本發(fā)明地衣芽孢桿菌D3. 11的篩選方法是采集天祝藏族自治縣放牧牦牛生活環(huán)境土壤樣品，經(jīng)酪蛋白平板培養(yǎng)，觀察沉淀圈和蛋白水解圈進(jìn)行篩選，并比較凝乳酶活性大小而得到。牧區(qū)土壤樣品經(jīng)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，涂平板，選擇沉淀圈大、無(wú)色透明圈小的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)比較凝乳酶活性大小，最終確定菌株。酪蛋白培養(yǎng)基組成蛋白胨2. 5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/ L，瓊脂20 g/L，脫脂牛乳50 g/L，pH值7.0。本發(fā)明地衣芽孢桿菌D3. 11 CGMCC No :3觀9，具有產(chǎn)凝乳酶的能力。本發(fā)明地衣芽孢桿菌制備凝乳酶凍干粉的方法為下列步驟
(1)種子液制備
將地衣芽孢桿菌D3. 11接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37 °C，轉(zhuǎn)速140 r/min搖床培養(yǎng)M小時(shí)，得到種子液；
(2)發(fā)酵液制備
將種子液按3%的接種量，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速200 MOr/min 振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，得到發(fā)酵液為凝乳酶液；
步驟(1)、(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制法如下
將麩皮按每10 g麩皮加入100 mL自來(lái)水的比例加水后煮沸10 min，過(guò)濾后用自來(lái)水補(bǔ)足原體積，得到麩皮汁；將所得的麩皮汁，在溫度115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
(3)發(fā)酵液的離心
將發(fā)酵液在溫度4°C、轉(zhuǎn)速8000r/min條件下離心lOmin，得到上清液；
(4)酶的分級(jí)沉淀
將硫酸銨烘干研細(xì)，取第三步得到的上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到30%，在溫度4°C靜置2小時(shí)后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到70%，在溫度4°C靜置2小時(shí)后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心IOmin后，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，再在溫度4°C透析48小時(shí)，即為透析液；
(5)酶的純化
將透析液加入DEAE-S印hadex A-25離子交換柱，以0. 05mol/L, pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCI梯度洗脫，分布收集，檢測(cè)活性，合并有活性的洗脫液，濃縮凍干即可。本發(fā)明菌株經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得凝乳酶，酶活力可達(dá)343. 5 SU/ml， 可用于干酪和干酪素生產(chǎn)。本發(fā)明地衣芽孢桿菌D3. 11形態(tài)特征與生理生化特征如下
1)形態(tài)特征革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，桿菌，柱狀，單個(gè)排列，有芽孢，芽孢為中生芽孢， 穿刺培養(yǎng)表明該菌株有運(yùn)動(dòng)性。在酪蛋白平板上菌落不規(guī)則，為微黃色，凸起，菌落表面有粘液。D3. 11革蘭氏染色見(jiàn)

圖1是地衣芽孢桿菌D3. 11在顯微鏡下的菌體形態(tài)圖。圖2是地衣芽孢桿菌D3. 11在掃描電鏡下下的菌體形態(tài)圖。圖3是地衣芽孢桿菌D3. 11的菌落形態(tài)圖。2)生物生化特征見(jiàn)表一
表一
權(quán)利要求
1.一種地衣芽孢桿菌D3. 11 CGMCC No :3觀9，具有產(chǎn)凝乳酶的能力。
2.用權(quán)利要求1的地衣芽孢桿菌制備凝乳酶凍干粉的方法，其特征在于該制備方法為下列步驟(1)種子液制備將地衣芽孢桿菌D3. 11接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37 °C，轉(zhuǎn)速140 r/min搖床培養(yǎng)M小時(shí)，得到種子液；(2)發(fā)酵液制備將種子液按3%的接種量，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速200 MOr/min 振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，得到發(fā)酵液為凝乳酶液；步驟(1)、(2)中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制法如下將麩皮按每10 g麩皮加入100 mL自來(lái)水的比例加水后煮沸10 min，過(guò)濾后用自來(lái)水補(bǔ)足原體積，得到麩皮汁；將所得的麩皮汁，在溫度115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基；(3)發(fā)酵液的離心將發(fā)酵液在溫度4°C、轉(zhuǎn)速8000r/min條件下離心lOmin，得到上清液；(4)酶的分級(jí)沉淀將硫酸銨烘干研細(xì)，取第三步得到的上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到30%，在溫度4°C靜置2小時(shí)后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到70%，在溫度4°C靜置2小時(shí)后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心IOmin后，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，再在溫度4°C透析48小時(shí)，即為透析液；(5)酶的純化將透析液加入DEAE-S印hadex A-25離子交換柱，以0. 05mol/L, pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCI梯度洗脫，分布收集，檢測(cè)活性，合并有活性的洗脫液，濃縮凍干即可。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌及用其制備凝乳酶凍干粉的方法。本發(fā)明將地衣芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心、酶的分級(jí)沉淀、酶的純化得到凝乳酶凍干粉。該凝乳酶凍干粉可用于干酪和干酪素的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/64GK102296042SQ20111024906
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者喬海軍, 張衛(wèi)兵, 張炎, 梁琪, 甘伯中, 米蘭 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)