專利名稱：用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種作為生物標(biāo)志物的內(nèi)源性非編碼小RNA(MicroRNA，miRNA)，特別是涉及用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大腸癌包括直腸癌和結(jié)腸癌，是常見惡性腫瘤之一。美國、加拿大等西歐及北美發(fā)達國家是發(fā)病率最高的國家，發(fā)病率高達35 50/10萬，其發(fā)病率及病死率在惡性腫瘤中僅次于肺癌而居第2位。我國的有關(guān)資料顯示，大腸癌發(fā)病率為15. 7/10萬人口，占惡性腫瘤的第4 6位，而且有逐漸增加的趨勢。我國2005年結(jié)直腸癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別達
17.2萬和9. 9萬，已超過美國。本病的預(yù)后取決于能否早期診斷與手術(shù)根治。然而由于早期大腸癌多無癥狀，大多數(shù)患者確診時，已屆晚期，大腸癌根治術(shù)后5年生存率僅為50. 21%。 癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)是最早發(fā)現(xiàn)的大腸癌血清腫瘤標(biāo)志物,但CEA在大多數(shù)惡性腫瘤血清中均有不同程度升高，特異性較低，對大腸癌的早期診斷價值不高。因此尋找理想的特異性強、敏感性高的腫瘤標(biāo)志物是提高防治的重要手段之一。MicroRNA(miRNA)是在動植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為21 25個核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過切斷降解和翻譯抑制來完成它對靶基因的負調(diào)控。由于它的序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達方式的多樣性，使其在真核基因表達調(diào)控中有著廣泛的作用。作為人類腫瘤信號通路積極的參與者，miRNA不僅扮演著原癌基因和抑癌基因的角色，與腫瘤的轉(zhuǎn)移凋亡也有關(guān)聯(lián)。由于不同的腫瘤顯示出特異性的miRNA表達譜，miRNA在福爾馬林固定的組織中有很高的穩(wěn)定性，所以越來越多的科學(xué)家提出miRNA在血清和血漿中也能有穩(wěn)定的表達，并可以作為潛在的新型腫瘤標(biāo)志物。單個miRNA能夠影響數(shù)百個蛋白質(zhì)表達，21-25個核苷酸的長度也決定了 miRNA沒有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與修飾過程，這些特點都預(yù)示了 miRNA作為生物學(xué)標(biāo)志的優(yōu)越性。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-141在包括人前列腺癌在內(nèi)的上皮細胞性腫瘤患者血清中有明顯的表達上調(diào)，提示miR-141可以作為判斷腫瘤類型的生物學(xué)標(biāo)志。缺乏明顯臨床癥狀及有效生物學(xué)標(biāo)志的卵巢癌患者也可以用血清miRNA檢測來提高早期診斷及早期治療的可能性?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)并證實了 miR-21、92、93、126和29a在腫瘤血清樣本中有明顯的過量表達，而miR-155、127及99b的表達卻明顯降低。此外在彌漫性大B細胞淋巴瘤血清中miR-21的表達明顯增高，增高的miR-21還暗示了較好的無復(fù)發(fā)生存率。這一結(jié)果顯示，檢驗miRNA的特異性表達不僅有助于腫瘤的早期診斷，還可用于病人的預(yù)后判斷。這些研究都充分證實，血清及血漿miRNA的測定是一個檢測癌癥生物學(xué)標(biāo)志物很有前途的領(lǐng)域。因而，開發(fā)一種可輔助腸癌診斷的miRNA生物標(biāo)志物，可以建立一種更敏感，更精確的早期確診乃至早期治療腸癌的方法，具有廣泛的科研價值和臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應(yīng)用，尤其是涉及一組用于檢測腸癌的miRNA生物標(biāo)志物(miR-129-3p、miR-767_3p和miR-877*)、方法及其應(yīng)用。利用該組生物標(biāo)志物可以簡單、快捷地進行腸癌檢測和診斷，以便更好的治療。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一組用于腸癌檢測的miRNA生物標(biāo)志物，是分別如 SEQ IDNO. UNO. 2,NO. 3 所示 miRNA 序列的 miR-129-3p、miR-767_3p 和 miR-877*。該組miRNA在腸癌患者血清中特異性表達上調(diào)。該組生物標(biāo)志物還可以應(yīng)用于腸癌的診斷。另外，本發(fā)明還提供了一種利用上述生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法，具體包括以下步驟(I)收集人血清樣本； (2)提取血清中總RNA (包含miRNA);(3)對miR-129-3p、miR-767_3p和miR-877*生物標(biāo)志物進行反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR(RT-PCR)，并計算每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值；(4)根據(jù)每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值計算P值(腸癌可能概率)，當(dāng)P值大于O. 6621時,則認為是腸癌樣本,小于O. 6621時,則認為是非腸癌樣本。其中，步驟⑴收集人血清樣本的具體操作為將收集的血液樣本放入不含EDTA (乙二胺四乙酸)的試管中，靜置凝固后，取上清，在4°C下600g 900g離心5 15分鐘后，再取上清并在4°C下12000g 16000g離心5 15分鐘，再取上清即得。步驟(2)中的總RNA抽提，可按照商業(yè)化的RNA抽提試劑盒進行操作，并測量RNA的濃度。步驟(3)中的反轉(zhuǎn)錄可按照商業(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行；RT_PCR反應(yīng)也可按照商業(yè)化RT-PCR反應(yīng)試劑盒進行操作，其中，RT-PCR反應(yīng)中，以U6snRNA作為內(nèi)參，并自行設(shè)計U6snRNA的引物，以及使用2_ΔΜ公式來計算每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值，式中Δ Ct=Otiawstf-Ctu6, Ct是域值循環(huán)數(shù)，Ot 是每個生物標(biāo)志物的Ct值，Ctu6是U6snRNA的Ct值。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°C I小時，95°C 5分鐘。RT-PCR反應(yīng)中U6 snRNA的引物序列設(shè)計為 TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT(SEQ ID NO. 4 所示)，miR-129_3p 生物標(biāo)志物的引物序列為AAGCCCTTACCCCAAAAAGC(SEQ ID NO. 5所示)，miR-767_3p生物標(biāo)志物的引物序列為TCTGCTCATACCCCATGGTTTCT (SEQ ID NO. 6所示)，miR-877*生物標(biāo)志物的引物序列為TCCTCTTCTCCCTCCTCCCAG(SEQ ID NO. 7 所示)，其 RT-PCR 反應(yīng)條件為 95°C 15 分鐘，然后進行循環(huán)，循環(huán)條件為94°C 15秒，550C 30秒，70°C 34秒，共40個循環(huán)。步驟(4)中的P值(腸癌可能概率)具體計算方法為根據(jù)Logistic回歸方程式Iogit(P) = -I. 4867-8. 2881* (miR-129_3p 的 PCR 相對定量值)+87. 1459* (miR-767_3p 的PCR相對定量值)+0. 1681* (miR-877*的PCR相對定量值)計算出Iogit⑵，并根據(jù)所得的logit (P)參照表3 (引用自Medcalc軟件使用指南)得出相應(yīng)的P值。再者，本發(fā)明還提供一種用于腸癌檢測的生物標(biāo)志物組檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括常規(guī)實時定量PCR試劑(包括Taq酶、dNTP試劑、熒光試劑、PCR緩沖液、DEPC處理水等)，內(nèi)參U6 snRNA的檢測引物(SEQ ID NO. 4所示)，miR-129-3p、miR-767_3p、miR-877*的檢測引物(SEQ ID NO. 5、N0. 6和NO. 7所示)。其中，該檢測試劑盒的操作方法可參照利用上述生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法進行。本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)顯示腫瘤和正常樣本都具有特異性的血清miRNA表達譜。本發(fā)明中的miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*在正常人和腸癌患者血清中存在差異表達，在腸癌血清中有顯著的表達上調(diào)。另外，本發(fā)明中生物標(biāo)志物組的P值(腸癌可能概率)取
O.6621為臨界值作為判斷腸癌的依據(jù)是根據(jù)具體的實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計公式所得，其中，實驗數(shù)據(jù)包括以下具體實施例中的實施例I和實施例2。因此，可以成為腸癌檢測診斷、病理分級、臨床分期、治療療效判斷的有效工具，具有良好的臨床應(yīng)用前景。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明 圖I是實施例2中的正常血清樣本和腸癌血清樣本中的miR-129_3p(圖1_A)、miR-767-3p (圖 1_B)、miR_877* (圖 1-C)和 miR_634(圖 1-D)表達豐度的比較圖(箱圖)，其中，縱坐標(biāo)為各個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值；圖 2 是實施例 2 中根據(jù) ROC 曲線(receiver operating characteristic curve,接受者操作特性曲線)判定生物標(biāo)志物miR-129-3p (圖2_A)、miR-767_3p (圖2-B)、miR-877*(圖2-C)和miR_634(圖2-D)在腸癌樣本中的診斷價值(R0C曲線圖)；圖3是實施例2中根據(jù)ROC曲線判定生物標(biāo)志物組在腸癌樣本中的診斷價值(R0C曲線圖)。
具體實施例方式實施例I用于腸癌檢測的miRNA生物標(biāo)志物組合的建立I.收集血清樣本采集10個正常人、7個結(jié)直腸癌患者不同病期病人術(shù)前外周血2mL(采血時間一般為早晨或上午)，其中，這17個血清樣本的具體臨床數(shù)據(jù)如表I所示。將采集的2mL外周血迅速轉(zhuǎn)入不含EDTA的普通試管中，在22 25°C (室溫)靜置15 30分鐘至完全凝固。取O. 6ml ImL上清轉(zhuǎn)至潔凈的I. 5mL離心管中，在I小時(室溫條件下)或2小時(4°C條件下)內(nèi)進行以下操作4°C下820g離心10分鐘；再次吸取上清轉(zhuǎn)至潔凈的I. 5mL離心管中，4°C下16000g離心10分鐘，小心吸取上清到新的離心管中，置于_80°C保存?zhèn)溆?。?17個血清樣本的具體臨床數(shù)據(jù)柯麵秘S)
1__-k__56__AJCC PT3N1M0__腸癌
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3一男一 76一AJCCPT3N0M0腸癌—
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14_女63_—正常
15_男61_—正常
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17I 女 I 53 I正常2.血清中總RNA (包含miRNA)抽提每份樣本取400 μ L 血清,使用 Applied Biosystem 公司的 mirVanaTMPARIS 試劑盒，按照說明書步驟抽提總RNA,并取I μ LRNA,使用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer儀器按說明書步驟測量RNA濃度后置于-80°C保存。3.基因芯片雜交取IOOng 所抽提的血清 RNA,使用 Agilent Technologies 公司的 miRNAComplete Labeling and Hyb試劑盒,按照說明書步驟進行樣本標(biāo)記和濃縮,使用AgilentTechnologies公司的人microRNA表達譜芯片進行雜交。使用芯片掃描儀進行圖像掃描以后，把數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneSpring GX11. O軟件進行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理及后續(xù)的分析，將芯片歸一化后的有效數(shù)據(jù)應(yīng)用Pearson correlation進行聚類分析。4.數(shù)據(jù)分析和驗證芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，來源于結(jié)直腸癌的樣本和正常樣本都各自聚集到了一起，提示血清miRNA表達譜可以區(qū)分不同來源的樣本。利用倍數(shù)分析、t檢驗、聚類分析等生物信息學(xué)手段進行差異基因表達分析，探尋可能的差異基因，并進一步用實時定量PCR驗證，最終篩選出在腸癌中特異性表達上調(diào)的4個miRNA——miR-129-3p、miR-634、miR-767-3p和miR-877*。實施例2應(yīng)用生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法I.收集血清樣本采集24例初發(fā)結(jié)直腸癌患者的術(shù)前外周血2mL，并匹配18例正常人血樣本，42例血清樣本的臨床數(shù)據(jù)如表2所示。按照實施例I中的“收集血清樣本”步驟進行操作,但其中的離心條件改為4°C下600g離心15分鐘；再次吸取上清轉(zhuǎn)至潔凈的I. 5mL離心管中，4°C下12000g離心15分鐘，小心吸取上清到新的離心管中，最后得到的血清于-80°C保存?zhèn)溆谩１?42個血清樣本的具體臨床數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一組用于腸癌檢測的miRNA生物標(biāo)志物，其特征在于所述miRNA生物標(biāo)志物是分別如 SEQ ID NO. I、NO. 2、NO. 3 所示 miRNA 序列的 miR-129_3p、miR-767_3p 和 miR-877*。
2.如權(quán)利要求I所述的用于腸癌檢測的miRNA生物標(biāo)志物，其特征在于所述miR-129-3p, miR-767_3p和miR-877*在腸癌患者血清中的特異性表達上調(diào)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的miR-129-3p，miR-767-3p和miR-877*生物標(biāo)志物還應(yīng)用于腸癌的診斷。
4.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用于生物標(biāo)志物組的實時定量PCR反應(yīng)中的內(nèi)參，其特征在于所述內(nèi)參為U6snRNA，其引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如權(quán)利要求I所述的利用生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法，包括步驟 (1)收集人血清樣本； (2)提取血清中總RNA； (3)對miR-129-3p，miR-767-3p和miR-877*生物標(biāo)志物進行反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR反應(yīng)，并計算每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值； (4)根據(jù)每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值計算腸癌可能概率P值，當(dāng)P值大于O.6621時，則認為是腸癌樣本，小于O. 6621時,則認為是非腸癌樣本。
6.如權(quán)利要求5所述的利用生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)收集人血清樣本的具體操作為將收集的人血樣本放入不含EDTA的試管中，靜置凝固后，取上清在4°C下600g 900g離心5 15分鐘后，再取上清，并在4°C下12000g 16000g離心5 15分鐘，取上清即得。
7.如權(quán)利要求5所述的利用生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法，其特征在于所述步驟(3)中的實時定量PCR反應(yīng)中，以U6snRNA作為內(nèi)參，該內(nèi)參的引物序列如SEQ ID NO. 4所示，miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*生物標(biāo)志物組的引物序列分別如SEQ ID NO. 5、NO. 6和NO. 7所示；并使用2_Δα公式來計算每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值，式中Λ Ct一 Ct生物標(biāo)志物_CtU6。
8.如權(quán)利要求5所述的利用生物標(biāo)志物組進行腸癌檢測的方法，其特征在于所述步驟(4)中的腸癌可能概率P值具體計算方法為根據(jù)Logistic回歸方程式Iogit(P)=-I. 4867-8. 2881* (miR-129_3p 的 PCR相對定量值)+87. 1459* (miR-767_3p 的 PCR相對定量值)+0. 1681* (miR-877*的PCR相對定量值)，計算出logit (P)，并根據(jù)所得的logit (P)得出相應(yīng)的P值。
9.如權(quán)利要求I所述的用于腸癌檢測的生物標(biāo)志物組檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒包括常規(guī)實時定量PCR試劑，如SEQ ID NO. 4所示的內(nèi)參U6 snRNA的檢測引物，分別如 SEQ ID NO. 5、NO. 6、NO. 7 所示的 miR-129_3p、miR-767_3p 和 miR-877* 生物標(biāo)志物的檢測引物。
10.如權(quán)利要求9所述的用于腸癌檢測的生物標(biāo)志物組檢測試劑盒，其特征在于所述常規(guī)實時定量PCR試劑包括Taq酶、dNTP試劑、熒光試劑、PCR緩沖液、DEPC處理水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于腸癌診斷的一組miRNA的檢測方法和應(yīng)用，該組miRNA是一組miR-129-3p、miR-767-3p、miR-877*的生物標(biāo)志物，其miRNA序列分別如SEQ ID NO.1，NO.2、NO.3所示；其檢測方法，包括1)收集人血清樣本；2)提取血清中總RNA；3)對生物標(biāo)志物進行反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR反應(yīng)，以U6 snRNA作為內(nèi)參，計算每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值；4)根據(jù)每個生物標(biāo)志物的PCR相對定量值計算P值，當(dāng)P＞0.6621時，認為是腸癌樣本，P＜0.6621時，認為是非腸癌樣本。利用該組生物標(biāo)志物可簡單、快捷地進行腸癌檢測、診斷，以便更好的治療。
文檔編號C12Q1/68GK102899392SQ20111021301
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者劉寒梢, 孟憲欣, 張偉, 張春秀, 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司, 上海伯豪生物技術(shù)有限公司