專利名稱：用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，尤其涉及一種基于表皮角質(zhì)細(xì)胞水平的用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法。
背景技術(shù)：
因為皮膚保濕功能是皮膚護理類化妝品和皮膚保健產(chǎn)品的最基本功能，人們一直在尋找能夠持水保濕/抗干燥的有效添加劑，因此建立方便快捷直觀的評價方法尤為重要。目前，國內(nèi)外對保濕相關(guān)產(chǎn)品功效評價多采用人體測試，而對于保濕相關(guān)的活性添加劑的功效評價手段單一，報道較多的體外方法只有稱重法，即通過稱取重量、計算吸濕率和保濕率來評價添加劑的保濕性。MTT測定(噻唑藍(lán)測定)是一種檢測細(xì)胞活性的方法，是檢測細(xì)胞增殖方面常用手 段。其基本原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿淖仙w粒，后者的生成量與細(xì)胞數(shù)目和/或細(xì)胞活性呈正相關(guān)，用二甲亞砜(DMSO)溶解所，通過檢測光密度值變化，可間接反映細(xì)胞生長及增殖活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞同步化、細(xì)胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍(lán)(MTT)測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P < O. 05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. lm/s-1. Om/s、濕度為15% -50%和 20-30°C溫度下放置 5min-20min。本發(fā)明所使用的術(shù)語“細(xì)胞同步化”意指在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時相之中。為了研究某一時相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡，常需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時相，這就是細(xì)胞同步化技術(shù)。本發(fā)明所使用的術(shù)語“細(xì)胞鋪板”意指將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板的過程。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述細(xì)胞為人表皮角質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基(低限基本培養(yǎng)基)或 RMPI-1640 培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute 培養(yǎng)基 1640)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述藥物可以選自常見保濕劑如甘油、透明質(zhì)酸鈉和中草藥提取物如銀耳多糖等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，加入藥物后細(xì)胞孵育12h 48h。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. 2m/s-0. 6m/s、濕度為20% -40%和20-30°C溫度下放置 6min-15min。根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案，所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. 3m/s、濕度為35%和27°C溫度下放置lOmin。
所述MTT測定步驟按照如下方式進(jìn)行細(xì)胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT液，在5% C02、37°C下孵育4h后于570nm測定。所述MTT液的濃度可以為O. 5mg/ml，每孔加入量可以為500ul。本發(fā)明是基于表皮角質(zhì)細(xì)胞水平的用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其操作方便、可重復(fù)，并可通過客觀的科學(xué)數(shù)據(jù)可以直觀的反映被篩選物質(zhì)的保濕/抗干燥損傷功效。
具體實施例方式實施例I :甘油體外保濕/抗干燥損傷功效的評價I. I試驗材料細(xì)胞人表皮角質(zhì)細(xì)胞株HaCat試劑MEM培養(yǎng)基、O. 25%胰酶、小牛血清、雙抗、PBS (磷酸緩沖液)、MTT材料及儀器24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、濕度計I. 2試驗方法I. 2. I細(xì)胞培養(yǎng)人表皮角質(zhì)細(xì)胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合率 達(dá)80 %以上時，去除培養(yǎng)基，用PBS洗一次，然后加入O. 25%的胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞皺縮變圓時,傾去胰酶,加入含10%小牛血清的MEM輕輕吹打，收集細(xì)胞并離心，計數(shù)細(xì)胞，用MEM將細(xì)胞濃度調(diào)整至適當(dāng)濃度接種至培養(yǎng)瓶中。待生長至融合率達(dá)80%以上時，進(jìn)行下一次傳代。I. 2. 2細(xì)胞同步化細(xì)胞生長至融合率達(dá)80%以上時，加入不含小牛血清的MEM培養(yǎng)基作同步化處理12h。I. 2. 3細(xì)胞鋪板同步化后的細(xì)胞，O. 25%胰酶消化，收集細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至24孔培養(yǎng)板，Iml細(xì)胞懸液每孔，5% C02，37°C培養(yǎng)過夜使貼壁。I. 2. 4 加藥待細(xì)胞貼壁，24h后加入對細(xì)胞增殖無明顯影響的O. 5%、1%和2. 5%濃度的甘油，分別設(shè)立正常對照組(不作干燥處理組)、空白對照組(干燥處理空白組)和加藥組，每組3個復(fù)孔，孵育24h。I. 2. 5干燥處理在25°C下，超凈臺內(nèi)，干燥風(fēng)速O. 3m/s-0. 5m/s，RH%= 45% ±5%，空白對照組和加藥組每孔依次吸去所有培養(yǎng)基，在超凈臺內(nèi)放置IOmin 15min。I. 2. 6MTT 測定干燥處理后的細(xì)胞以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)正常培養(yǎng)24h后，每孔加Λ MTT it (O. 5mg/ml)500ul,5% C02，37°C孵育 4h 后轉(zhuǎn)至 96 孔板，570nm 測定。I. 2. 7實驗結(jié)果分析記錄下各孔抗干燥時間(T)，每組3個復(fù)孔取平均值，實驗結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計軟件STATA 8. O分析，進(jìn)行t檢驗、方差分析等統(tǒng)計學(xué)處理。P < O. 05，表示差異顯著；p < O. 01表示差異非常顯著。并按照以下公式計算出細(xì)胞干燥死亡率)和防護率(％ )。細(xì)胞干燥死亡率) = [1_(空白/藥品)OD值/正?？瞻譕D值]*100% ；防護率(％ )=[(空白組細(xì)胞干燥死亡率-藥品組細(xì)胞干燥死亡率)/空白組細(xì)胞干燥死亡率]*100%。結(jié)果如下
名稱__正常細(xì)胞組空白細(xì)胞組 2.5%甘油組 1%甘油組 0.5%甘油組
細(xì)胞干燥死一49.61%料 32.63%39.08%51.05%
亡率(％)_______
防護率(％) I —___ 34.23%** 21.23%* —_# :空白組相對于正常組，形成干燥損傷，P < O. 01，具有極顯著差異；** :相對于空白組，有極顯著性差異(P < O. 01)* :相對于空白組，有顯著性差異(P < O. 05)。實施例2 :透明質(zhì)酸鈉體外保濕/抗干燥損傷功效的評價體外保濕/抗干燥損傷功效評價實驗按照實施例I方法進(jìn)行，除了 I. 2. I的細(xì)胞培養(yǎng)步驟中以含10%小牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基代替含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基。選取O. 2%、0. 1%、0. 05%和O. 025%幾個對細(xì)胞增殖無明顯影響的濃度進(jìn)行功效測定實驗。結(jié)果如下
名稱正常細(xì)空白細(xì)胞0.2%透明0.1%透明0.05%透明0.025%透 胞組組質(zhì)酸鈉組質(zhì)酸鈉組質(zhì)酸鈉組明質(zhì)酸鈉
_______M_
細(xì)胞干一50.85% 料 13.54% 22.03% 22.08% 36.38%
燥死亡
率(％)___________________
防護率一一 73.37%** 56.68%** 56.58%** 28.46%**(%)_____# :空白組相對于正常組，形成干燥損傷，P < O. 01，具有極顯著差異；** :相對于空白組，有極顯著性差異(P < O. 01)；* :相對于空白組，有顯著性差異(P < O. 05)。實施例3、銀耳多糖體外保濕/抗干燥損傷功效的評價體外保濕/抗干燥損傷功效評價實驗按照實施例I方法進(jìn)行，除了1.2.5的干燥處理步驟在27 °C下進(jìn)行。
選取2%、0. 5%、0. 2%和0. 05%幾個對細(xì)胞增殖無明顯影響的濃度進(jìn)行功效測
定實驗。結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞同步化、細(xì) 胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍(lán)測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P < O. 05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. lm/s-1. Om/s、濕度為15% -50%和20-30°C溫度下放置5min_20mino
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述細(xì)胞為人表皮角質(zhì)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基或RMPI-1640 培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述藥物選自保濕劑或中草藥提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外評估方法，其特征在于，所述保濕劑為甘油或透明質(zhì)酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外評估方法，其特征在于，所述中草藥提取物為銀耳多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，加入藥物后細(xì)胞孵育12h 48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. 2m/s-0. 6m/s、濕度為20% -40%和20-30°C溫度下放置6min-15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外評估方法，其特征在于，所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速O. 3m/s、濕度為35%和27°C溫度下放置lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于體外評估保濕/抗干燥損傷功效的方法，其特征在于，該方法包括以培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞同步化、細(xì)胞鋪板、加入藥物、干燥和噻唑藍(lán)測定步驟，然后使用t檢驗和方差分析對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，p＜0.05，表示差異顯著；所述干燥步驟按照如下方式進(jìn)行吸去培養(yǎng)基后，在干燥風(fēng)速0.1m/s-1.0m/s、濕度為15％-50％和20-30℃溫度下放置5min-20min。本發(fā)明是通過表皮角質(zhì)細(xì)胞水平建立的保濕/抗干燥損傷功效的體外評估方法，其操作方便、可重復(fù)，并可通過客觀的科學(xué)數(shù)據(jù)可以直觀的反映被篩選物質(zhì)的保濕/抗干燥損傷功效。
文檔編號C12Q1/02GK102888439SQ201110201708
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者陳默, 趙亞, 魏少敏 申請人:上海家化聯(lián)合股份有限公司