專利名稱：小球藻突變株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)選育的用以生產(chǎn)單細(xì)胞油脂及生物柴油的小球藻突變株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物柴油突出的環(huán)保性和可再生性引起了世界發(fā)達(dá)國家尤其是資源貧乏國家的高度重視。生物柴油主要以生物脂為原料，經(jīng)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯而得。生物柴油產(chǎn)生的二氧化碳僅為傳統(tǒng)柴油的16%到40%，所產(chǎn)生的尾氣微粒排放量也降低了 30%左右，同時不需要對現(xiàn)有柴油發(fā)動機(jī)作任何改裝即可混合或單獨(dú)使用，也不需要改變能源的分配方式以及能源資源的市場，可直接作為民用燃料和內(nèi)燃機(jī)燃料。生物柴油的生物脂原料主要來源于植物油脂、廢油和動物脂肪。其中以產(chǎn)脂微藻·作為原料制備生物柴油，具有其他產(chǎn)脂生物無法比擬的優(yōu)勢(I)微藻很容易繁殖并且培養(yǎng)的時間短，一般高等植物需要生長好幾個月甚至幾年才能完成一代，微藻繁殖一代的時間僅為2-5天；(2)微藻不像高等植物那樣受氣候、季節(jié)變化的影響，可保持純培養(yǎng)，一年四季都可連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，可保證原料供應(yīng)充足；(3)微藻的生長繁殖是在水域中，不依靠土壤，可以在占地有限的設(shè)備上進(jìn)行而得到高產(chǎn)，不與糧爭地；(4)藻類所需酯化反應(yīng)的條件相對較低，使生產(chǎn)成本降低，煉制工藝相對較為簡單。雖然產(chǎn)脂微藻是目前最好的生物柴油工業(yè)生產(chǎn)來源，但它的含油量不高，導(dǎo)致大規(guī)模培養(yǎng)微藻生產(chǎn)油脂成本昂貴，最終使得利用微藻制備生物柴油難以獲得經(jīng)濟(jì)效益，產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程減緩。提高微藻細(xì)胞的油脂含量是目前降低成本的關(guān)鍵，有望從根本上解決生物柴油產(chǎn)業(yè)成本過高的瓶頸問題。因此，一直需要努力不懈的研究，以開發(fā)出產(chǎn)脂量及生物量更高的優(yōu)良藻株，為單細(xì)胞油脂及生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)提供具有競爭力的原材料。為了提高微藻細(xì)胞的產(chǎn)脂量，過去的研究主要集中在以下幾個方面(I)培養(yǎng)基優(yōu)化；(2)培養(yǎng)過程控制；(3)代謝工程方法改造藻株；(4)誘變選育高脂突變株。前兩種方法雖然可在一定程度上有效促進(jìn)藻細(xì)胞的產(chǎn)脂量，但提高的百分比數(shù)有限(通常提高20%以下)，仍無法滿足產(chǎn)業(yè)化規(guī)模開發(fā)的要求。代謝工程方法改造微藻是解決藻細(xì)胞脂含量低的根本方法，需要全面考慮藻株的整體代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點(diǎn)，有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。誘變育種方法研發(fā)成本低，選育過程簡單、耗時少，是提高微藻細(xì)胞產(chǎn)脂量的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種小球藻突變株及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種小球藻突變株小球藻突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917，分類名稱小球藻Chlorella kessleri0小球藻突變株的應(yīng)用所述小球藻突變株為單細(xì)胞油脂高脂突變株，可應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)工藝中。所述小球藻突變株的篩選過程I)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球藻(Chlorella kessleri)采用EMS化學(xué)誘變處理；將小球藻接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35 °C，轉(zhuǎn)速為100-200rpm,光照強(qiáng)度為20-150 μ mol πΓ2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內(nèi)加入10-100 μ I EMS溶液，在黑 暗條件下以18-35°c處理15-180min，而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應(yīng)；所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、
14.7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、(λ 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。2)將步驟I)誘變處理后藻體轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細(xì)胞藻體進(jìn)行擴(kuò)種繼代培養(yǎng)；即將誘變處理后藻體洗滌后觀測其細(xì)胞濃度，根據(jù)細(xì)胞數(shù)將藻體稀釋IO3-IO6倍，分別涂布到高脂定向篩選平板上，置于18-35°c的程控恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細(xì)胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中,在溫度為18-35°C,轉(zhuǎn)速為100-200rpm,光照強(qiáng)度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。3)將上述擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6-20天，待用；將擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至總體積500ml)至終濃度為30-60g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6-20天，使藻細(xì)胞內(nèi)脂的大量合成，而后用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定突變株與野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110%，即突變株為單細(xì)胞油脂高脂突變株；將誘導(dǎo)培養(yǎng)后藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇(體積比硫酸甲醇=I 99)和十九烷酸(C19:0)內(nèi)標(biāo)液混合均勻后，置于50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻后，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCO3水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮?dú)獯蹈扇軇┖螅谜和槎ㄈ?，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。所述氣相色譜條件為采用分流模式，以氮?dú)鉃檩d氣；進(jìn)樣口溫度為2500C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240。。。經(jīng)上述技術(shù)方案選育獲得的高脂突變株小球藻(Chlorella keSSleri)Al，已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917,分類名稱小球藻 Chlorella kessleri。所述的小球藻(Chlorella kessleri)Al CGMCC No. 4917具有典型的綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬的特征性結(jié)構(gòu)。在無菌BG-II、BBM, Basal、CZ-Ml、Kuhl、KMl等培養(yǎng)液中、適宜條件下培養(yǎng)時，其營養(yǎng)細(xì)胞大小約5-10 μ m，球形，綠色，生長快速。所述的小球藻(Chlorella kessleri)Al CGMCC No. 4917生理生化特征如下I.在BG-II、BBM、Basal、CZ-MU Kuhl、KMl等自養(yǎng)培養(yǎng)基和異養(yǎng)培養(yǎng)基中均能生長，也可以混養(yǎng)培養(yǎng)?；祓B(yǎng)時生長最好。混養(yǎng)時最適的碳源是葡萄糖，最好的氮源是硝酸鹽。較低的溶解氧有利于自養(yǎng)生長，而飽和的溶解氧有利于異養(yǎng)生長。適量的鎂能改善其生長。2.營養(yǎng)生長時以孢子繁殖的方式進(jìn)行細(xì)胞增殖，比生長速率為O. 025-0. 065^1,代時為27. 72-10. 66h ;生長最適pH范圍4_10 ;生長最適宜溫度18_35°C ;生長最適光照強(qiáng)度為20-150 μ mol πΓ2 s4 ;搖床振蕩培養(yǎng)時的最適轉(zhuǎn)速100-200rpm。3.在氮限制、磷或硫缺乏、鹽脅 迫等不利環(huán)境條件下，補(bǔ)給足夠的碳源，Chlorellakessleri Al CGMCC No. 4917細(xì)胞迅速變大，脂合成速度加快，脂產(chǎn)量顯著提高，產(chǎn)脂率可達(dá)2. 93mg g—1 h—1,高達(dá)Chlorella kessleri野生株產(chǎn)脂率的2· 14倍。碳水化合物含量也相應(yīng)增加，但總蛋白含量下降。4.細(xì)胞中主要色素為葉綠素a、b，新黃質(zhì)，紫黃質(zhì)，環(huán)氧玉米黃質(zhì)，玉米黃質(zhì)，葉黃素以及β_胡蘿卜素。在高脂誘導(dǎo)、合成過程中，細(xì)胞的色素組成不變，各色素的比例隨誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的不同而有所變化，但色素總量呈下降趨勢。5.在高脂誘導(dǎo)、合成過程中，細(xì)胞的呼吸速率上升，光合速率下降。6.細(xì)胞中脂的主要成分C16、C18系飽和和不飽和脂肪酸，為肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或幾種。本發(fā)明以小球藻的野生株系為材料，采用化學(xué)誘變，脂合成抑制劑篩選的誘變育種方法，結(jié)果得到了一個產(chǎn)脂率高達(dá)出發(fā)株2. 14倍、生理生化特性穩(wěn)定、具有穩(wěn)定遺傳性能的小球藻優(yōu)良突變株。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明與現(xiàn)有的高脂微藻突變株選育方法區(qū)別在于，從誘變處理后的藻株中，直接選育耐受脂合成抑制劑的微藻突變株，因而避免了低脂突變株和脂含量變化不顯著的突變株的干擾，實(shí)現(xiàn)了高脂突變株的定向篩選，避免了盲目性，因此大大提高了選育效率，減少了無用工作量，節(jié)約了研發(fā)成本和研發(fā)時間。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例為本發(fā)明作進(jìn)一步描述。第一步、在無菌操作臺上，挑取固體培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的原始野生株小球藻(Chlorella kessleri)藻落，接種到含IOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在溫度為25°C,轉(zhuǎn)速為150rpm,光照強(qiáng)度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)。Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨，加水至總體積1000ml, pH 6. 5。第二步、取第一步中生長至指數(shù)期的藻液，進(jìn)行EMS化學(xué)誘變處理。在黑暗無菌條件下，取3ml藻液到有蓋的無菌玻璃試管中，加入300μ I EMS溶液(IM)，充分混勻。25°C處理30min，以處理Omin作為空白對照。加入EMS溶液等體積無菌現(xiàn)配的硫代硫酸鈉溶液(10%, w/v)終止誘變反應(yīng)。第三步、將第二步中誘變處理完畢的藻細(xì)胞分別用新鮮無菌Kuhl培養(yǎng)基離心(3000rpm, IOmin)清洗兩次，收集沉淀將其懸浮在3ml新鮮無菌Kuhl培養(yǎng)基中，4°C避光存放。第四步、觀測第三步中懸浮液的細(xì)胞濃度，而后將第三步中懸浮液稀釋至空白對照組細(xì)胞密度，空白對照組細(xì)胞密度約為lX103cellS/ml，取ΙΟΟμ I稀釋的藻液涂布高脂定向篩選平板，將涂布了藻液的500個平板置于25°C的程控恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)。所述配制的高脂定向篩選平板為，配制含有15g/L瓊脂的高起始C/N比(30g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀)的Kuhl培養(yǎng)基，于120°C下高壓蒸汽滅菌20分鐘后冷卻至50°C，加入過濾滅菌后的脂合成抑制劑淺藍(lán)菌素(Cerulenin)至終濃度為200 μ M，輕輕搖動混勻，倒制成高脂定向篩選平板。第五步、將能夠在第四步中生長的菌株與對照(原始小球藻)相比單克隆藻明顯增大的單克隆藻落挑出，懸浮到裝有3ml新鮮無菌Kuhl液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，在溫度為25°C,轉(zhuǎn)速為150rpm,光照強(qiáng)度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng),進(jìn)行擴(kuò)種繼代培養(yǎng)；第六步、將第五步中生長至指數(shù)期的藻液中加入已滅菌的50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至總體積500ml)至終濃度為50g/L，誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)脂的大量合成。 第七步、在第六步中誘導(dǎo)培養(yǎng)6天時,取50ml藻液,用去離子水3000rpm低溫離心洗滌2次，去除上清，藻泥沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。第八步、稱取第七步中所述干藻粉20mg，加入Iml甲苯、2ml I %硫酸一甲醇(體積比為硫酸甲醇=1 99)、0.8ml十九烷酸(C19:0)內(nèi)標(biāo)液，漩渦儀上混勻后，置于50°C振蕩水浴過夜。取出，冷卻后，加入5ml 5% NaCl水溶液、3ml正己烷，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，重復(fù)多次直至提取完全，向收集的上層液中加入6ml 2% KHCO3水溶液，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，用氮吹儀吹干溶劑后，用正己烷定容至lml，去除雜質(zhì)后轉(zhuǎn)移入色譜進(jìn)樣瓶中，4°C保存。將樣品中的有效脂肪酸提取并甲酯化以便利用氣相色譜(GC)測定。利用氣相色譜(GC)法測定第八步所述提取液。色譜條件為DB_23毛細(xì)管氣相色譜柱(30mX0. 25mmX0. 25 μ m);氮?dú)鉃檩d氣；采用分流模式，進(jìn)樣體積為I μ I ;進(jìn)樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240°C。通過比較脂肪酸甲酯與可信標(biāo)準(zhǔn)的停留時間來識別脂肪酸甲酯，并且通過比較脂肪酸甲酯與內(nèi)標(biāo)的峰面積對脂肪酸甲酯進(jìn)行量化(參見表I)。本實(shí)施例以小球藻(Chlorella kessleri)為原始株,經(jīng)化學(xué)誘變劑EMS處理,高脂定向篩選平板初篩，獲得80個高脂突變株新品系，經(jīng)氣相色譜法復(fù)篩，分析結(jié)果顯示，這80個新品系確實(shí)全部為高脂突變株，其中突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值為110-150%的占 9%，為 150-200%的占 43%，200% 以上的占 48%。其中的一個新品系小球藻(Chlorella kessleri)Al,其目的產(chǎn)物脂的產(chǎn)脂率高達(dá)野生株的2. 14倍，而生長狀況與出發(fā)株一致，是一個理想的優(yōu)良突變株，可應(yīng)用于單細(xì)胞油脂及生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)有一定的優(yōu)勢。該高脂突變株新品系于2011年5月27日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，編號為CGMCC No. 4917,該藻株命名為小球藻(Chlorella kessleri) Al CGMCC No. 4917。小球藻(Chlorellakessleri)Al CGMCC No. 4917藻株的脂肪酸組成、各脂肪酸占總脂肪酸的比例、以及產(chǎn)脂率如下表I :表I突變株Al誘導(dǎo)脂合成六天時脂肪酸組成及含量與野生株的比較。
權(quán)利要求
1.一種小球藻突變株，其特征在于小球藻突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917。
2.—種權(quán)利要求I所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于所述小球藻突變株為單細(xì)胞油脂高脂突變株，可應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)工藝中。
3.按權(quán)利要求2所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于所述小球藻突變株的篩選過程 1)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球藻(Chlorellakessleri)采用EMS化學(xué)誘變處理； 2)將步驟I)誘變處理后藻體轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細(xì)胞藻體進(jìn)行擴(kuò)種繼代培養(yǎng)； 3)將上述擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6-20天，待用； 4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定其脂含量以及測定野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110%，即突變株為單細(xì)胞油脂高脂突變株；其高脂突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為 CGMCC No. 4917。
4.按權(quán)利要求3所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于所述步驟I)將小球藻接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35°C，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強(qiáng)度為20-150 μ mol πΓ2s-1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內(nèi)加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗條件下以18-35°c處理15-180min，而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應(yīng)； 所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。
5.按權(quán)利要求3所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于將誘變處理后藻體洗滌后涂布到高脂定向篩選平板上，置于18-35°C的恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細(xì)胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35°C，轉(zhuǎn)速為100-200rpm，光照強(qiáng)度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
6.按權(quán)利要求3所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于將擴(kuò)種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液至終濃度為30-60g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6-20天，使藻細(xì)胞內(nèi)脂的大量合成，而后用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。
7.按權(quán)利要求3或6所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于將誘導(dǎo)培養(yǎng)后藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇和十九烷酸(C19:0)內(nèi)標(biāo)液混合均勻后，置于50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻后，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCO3水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮?dú)獯蹈扇軇┖?，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。
8.按權(quán)利要求3所述的小球藻突變株的應(yīng)用，其特征在于所述氣相色譜條件為采用分流模式，以氮?dú)鉃檩d氣；進(jìn)樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min 的升溫速率從140°C升至240°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)選育的用以生產(chǎn)單細(xì)胞油脂及生物柴油的小球藻突變株及其應(yīng)用。所述小球藻突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No.4917。所述小球藻突變株為單細(xì)胞油脂高脂突變株，可應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)工藝中。
文檔編號C12N15/01GK102888347SQ201110218479
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者王艷, 秦松 申請人:中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所