專利名稱：一種在活性污泥中快速篩選聚磷菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中快速篩選出高效聚磷菌的方法。
背景技術(shù)：
強(qiáng)化生物除磷技術(shù)是污水處理中重要的除磷技術(shù)。如果水體中的磷含量超標(biāo)，會(huì)造成水體中的藻類大量繁殖并形成水華，使水體狀況惡化。所以如何減少對(duì)環(huán)境水體中磷的排放，是防止水體富營(yíng)養(yǎng)化的一項(xiàng)重要措施。強(qiáng)化生物除磷技術(shù)就是應(yīng)用污泥中的微生物在特定的培養(yǎng)條件下超量吸收水體中的磷元素，然后通過排放剩余污泥來降低水中磷的含量。由此可見，強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中微生物的種類和數(shù)量直接影響到系統(tǒng)對(duì)磷的去除效果。序列間歇式活性污泥法(SBR)是污水處理中典型的高效除磷工藝，其活性污泥中有大量的聚磷菌。從中篩選出高效的聚磷菌，并制成微生物菌劑，對(duì)提高污水處理系統(tǒng)中磷的去除效率有重要意義。同時(shí)，篩選出的聚磷菌可以作為基因工程菌的載體，通過基因改造達(dá)到更好的去除污染物的效果。目前對(duì)聚磷菌的分離主要還是常規(guī)的分離方法，主要是應(yīng)用肉湯等培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行涂布或者劃線分離，這種分離方法得到的聚磷菌占總分離菌的比例低，實(shí)驗(yàn)樣品的處理量大，分離過程沒有針對(duì)性。另一方面，在進(jìn)行培養(yǎng)皿分離之前，一般還要進(jìn)行聚磷菌的富集培養(yǎng)過程。富集培養(yǎng)過程一般指在好氧培養(yǎng)條件下，應(yīng)用富磷培養(yǎng)基；在厭氧條件下，應(yīng)用限磷培養(yǎng)基；在兩種培養(yǎng)條件交替進(jìn)行的情況下，使得聚磷菌成為培養(yǎng)液中的優(yōu)勢(shì)菌，然后進(jìn)行涂布或者劃線分離。這樣的培養(yǎng)過程雖然可以得到聚磷菌，但是在培養(yǎng)過程中，樣品中部分聚磷菌的生長(zhǎng)會(huì)由于其它細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物而受到抑制，造成部分聚磷菌分離不成功。所以為了快速得到高效聚磷菌，有必要對(duì)分離方法進(jìn)行改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有聚磷菌篩選過程緩慢，篩選菌株目的性差的問題，進(jìn)而提供一種更為有效、快速、針對(duì)性強(qiáng)的聚磷菌篩選方法及合適的培養(yǎng)基配方。應(yīng)用本方法篩選出的聚磷菌，具有生長(zhǎng)快速、攝磷能力強(qiáng)等特點(diǎn)，適合用于反投加或者進(jìn)一步的分子生物學(xué)改造。本發(fā)明方法的技術(shù)路線是以SBR好氧曝氣結(jié)束時(shí)的活性污泥為樣品，經(jīng)過稀釋后涂布到含有厭氧培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行恒溫厭氧培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)好后，通過影印或者接種針挑取的方法，接種到含有好氧固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上進(jìn)行恒溫好氧培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)好后再次影印或者挑取到含有厭氧固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行恒溫厭氧培養(yǎng)，如此反復(fù)接種數(shù)次，最后接種到含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取顏色為藍(lán)色的菌落作為高效聚磷菌菌株。一種在活性污泥中快速篩選聚磷菌的方法，其具體工藝步驟如下(1)配制篩選用培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)基包括好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基兩種，其組成分別為每升好氧固體培養(yǎng)基包含0. 1 0. 3g的NaAC，4 6g的牛肉膏，8 12g的胰蛋白胨，4 6g的 NaCl，0. 15 0. 2g的KH2PO4,15 18g的瓊脂粉，1 2ml微量元素溶液，其余水，調(diào)節(jié)pH至 6. 8 7. 2 ；每升厭氧固體培養(yǎng)基包含1 3g的NaAC，4 6g的牛肉膏，8 12g的胰蛋白胨，4 6g的NaCl，15 18g的瓊脂粉，1 2ml微量元素溶液，其余水，調(diào)節(jié)pH至6. 8 7.2。菌種保藏培養(yǎng)基為固體LB培養(yǎng)，每升包含IOg的胰蛋白胨，5g的酵母膏(購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，IOg的NaCl，15g的瓊脂，其余為水，調(diào)節(jié)pH至7. 2。以上培養(yǎng)基均需121°C蒸汽滅菌25分鐘。好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基分別在冷卻到48 55°C傾倒培養(yǎng)皿，冷卻待用。保藏培養(yǎng)基擺放成斜面冷卻待用。BCIP溶液含量為每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20°C保存。所述步驟(1)中的微量元素溶液組成為每升水中包含0.4 0.5g的EDTA， 0. 05 0. 06g 的 CaCl2,0. 049 0. 051g 的 FeSO4 · 7Η20，0· 015 0. 016g 的 CuSO4 · 5H20, 0. 016 0. 0163g 的 CoCl2 · 6Η20，0· 021 0. 023g 的 ZnSO4 · 7Η20，0· 05 0. 053g 的 MnCl2 · 4Η20，0· 01 0. 012g 的(NH4)6Mo7O24 · 4H20。(2)取樣稀釋。應(yīng)用滅菌的錐形瓶取SBR系統(tǒng)中好氧狀態(tài)培養(yǎng)的活性污泥50ml，加入無(wú)菌玻璃珠，搖動(dòng)打碎污泥。然后用帶有無(wú)菌紗布的漏斗過濾處理好的污泥，收集濾液。用無(wú)菌生理鹽水稀釋濾液，分別制成稀釋度為10_2、10_3、10_4的稀釋液。(3)涂布。用移液槍分別移取150 200 μ 1的10_3和10_4稀釋液到厭氧固體培養(yǎng)皿中，用涂布器進(jìn)行涂布。然后置于無(wú)氧環(huán)境中恒溫28 38°C培養(yǎng)10 15小時(shí)。(4)篩選。待厭氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，選擇菌落個(gè)數(shù)在30 50個(gè)的培養(yǎng)皿作為母板，通過影印板或者接種針挑取到好氧固體培養(yǎng)皿上。恒溫^ 38°C培養(yǎng)10 15小時(shí)。待好氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)用影印板或者接種針挑取到厭氧固體培養(yǎng)皿上厭氧培養(yǎng)。如此操作循環(huán)4 6次。在篩選操作中可以對(duì)傳代后剩余在培養(yǎng)皿上的菌落進(jìn)行染色觀察 挑取在好養(yǎng)培養(yǎng)狀態(tài)下的菌落進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察菌體內(nèi)聚磷酸鹽形成的異染色粒； 挑取在厭氧培養(yǎng)狀態(tài)下的菌落進(jìn)行蘇丹黑染色，觀察菌體內(nèi)的PHAs顆粒。(5)顯色觀察。在厭氧或好氧固體培養(yǎng)皿上，用移液槍在瓊脂表面加上40 60 μ 1的BCIP溶液， 用涂布器涂勻，靜置0.5 1小時(shí)吸收。通過影印或者接種針挑取的方法把中的菌落接種到含BCIP的培養(yǎng)皿上。28 38°C恒溫培養(yǎng)10 15小時(shí)后，培養(yǎng)皿上會(huì)出現(xiàn)藍(lán)白菌落，其中藍(lán)色菌落為聚磷能力強(qiáng)的菌種。(6)菌種保藏。挑取藍(lán)色菌落到LB試管斜面培養(yǎng)基上劃線，觀 38°C恒溫培養(yǎng)。10 15小時(shí)后 0 4°C冷藏留種。(7)除磷能力考查?？疾炫囵B(yǎng)基組成為每升考察培養(yǎng)基包含4. 5 5. Og NaAC, 0. 3 0. 5gNH4Cl, 0. 15 0. 25g牛肉膏，0. 3 0. 5g胰蛋白胨，0. 07 0. Ig磷酸二氫鉀，1 2ml微量元素溶液，其余為水，調(diào)節(jié)pH至6. 8 7. 2。在250ml錐形瓶中加入IOOml考察培養(yǎng)基，用透氣封口膜包好后滅菌。將得到的菌種分別接入到錐形瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)12 14小時(shí)，使得培養(yǎng)基內(nèi)達(dá)到一定的菌量。然后停止震蕩，靜瓶培養(yǎng)1. 5 2小時(shí)，細(xì)菌在這一階段吸收小分子酸，釋放磷。再次開啟振蕩好氧培養(yǎng)4 6小時(shí)，細(xì)菌吸收磷。最后將得到的菌液一部分測(cè)量OD6tltl值，一部分離心，收集上清液，檢測(cè)其中的磷含量并計(jì)算除磷率。除磷率高的菌種為高效聚磷菌種。所述步驟⑴、⑵、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)中的操作均在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。所述步驟O)中的生理鹽水為濃度0. 85%的氯化鈉溶液，121°C滅菌25分鐘。所述步驟C3)中的無(wú)氧環(huán)境包括a、厭氧培養(yǎng)箱；b、通入氮?dú)獾恼婵崭稍锲鳎籆、加入焦性沒食子酸和氫氧化鈉溶液的密閉容器。所述步驟(7)中測(cè)量菌液的0D_指應(yīng)用可見光分光光度計(jì)，以稀釋3 5倍的空白培養(yǎng)基為參比，在波長(zhǎng)600nm下，測(cè)量菌液的吸光度。所述步驟(7)中的離心指在轉(zhuǎn)速4000 6000轉(zhuǎn)/分的條件下，離心15 20分鐘。通過以上篩選方法，充分利用聚磷菌在好氧吸磷、厭氧釋磷的生理特性，使得篩分更有效率；并且在分離之前把菌落隔離開，可以有效避免菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)干擾；同時(shí)可以實(shí)時(shí)對(duì)要分離的菌株進(jìn)行觀察，確定其生理狀態(tài)，從而挑選出高效聚磷菌菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明保護(hù)不限于下述實(shí)施方式及其組合。實(shí)施實(shí)例1(1)配制篩選培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)基包括好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基兩種， 其組成分別為每升好氧固體培養(yǎng)基包含0. 3g的NaAC，6g的牛肉膏，12g的胰蛋白胨，6g的 NaCl，0. 2g的KH2PO4,18g的瓊脂粉，2ml微量元素溶液，其余蒸餾水補(bǔ)足，調(diào)節(jié)pH至7. 0 ；每升厭氧固體培養(yǎng)基包含3g的NaAC，6g的牛肉膏，12g的胰蛋白胨，6g的NaCl，18g的瓊脂粉， 2ml微量元素溶液，其余蒸餾水補(bǔ)足，調(diào)節(jié)pH至7.0。微量元素溶液組成為每升蒸餾水中包含 0. 5g 的 EDTA,0. 06g 的 CaCl2,0. 051g 的 FeSO4 ·7Η20，0· 016g 的 CuSO4 ·5Η20，0· 016g 的 CoCl2 · 6Η20，0· 023g 的 ZnSO4 · 7Η20，0· 053g 的 MnCl2 · 4Η20，0· 012g 的(NH4)6Mo7O24 · 4H20。 菌種保藏培養(yǎng)基為固體LB培養(yǎng)基，每升包含IOg的胰蛋白胨，5g的酵母膏，IOg的NaCl，15g 的瓊脂，其余蒸餾水補(bǔ)足，調(diào)節(jié)PH至7.0。以上培養(yǎng)基均需121°C蒸汽滅菌25分鐘。好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基分別在冷卻到50°C左右倒培養(yǎng)皿，冷卻待用。保藏培養(yǎng)基擺放成斜面冷卻待用。BCIP溶液含量為每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20°C保存。(2)取樣稀釋。應(yīng)用滅菌的錐形瓶取SBR系統(tǒng)中好氧狀態(tài)培養(yǎng)的活性污泥50ml， 污泥的SVI3tl為38mL/g，MLSS為4. 2g/L。加入無(wú)菌玻璃珠，搖動(dòng)打碎污泥。用帶有無(wú)菌紗布的漏斗過濾破碎的污泥，收集濾液。用無(wú)菌生理鹽水稀釋濾液，分別制成稀釋度為10_2、 10_3、10_4的稀釋液。(3)涂布。用移液槍分別移取200 μ 1的10_3和10_4稀釋液到厭氧固體培養(yǎng)皿中， 用涂布器進(jìn)行涂布。然后置于厭氧培養(yǎng)箱中恒溫30°C培養(yǎng)14小時(shí)。(4)篩選。待厭氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，選擇菌落個(gè)數(shù)在30 50個(gè)的培養(yǎng)皿作為母板，通過影印板接種到好氧固體培養(yǎng)皿上。30°C恒溫培養(yǎng)14小時(shí)。待好氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，通過影印板接種到厭氧固體培養(yǎng)皿上厭氧培養(yǎng)。如此操作循環(huán)6次。在篩選操作中可以對(duì)傳代后剩余在培養(yǎng)皿上的菌落進(jìn)行染色觀察挑取在好養(yǎng)培養(yǎng)狀態(tài)下的菌落進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察菌體內(nèi)聚磷酸鹽形成的異染色粒；挑取在厭氧培養(yǎng)狀態(tài)下的菌落進(jìn)行蘇丹黑染色，觀察菌體內(nèi)的PHAs顆粒。(5)顯色觀察。用移液槍在厭氧固體培養(yǎng)皿表面加上40 μ 1的BCIP溶液，用涂布器涂勻，靜置1小時(shí)吸收。通過影印把好氧的菌落接種到厭氧培養(yǎng)皿上。30°C恒溫培養(yǎng)12 小時(shí)，培養(yǎng)皿上會(huì)出現(xiàn)藍(lán)白菌落，其中藍(lán)色菌落為聚磷能力強(qiáng)的菌種。(6)菌種保藏。挑取藍(lán)色菌落到LB試管斜面上劃線，30°C恒溫培養(yǎng)12小時(shí)。長(zhǎng)好后4°C冷藏留種。(7)除磷能力考察。考察培養(yǎng)基組成為每升考察培養(yǎng)基包含5.0gNaAC，0.5g NH4Cl，0. 25g牛肉膏，0. 5g胰蛋白胨，0. Ig磷酸二氫鉀，2ml微量元素溶液，其余蒸餾水補(bǔ)足，調(diào)節(jié)PH至7. 0。在250ml錐形瓶中加入IOOml考察培養(yǎng)基，用透氣封口膜包好后滅菌。 將得到的菌種分別接入到錐形瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，使得培養(yǎng)基內(nèi)達(dá)到一定的菌量。然后停止震蕩，靜瓶培養(yǎng)2小時(shí)，細(xì)菌在這一階段吸收小分子酸，釋放磷。再次開啟振蕩好氧培養(yǎng)6小時(shí)，細(xì)菌吸收磷。最后將得到的菌液一部分測(cè)量0D_值，一部分4400轉(zhuǎn)/ 分離心15分鐘，收集上清液，檢測(cè)其中的磷含量并計(jì)算除磷率。除磷率高的菌種為高效聚磷菌種。通過篩選，在培養(yǎng)皿上共接種菌株34株，其中有4株菌隨著篩選消失，說明不適應(yīng)篩選條件。剩余的30株中，有7株顯示出藍(lán)色菌落，編號(hào)分別為T1，T5，T16，T23，T37，T38， Ρ21，除磷率都在65%以上，最高的達(dá)到83%。具體除磷率見表1。而一般的分離方法得到的聚磷菌只占分離總菌的15%左右，即使應(yīng)用強(qiáng)化的分離方法，分離得到的聚磷菌占分離總菌的比例也只有43%左右。本方法中，除磷效率在50%以上，即有明顯除磷效果的菌種占到總數(shù)的60%，比例大大提高。尤其以藍(lán)色菌落作為篩選條件，雖然并不能把其中的所有高效菌都顯示出來，但是可以顯示除磷率在65 %以上的比例占到70 %，這樣就可以單獨(dú)挑取藍(lán)色菌株，大大提高菌株的篩選效率，省略除磷效率低的菌株的考察實(shí)驗(yàn)。表1篩選出的菌株對(duì)磷的去除率
權(quán)利要求
1. 一種在活性污泥中快速篩選聚磷菌的方法，其特征在于該方法步驟如下a.配制篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基包括好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基兩種，其組成分別為每升好氧固體培養(yǎng)基包含0. 1 0. 3g的NaAC，4 6g的牛肉膏，8 12g的胰蛋白胨，4 6g的NaCl， 0. 15 0. 2g的KH2PO4,15 18g的瓊脂粉，1 2ml微量元素溶液，其余為水，調(diào)節(jié)pH至·6.8 7. 2 ；每升厭氧固體培養(yǎng)基包含1 3g的NaAC，4 6g的牛肉膏，8 12g的胰蛋白胨，4 6g的NaCl，15 18g的瓊脂粉，1 2ml微量元素溶液，其余為水，調(diào)節(jié)pH至6. 8 ·7.2 ；所述微量元素溶液組成為每升包含0. 4 0. 5g的EDTA，0. 05 0. 06g的CaCl2, 0. 049 0. 051g 的 FeSO4 · 7Η20，0· 015 0. 016g 的 CuSO4 · 5Η20，0· 016 0. 0163g 的 CoCl2 ·6Η20，0· 021 0. 023g 的 ZnSO4 ·7Η20，0· 05 0. 053g 的 MnCl2 ·4Η20，0· 01 0. 012g 的(NH4)6Mo7O24 · 4H20，其余為水；好氧固體培養(yǎng)基和厭氧固體培養(yǎng)基121°C蒸汽滅菌25分鐘；分別冷卻到47 55°C倒培養(yǎng)皿，冷卻待用；5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP溶液含量為每毫升二甲基甲酰胺包含15 20mg BCIP，-20°C保存；b.取樣稀釋應(yīng)用滅菌的錐形瓶取SBR系統(tǒng)中的活性污泥50 100ml，加入無(wú)菌玻璃珠，晃動(dòng)打碎； 用帶有無(wú)菌紗布的漏斗過濾破碎好的污泥，收集濾液；用無(wú)菌生理鹽水稀釋濾液，分別制成稀釋度為IO-2UO-3UO-4的稀釋液；c.涂布用移液槍分別移取150 200 μ 1稀釋度為10_3和10_4的稀釋液到厭氧固體培養(yǎng)皿中， 用涂布器進(jìn)行涂布；然后置于無(wú)氧環(huán)境中恒溫觀 38°C培養(yǎng)10 15小時(shí)；d.篩選待厭氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，選擇菌落個(gè)數(shù)在30 50個(gè)的培養(yǎng)皿作為母板，通過影印板或者接種針挑取到好氧固體培養(yǎng)皿上；恒溫觀 38°C培養(yǎng)10 15小時(shí)；待好氧固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)用影印板或者接種針挑取到厭氧固體培養(yǎng)皿上厭氧培養(yǎng)；如此操作循環(huán)4 6次；e.顯色觀察在厭氧或好氧固體培養(yǎng)皿上，用移液槍在瓊脂表面加上40 60 μ 1的BCIP溶液，用涂布器涂勻，靜置0. 5 1小時(shí)吸收；通過影印或者接種針挑取的方法把d中的菌落接種到含 BCIP的培養(yǎng)皿上；28 38°C恒溫培養(yǎng)10 15小時(shí)后，培養(yǎng)皿上會(huì)出現(xiàn)藍(lán)白菌落，其中藍(lán)色菌落為聚磷能力強(qiáng)的菌種；f.菌種保藏菌種保藏培養(yǎng)基為固體肉湯培養(yǎng)基，每升包含IOg的胰蛋白胨，5g的酵母膏，IOg的 NaCl, 15g的瓊脂，其余為水，調(diào)節(jié)pH至7. 2，分裝到試管加塞子，121°C蒸汽滅菌25分鐘；擺放斜面冷卻，挑取藍(lán)色菌落到LB試管斜面培養(yǎng)基上劃線，觀 38°C恒溫培養(yǎng)10 15小時(shí)， 0 4°C冷藏留種。
全文摘要
一種在活性污泥中快速篩選聚磷菌的方法屬于污水處理除磷技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種在強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中快速篩選出高效聚磷菌的方法。強(qiáng)化生物除磷技術(shù)是污水處理中重要的除磷技術(shù)，聚磷菌在其中起到主要的去除作用。而目前的菌種分離方法效果差、有效菌種數(shù)量少。本發(fā)明應(yīng)用影印的方法，配合不同的培養(yǎng)基，使菌落在厭氧、好氧交替的培養(yǎng)條件中傳代，在傳代過程中應(yīng)用蘇丹黑和甲苯胺藍(lán)染色觀察，并對(duì)其進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取藍(lán)斑菌株為高效除磷菌株。這樣可以解決由于培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件造成的工藝繁瑣、篩選緩慢、針對(duì)性差的問題，能夠快速的在活性污泥中篩選出高效聚磷菌。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102268373SQ20111019959
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月17日
發(fā)明者周明璟, 崔丹紅, 秦振平, 紀(jì)樹蘭 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)