專利名稱：聚磷放線菌閻氏鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有較強(qiáng)的聚磷能力的微生物菌株。
背景技術(shù)：
聚磷菌是從工程的角度在污水生物除磷研究中對(duì)微生物的一種界定，將厭氧/好氧交替運(yùn)行導(dǎo)致厭氧釋磷、好氧超量吸磷的一類異養(yǎng)型細(xì)菌稱為聚磷菌。早期的研究者認(rèn)為聚磷菌屬于不動(dòng)桿菌屬，但是后期研究者認(rèn)為屬于莫拉氏菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。由于聚磷菌只是按照超量聚磷這個(gè)生物化學(xué)過(guò)程來(lái)界定的，所以要真正界定聚磷菌還應(yīng)該從細(xì)菌的微生物特性入手進(jìn)行研究。聚磷菌也叫做攝磷菌，是指體內(nèi)能貯存聚磷和聚β-羥基丁酸的一類細(xì)菌的總稱。一般認(rèn)為主要有不動(dòng)桿菌、假單胞菌屬等菌種。聚磷菌是傳統(tǒng)活性污泥工藝中一類特殊的兼性細(xì)菌，在好氧或缺氧狀態(tài)下能超量地將污水中的磷吸入體內(nèi)，使體內(nèi)的含磷量超過(guò)一般細(xì)菌體內(nèi)的含磷量的數(shù)倍，生物除磷主要是利用聚磷菌的聚磷作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從禾本科植物茅草根際土壤中，分離得到的具有高效聚磷活性的土壤放線菌-聚磷放線菌閻氏鏈霉菌。本發(fā)明所述的聚磷放線菌閻氏鏈霉菌系從禾本科植物茅草根際土壤中分離得到。 現(xiàn)在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏單位地址中國(guó)，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏日期為2011年6月1 日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :Μ2011188ο本發(fā)明所述的聚磷放線菌閻氏鏈霉菌系鏈霉菌屬，命名為閻氏鏈霉菌YIM Α116 (.Streptomyces yanii YIM A116)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2011188o本發(fā)明所述的YIM Al 16菌株經(jīng)PCR技術(shù)，DNA測(cè)序儀分析，該菌株的16S rDNA序列由1411個(gè)堿基組成。用BLAST程序?qū)IM Al 16的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果與已報(bào)道的閻氏鏈霉菌份r^tofflj^^s yanii NBRC 14669T(登錄號(hào)AB006159)的16S rDNA序列同源性達(dá)到100%，鑒定其為閻氏鏈霉 1 Sti^ptomyces yanii。構(gòu)建了 YIM Al 16菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。 Μ Al 16 菌種描述
好氧生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)生大量分枝的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。基內(nèi)菌絲部分短分枝尖端長(zhǎng)有單個(gè)孢子。氣生菌絲長(zhǎng)有較短的直形孢子鏈、彎曲狀孢子鏈及多分枝的孢子絲，孢子呈橢圓形。在ISP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)可生長(zhǎng)出大量灰色的氣生孢子和灰色至黑色的基內(nèi)菌絲， 無(wú)色素產(chǎn)生。YIM Al 16固體培養(yǎng)特征ISP2培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)，長(zhǎng)出少量白色至乳黃色小菌落，表面光滑，微微凸起， 邊緣整齊，菌落邊緣培養(yǎng)基輕微凹陷；2天菌落直徑增大，全部變?yōu)槿辄S色，少量菌落開(kāi)始產(chǎn)生白色氣生菌絲；3天菌落大量生長(zhǎng)，大片白色氣生菌絲變?yōu)榛疑?，新生菌落產(chǎn)生較薄的白色氣生菌絲，菌落直徑從小于Imm至2mm不等，菌落凸起，邊緣瓊脂凹陷明顯，基內(nèi)菌絲為乳黃色；5天大部分菌落氣生菌絲變?yōu)榛疑鶅?nèi)菌絲為灰黑色，少量單菌落氣生菌絲為白色，菌落邊緣有缺刻，基內(nèi)菌絲為乳黃色；9天全部菌落都生成灰黑色的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，無(wú)色素產(chǎn)生。 YIM Al 16菌株的顯微形態(tài)特征
產(chǎn)生大量分枝的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?；鶅?nèi)菌絲部分短分枝尖端長(zhǎng)有單個(gè)孢子。氣生菌絲長(zhǎng)有較短的直形孢子鏈、彎曲狀孢子鏈及多分枝的孢子絲，孢子呈橢圓形，0.8 1 X 1 1. 5 μ m。 YIM Al 16菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)特征
①I(mǎi)SP2培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)5 7天。培養(yǎng)溫度。②發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，培養(yǎng)基略微變渾濁；培養(yǎng)第2天，培養(yǎng)基進(jìn)一步變渾濁；培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液菌絲體密集，發(fā)酵液呈棕黃色，有少量小菌絲球產(chǎn)生；培養(yǎng)第4 天，長(zhǎng)滿棕黃色菌絲體，發(fā)酵液稍粘稠，培養(yǎng)第5 7天，菌絲體生長(zhǎng)穩(wěn)定，發(fā)酵液呈致密的棕黃色，可見(jiàn)少量棕黃色菌絲球產(chǎn)生。茅草土壤放線菌YIM A116菌株采用液態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵流程
菌種一試管斜面一種子培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一培養(yǎng)液離心一上清液一可溶性磷測(cè)定。發(fā)酵條件參數(shù)如下 (1)發(fā)酵方式液態(tài)發(fā)酵。(2)菌種斜面試管斜面菌種培養(yǎng)采用ISP2培養(yǎng)基。(3)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)為ISP2液體培養(yǎng)基。ISP2液體培養(yǎng)基制備秤取麥芽提取物(Malt extract) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 4g，無(wú)水葡萄糖(Glucose) 4g，溶于IL水，調(diào)節(jié)至pH 7. 2士0. 2，121°C高壓滅菌 30mino上述ISP2培養(yǎng)基中加入瓊脂15g，即為固體ISP2培養(yǎng)基。改良的ISP2培養(yǎng)基制備秤取麥芽提取物(Malt extract) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 4g，無(wú)水葡萄糖(Glucose) 7g，KH2PO4 0. 5712g 溶于 IL 水，調(diào)節(jié)至 pH 7. 2 士 0· 2，121°C 高壓滅菌 30min。(4)發(fā)酵培養(yǎng)改良的ISP2培養(yǎng)基。(5)培養(yǎng)時(shí)間試管斜面菌種活化培養(yǎng)5天，種子搖床培養(yǎng)時(shí)間3 4天，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5 7天。(6)培養(yǎng)溫度試管斜面菌種培養(yǎng)溫度士 1°C，種子搖床培養(yǎng)溫度士 1°C， 發(fā)酵培養(yǎng)溫度為士 1°C。(7)可溶性磷的測(cè)定發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，經(jīng)離心，得到上清液。根據(jù)可溶性磷的測(cè)定方法，采用改良的鉬銻抗比色法(GB 7852-87)來(lái)測(cè)定培養(yǎng)上清液中可溶性磷的含量。本發(fā)明的好氧條件下，改良的 ISP2 (International Streptomyces ProjectMedium 2)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)基上清液可溶性磷濃度由208mg/ L下降為 15. 8mg /L，磷去除率達(dá)到92.4%。YIM A116菌株具有較強(qiáng)的聚磷能力。本發(fā)明以ISP2 為原料，采用純培養(yǎng)方式，通過(guò)茅草根際土壤放線菌YIM A116液態(tài)發(fā)酵，根據(jù)可溶性磷的測(cè)定方法，采用鉬銻抗比色法來(lái)測(cè)定培養(yǎng)上清液中可溶性磷的含量。YIM A116具有高效聚磷能力，是一類治理磷污染環(huán)境的重要微生物。以往所報(bào)道的聚磷菌株多為污水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離得到，在培養(yǎng)基磷濃度為10mg/L或更低的濃度下，聚磷率大多在50%-93%不等，菌株多為細(xì)菌，聚磷工藝多為好氧/厭氧交替進(jìn)行的序批式反應(yīng)(SBR工藝)。本發(fā)明所涉及的YIM A116菌株分離自富磷山地草本植物茅草根際土壤，是一株具有高效聚磷活性的放線菌，其聚磷特點(diǎn)為
1、聚磷量遠(yuǎn)大于以往報(bào)道的菌株，可以在IOOmL優(yōu)化聚磷培養(yǎng)基(208mg/L磷濃度)中大量聚磷，使磷濃度降至15. 8mg/L，聚磷率達(dá)到92. 4%，凈聚磷量達(dá)到19. 22mg ；
2、在單純的好氧條件下即可大量聚磷，無(wú)需復(fù)雜繁瑣的好氧/厭氧序批式工藝；
3、具有良好的聚磷長(zhǎng)效性，在高磷培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)觀天，不會(huì)向培養(yǎng)基中重新放出磷，能長(zhǎng)效保持高聚磷率。


圖1為本發(fā)明所述的YIM Al 16茅草根際土壤放線菌在ISP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征(正面)。圖2為本發(fā)明所述的YIM Al 16茅草根際土壤放線菌在ISP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征(反面)。圖3為本發(fā)明所述的YIM A116茅草根際土壤放線菌菌絲體(光學(xué)顯微鏡1000X)。圖4為本發(fā)明所述的YIM Al 16茅草根際土壤放線菌孢子絲(光學(xué)顯微鏡1000X)。圖5為本發(fā)明所述的YIM A116茅草根際土壤放線菌菌絲體(掃描電鏡9113X， 6800X)。圖6為本發(fā)明所述的YIM A116茅草根際土壤放線菌孢子絲(掃描電鏡9113X， 6800X)。圖7為本發(fā)明所述的YIM Al 16可溶性磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖8為本發(fā)明所述的YIM A116菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
取編號(hào)YIM Al 16菌種，在無(wú)菌條件下(無(wú)菌室或超凈工作臺(tái))，用滅菌竹簽挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體ISP2培養(yǎng)基試管(15 X 150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)觀°C活化培養(yǎng)5天。取出活化5天的菌種，在無(wú)菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子ISP2液體培養(yǎng)基中，在下?lián)u床培養(yǎng)3 4天，即為YIM A116菌株發(fā)酵種子。發(fā)酵采用250ml玻璃三角瓶，裝入改良的ISP2液體培養(yǎng)基100ml，121°C滅菌 30min后，取出冷卻后放置培養(yǎng)箱過(guò)夜，無(wú)雜菌污染即可確認(rèn)滅菌徹底，可用于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下，取YIM Al 16種子，接種于裝有IOOml改良ISP2液體培養(yǎng)基的250ml玻璃三角瓶中，接種量為5 10% (v/w)，置通氣培養(yǎng)5 7天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室溫度變化，檢查有無(wú)染菌現(xiàn)象。發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵上清液。把發(fā)酵液加入到5ml離心管中，12000rpm，離心 3min，把上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，測(cè)定上清液中可溶性磷含量?？扇苄粤椎臏y(cè)定根據(jù)可溶性磷的測(cè)定方法，采用鉬銻抗比色法來(lái)測(cè)定培養(yǎng)上清液中可溶性磷的含量。試劑的配制
鉬銻貯存液153ml濃硫酸(分析純，密度1.84 g/ml )，緩慢地倒入約400ml超純水中，攪拌，冷卻，另取IOg鉬酸銨((NH 4 )6 Mo7O24. 4H20，分析純)，溶解于約60°C的300ml 水中，冷卻。然后將硫酸溶液緩緩倒人鉬酸銨溶液中，再加入IOOml 0.5%酒石酸銻鉀 (KSbOC4H4O6 -H2O,分析純)溶液，最后用超純水稀釋至1L，避光貯存。此貯存液含[1%鉬酸銨、2. 75mol/L 硫酸]。鉬銻抗顯色劑1. 50g抗壞血酸(C6H8O6,左旋，旋光度+21° +22°，分析純)溶于IOOml鉬銻貯存液中。此液須隨配隨用。5mg/L磷(P)標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 4394g在50°C烘干的磷酸二氫鉀(KH2PO4,分析純)，加 IOOml水，加5ml濃硫酸(防腐)，用超純水定容到1L，濃度為100mg/L磷(P)，此溶液可以長(zhǎng)期保存。吸取上述溶液IOml于200ml容量瓶中，加水至標(biāo)度，濃度為5mg/L磷(P)標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液不宜久存。測(cè)定方法
1.把發(fā)酵液加入到5ml離心管中，12000rpm，離心;3min，把上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。2.先把發(fā)酵液中的磷濃度稀釋到25 50mg/L。3.吸取0. 5 Iml待測(cè)液于50ml容量瓶中，加水至15 20ml，用吸管加5ml鉬銻抗顯色劑，用水定容到標(biāo)度，搖勻。30min后，在分光光度計(jì)上用2cm光徑比色皿(如含磷量較高，應(yīng)用Icm的比色皿)、700nm波長(zhǎng)比色，以空白試驗(yàn)溶液為參比液，調(diào)吸收值到零，然后測(cè)定待測(cè)顯色液的吸收值(0D值)。在標(biāo)準(zhǔn)線上查出顯色液的磷mg/L數(shù)，顏色在他內(nèi)可保持穩(wěn)定。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取5mg/L磷(P)標(biāo)準(zhǔn)溶液，0、l、2、3、4、5、6ml于50ml 容量瓶中，加水至15 20ml，用吸管加5ml鉬銻抗顯色劑，用水定容到標(biāo)度，搖勻。得到0、 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mg/L磷(P)標(biāo)準(zhǔn)系列顯色液。30min后，在分光光度計(jì)上用2cm 光徑比色皿、700nm波長(zhǎng)比色，得至Ij 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mg/L磷(P)標(biāo)準(zhǔn)系列顯色液。用Omg/L磷標(biāo)準(zhǔn)系列顯色液作參比，調(diào)吸收值到零，由低濃度到高濃度測(cè)標(biāo)準(zhǔn)系列顯色液的吸收值。在方格紙上以O(shè)D值作縱坐標(biāo)，磷mg/L數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖7)。計(jì)算公式
P mg/L =顯色液磷mg/L數(shù)X分取倍數(shù)顯色液磷mg/L含量從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得顯色液的磷mg/L含量顯色液體積50ml
權(quán)利要求
1. 一種聚磷放線菌閻氏鏈霉菌，系鏈霉菌屬，其特征在于命名為閻氏鏈霉菌YIM A116 (.Streptomyces yanii YIM A116)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2011188o
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有較強(qiáng)的聚磷能力的微生物菌株。本發(fā)明所述的聚磷放線菌閻氏鏈霉菌系鏈霉菌屬，命名為聚磷放線菌閻氏鏈霉菌YIMA116(StreptomycesyaniiYIMA116)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCCNOM2011188。本發(fā)明所述的YIMA116菌株經(jīng)PCR技術(shù)，DNA測(cè)序儀分析，該菌株的16SrDNA序列由1411個(gè)堿基組成。本發(fā)明以在優(yōu)化的好氧條件下，改良的ISP2(InternationalStreptomycesProjectMedium2)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)基上清液可溶性磷濃度由208mg/L下降為15.8mg/L，磷去除率達(dá)到92.4％。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102286410SQ201110231780
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者周锫, 崔曉龍, 李治瀅, 段昌群, 王永霞, 肖煒, 董明華, 賴泳紅 申請(qǐng)人:云南大學(xué)