專利名稱：衣原體診斷方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及通過檢測受試者標(biāo)本α-甘露糖苷酶 (α-mannosidase, α -Manase)活性，診斷受試者感染衣原體(Chlamydia)與否的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
衣原體為革蘭氏陰性病原體，在自然界中傳播很廣泛。它沒有合成高能化合物 ATP、GTP的能力，必須由宿主細(xì)胞提供，因而成為能量寄生物，多呈球狀、堆狀，有細(xì)胞壁，以一般寄生在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。從前它們被劃歸病毒，后來發(fā)現(xiàn)自成一類。它是一種比病毒大、 比細(xì)菌小的原核微生物，呈球形，直徑只有0. 3-0. 5um，它無運(yùn)動(dòng)能力，衣原體廣泛寄生于人類，哺乳動(dòng)物及鳥類，僅少數(shù)有致病性。已知的與人類疾病有關(guān)的衣原體有三種，分別是鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)。其中鸚鵡熱衣原體和肺炎衣原體僅引起肺部感染，而沙眼衣原體則可引起眼部、泌尿生殖道以及肺部感染。鸚鵡熱衣原體可通過感染有該種衣原體的禽類，如鸚鵡、孔雀、雞、鴨、鴿等的組織、血液和糞便，以接觸和吸入的方式感染給人類。沙眼衣原體和肺炎衣原體主要在人類之間以呼吸道飛沫、母嬰接觸和性接觸等方式傳播。目前檢測衣原體技術(shù)發(fā)展很快，方法日漸增多，有細(xì)胞培養(yǎng)法、抗原抗體免疫學(xué)檢測、生化檢測以及核酸檢測等方法，但這些方法應(yīng)用于臨床都存在這樣或那樣的問題。由于鸚鵡熱衣原體不常見，臨床上常見的是檢測沙眼衣原體和肺炎衣原體。1.細(xì)胞培養(yǎng)法可選用McCoy細(xì)胞、Hela-229細(xì)胞和BHK細(xì)胞等對(duì)衣原體敏感的長成單層的細(xì)胞，最常用的是經(jīng)放線菌酮處理的單層McCoy細(xì)胞，載體可用玻璃小瓶或塑料培養(yǎng)板，在底部可預(yù)置適當(dāng)大小的蓋玻片。接種標(biāo)本后，1800-3000g離心lh，促進(jìn)原體(Elementary body, EB)進(jìn)入細(xì)胞。吸附lh，吸去上清液，加入含放線菌酮0. 5ug/ml的 1640維持液，35°C CO2孵箱或密封培養(yǎng)，48-7 后取出蓋玻片，漂洗、甲醇固定后，可作吉姆薩(Giemsa)、碘液或單克隆抗體熒光抗體染色，高倍顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察包涵體 (Inclusion body，IB)。必要時(shí)，亦可作盲目傳1-3代。資料上一般說細(xì)胞培養(yǎng)法的敏感性為80% -90% (但實(shí)際采用標(biāo)本不到50% )， 特異性為100%，是目前診斷衣原體感染最可靠的方法，因此是評(píng)價(jià)其他實(shí)驗(yàn)室診斷方法的金標(biāo)準(zhǔn)。這種方法除了靈敏度存在較大的問題，操作過于復(fù)雜也是此法不能用于常規(guī)臨床檢測的重要原因。2.免疫層析法檢測衣原體抗原免疫層析法(Immunochromatography)是二十世紀(jì)九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜(Nitrocellulose membrane)的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。這種方法用于檢測衣原體一般采用雙抗體夾心檢測衣原體脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)抗原。此法由于操作簡單方便，是目前檢測衣原體最常運(yùn)用的技術(shù)。但由于脂多糖分子量小，且在細(xì)胞壁內(nèi)，需要一個(gè)提取方法，可能使抗原提取不出來或抗原被破壞，致使該方法靈敏度偏低。3.微量免疫熒光法微量免疫熒光(Micro-immunofluorescence，MIF)技術(shù)，是檢測衣原體抗體較好的方法。檢測肺炎衣原體抗體，特異性IgM滴度> 1 16和(或) IgG^ 1 512或雙份血清滴度4倍以上升高者，均可診斷急性感染。如IgM<l 16或 IgG^ 1 512，則為既往感染。本方法特異性敏感性均較高，且可用于區(qū)分原發(fā)感染和再感染，是目前最常用且最敏感的血清學(xué)方法。此項(xiàng)技術(shù)可作分離物的血清學(xué)分型，也可嚴(yán)格應(yīng)用于血清流行病學(xué)的研究。它可給人們提供多方面有用的資料臨床致病譜和感染的后果，在不同人群中流行病學(xué)的分布。這是一種主觀性較強(qiáng)的試驗(yàn)，因此觀察者需要有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。一般認(rèn)為此法不適用于診斷衣原體的早期感染，且敏感性和特異性均不高。然而此方法作為流行病學(xué)調(diào)查，頗為簡便。4.核酸檢測技術(shù)這項(xiàng)技術(shù)用于檢測衣原體主要有連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction, LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增試驗(yàn)(Transcription mediated amplification, TMA)、 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)、半巢式聚合酶鏈反應(yīng)-微空板雜交法(Semi-nested polymerase chain reaction, Semi-nested PCR)、巢式聚合酶鏈反應(yīng) (Nested polymerase chain reaction，nPCR)、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)。此類技術(shù)理論上靈敏度和特異性都比較高，但臨床實(shí)際這兩方面都存在較大的問題，而且此類方法操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，不足于應(yīng)用臨床實(shí)際。5.生化法檢測衣原體這是王則宇等在中國專利生殖道沙眼衣原體快速診斷試劑(ZL01133660. 9)介紹的一種方法?？赏ㄟ^檢測衣原體侵入細(xì)胞產(chǎn)生包涵體富含糖原 (Glycogen)，致使分泌物中糖含量明顯增加，可通過檢測糖含量來間接地檢測衣原體的存在。此法雖然相比細(xì)胞培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immuno-sorbent assay, ELISA)以及核酸檢測等操作簡單，但由于還需要高溫加熱和離心等過程，與免疫層析法相比還是過于復(fù)雜。該技術(shù)的靈敏度雖然比較高，但特異性不足，比如念珠菌存在可造成假陽性，特別在女性月經(jīng)周期和孕期，陰道上皮糖含量明顯增加，也可能會(huì)造成假陽性。鑒于沙眼衣原體和肺炎衣原體是人體健康的危害，以及現(xiàn)有檢測衣原體方法存在的缺點(diǎn)，研究設(shè)計(jì)一種適合臨床檢測需要的衣原體快速檢測方法顯得尤為迫切！發(fā)明概述本發(fā)明人意外地研究發(fā)現(xiàn)，可以通過檢測受試者標(biāo)本α-甘露糖苷酶活性，直接診斷受試者標(biāo)本衣原體的有無?；谶@一意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種診斷衣原體感染的新方法，包括下列步驟a)收集受試者的標(biāo)本；b)檢測標(biāo)本中的α -甘露糖苷酶活性；
c) α -甘露糖苷酶活性高于診斷實(shí)驗(yàn)臨界值時(shí)，受試者即可診斷為衣原體陽性患
者ο本發(fā)明診斷方法中的衣原體為沙眼衣原體或肺炎衣原體，受試者標(biāo)本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宮頸分泌物、陰道分泌物、痰液或咽分泌物。本發(fā)明還涉及一種衣原體診斷的試劑盒，包括選自α-甘露糖苷酶顯色底物或甘露糖苷酶產(chǎn)熒光底物的檢測α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，這種試
劑盒用途是診斷衣原體的有無。發(fā)明詳述α -甘露糖苷酶是指，按照國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) ^ M PJ,^ EC. 3. 2. 1. M的酶，它主要參與甘露糖α-1，2、α-1，3、α-1，6糖苷鍵的水解過程。α-甘露糖苷酶為一個(gè)酶家族的總稱，有多種類型，各有不同的底物特異性，位于細(xì)胞不同的部位。 根據(jù)來源以及物理化學(xué)特性，主要是最適反應(yīng)的ΡΗ，把它們分為3大類酸性(溶酶體)、弱酸性(高爾基體)和中性(胞漿)。溶酶體或酸性α-甘露糖苷酶是大多數(shù)組織中占優(yōu)勢的α-甘露糖苷酶，具有酸性的最適ρΗ 4. 0-4. 5，相對(duì)較穩(wěn)定，Zn2+能激活其活性，位于細(xì)胞的溶酶體中。中性或胞漿α-甘露糖苷酶不穩(wěn)定，它們需要中性的最適ρΗ，金屬離子對(duì)此酶活性無大的影響。弱酸性或高爾基體α-甘露糖苷酶的最適ρΗ為5. 5-6.0，介于酸性與中性之間，能被鈣離子激活而被發(fā)現(xiàn)，主要位于高爾基體內(nèi)。目前有關(guān)α-甘露糖苷酶的研究文獻(xiàn)(Kukuruzinska MA, Lennon K. Protein N-glucosylation :molecular genetics and functional significance [J]· Crit Rev Oral Biol Med, 1998,9(4) :415-448 ；Nilssen 0, Berg T， Riise HM, et al.alpha-Mannosi-dosis :functional cloning of the lysosomal alpha-mannosidase cDNA and identifyca-tion of a mutation in two affected siblings [J]. Hum Mol Genet,1997,6(5) :717-726 ;Pittis MG, Montalvo ALE, Heikinheimo P, et al. Funtional characterization of four novel MAN2B1 mutations causing juvenile onset alpha-mannosidosis[J] · Clin Chim Acta,2007,375 :136-139 ; Kuokkanen E, Riise HM,Smith W,et al. Molecular and cellular characterization of novel{alpha}-mannosidosis mutations[J]. Hum Mol Genet,2011, published online) 主要涉及由α-甘露糖苷酶發(fā)生障礙導(dǎo)致的疾病，包括有先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血 II 型(Congenital Dyserythropoietic Anemia Type II，HEMPAS)和甘露糖苷C積癥 (α-Mannosidosis)，沒有涉及衣原體與α-甘露糖苷酶的關(guān)系。雖然文獻(xiàn)(Greenwell P, Kakourou G, Rughooputh S. Analysis of glycosidases activity in Chlamydia trachomatis L2 serotype. Internet Journal of Medical Update,2006, Jan-Jun,1(1) 25-32)研究了 Chlamydia trachomatis, SA2F(L2)包括α-甘露糖苷酶在內(nèi)的^^一種糖苷酶活性，雖然指出α-甘露糖苷酶可能存在Chlamydia trachomatis, SA2F (L2)細(xì)胞表面，而且活性比較高，但沒有提及是否可以通過檢測α -甘露糖苷酶活性來指示Chlamydia trachomatis, SA2F(L2)的存在，更沒有研究沙眼衣原體其它血清型、肺炎衣原體以及機(jī)體相應(yīng)部位標(biāo)本可能存在的其他微生物是否有α-甘露糖苷酶活性，是否可以通過檢測 α-甘露糖苷酶活性來直接指示受試者標(biāo)本中衣原體的存在。
發(fā)明人意外地研究發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體和肺炎衣原體都有很強(qiáng)的α -甘露糖苷酶活性，而受試者相應(yīng)部位標(biāo)本可能存在的其他微生物如淋球菌、解脲支原體、人型支原體、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔氏念珠江菌等都不具有或僅具有極弱的α-甘露糖苷酶活性，因此可以通過檢測受試者標(biāo)本的α-甘露糖苷酶活性， 直接診斷受試者是否感染衣原體。正是基于這一意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種診斷衣原體感染的新方法，包括下列步驟a)收集受試者的標(biāo)本；b)檢測標(biāo)本中的α -甘露糖苷酶活性；c) α -甘露糖苷酶活性高于診斷實(shí)驗(yàn)臨界值時(shí)，受試者即可診斷為衣原體陽性患
者ο本發(fā)明診斷方法中的衣原體為沙眼衣原體或肺炎衣原體，受試者標(biāo)本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宮頸分泌物、陰道分泌物、痰液或咽分泌物。本發(fā)明還涉及一種衣原體診斷的試劑盒，包括選自α-甘露糖苷酶顯色底物或甘露糖苷酶產(chǎn)熒光底物的檢測α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，這種試
劑盒的用途是診斷衣原體的有無。適合于本發(fā)明目的的α -甘露糖苷酶酶促底物，是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的能夠證明α-甘露糖苷酶酶促活性的任何底物，這樣的底物可以是顯色底物或產(chǎn)熒光的底物。作為實(shí)例，可以提及基于吲哚酚衍生物的顯色底物，基于萘酚衍生物的顯色底物，基于萘胺衍生物的顯色底物，基于硝基苯衍生物的顯色底物，基于苯胺衍生物的顯色底物，基于苯酚衍生物的顯色底物，基于傘形酮衍生物的產(chǎn)熒光的底物以及基于香豆素衍生物的產(chǎn)熒光的底物。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案采用的α -甘露糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的顯色底物，這樣的吲哚酚衍生物的實(shí)例包括對(duì)6-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、6-溴-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5_溴-4-氯-3-吲哚-a_D-甘露糖苷、 5-溴-6-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-N-甲基-a_D-甘露糖苷，其中對(duì)于5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷是特別優(yōu)選的。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案采用的α-甘露糖苷酶酶促底物是基于苯胺衍生物的顯色底物，這樣的苯胺衍生物的實(shí)例包括對(duì)氨基苯基-a-D-甘露糖苷(4-氨基苯基-α -D-甘露糖苷)、鄰氨基苯基-α -D-甘露糖苷(2_氨基苯基_ α -D-甘露糖苷)、間氨基苯基-α -D-甘露糖苷(3-氨基苯基-α -D-甘露糖苷)，其中對(duì)氨基苯基_ α -D-甘露糖苷是特別優(yōu)選的。使用本發(fā)明的方法，可以把α-甘露糖苷酶酶促底物固化到固相載體以于化學(xué)的形式形成產(chǎn)品進(jìn)行檢測，也可以把α-甘露糖苷酶酶促底物配成溶液以液體的形式形成產(chǎn)品進(jìn)行檢測。這兩種形式的產(chǎn)品都可以通過儀器進(jìn)行自動(dòng)化或半自動(dòng)化操作，而且α-甘露糖苷酶酶促顯色底物的這兩種形式產(chǎn)品還可以直接通過肉眼觀察顏色變化判斷結(jié)果。承接固化α-甘露糖苷酶酶促底物的固相載體可以是棉漿紙、濾紙、玻璃纖維或塑料等。針對(duì)不同的α -甘露糖苷酶酶促顯色底物，為達(dá)到顯色或顏色變化或提高靈敏度的效果，可以采用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法，比如針對(duì)基于吲哚酚衍生物的顯色底物可以直接顯色，也可以添加重氮鹽(Diazonium salts)來增強(qiáng)顯色的靈敏度；針對(duì)基于萘酚衍生物的顯色底物，可以添加重氮鹽或氧化劑(Oxidant)來顯色；針對(duì)基于萘胺衍生物的顯色底物，也可以添加重氮鹽或氧化劑來顯色；針對(duì)基于硝基苯衍生物的顯色底物，可以制造堿性環(huán)境來顯色；針對(duì)基于苯胺衍生物的顯色底物，也可以添加重氮鹽或氧化劑來顯色；針對(duì)基于苯酚衍生物的顯色底物，同樣可以添加重氮鹽或氧化劑來顯色。針對(duì)基于吲哚酚衍生物的α-甘露糖苷酶酶促顯色底物，可以采用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的重氮鹽來增強(qiáng)顯色的靈敏度，比如固紫B鹽(Fast violet B salt)、固藍(lán)B鹽 (Fast violet B salt)等。針對(duì)通過添加氧化劑來顯色的α -甘露糖苷酶酶促顯色底物，可以采用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的氧化劑，比如過氧化氫(Hydrogen peroxide)、過氧化脲⑴rea hydrogen peroxide)、三氯化鐵(Ferric trichloride)等。針對(duì)通過添加氧化劑來顯色的α -甘露糖苷酶酶促顯色底物，標(biāo)本中可能存在的氧化劑可能影響檢測的特異性，可以采用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法，比如添加還原劑，添加的還原劑可以有維生素C (Vitamin C)、維生素E (Vitamin Ε)、維生素K (Vitamin K)、巰基乙醇(Thioglycol)等。通過本發(fā)明方法，不僅實(shí)現(xiàn)衣原體的快速檢測，而且能夠解決目前細(xì)菌鑒定儀不能診斷鑒別衣原體的缺點(diǎn)，把本發(fā)明的方法用于細(xì)菌鑒定儀，豐富細(xì)菌鑒定儀的功能。
實(shí)施例實(shí)施例一一、本發(fā)明方法試劑制備配制IOOmM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4. 0，內(nèi)含1% [v/v] Triton X-100)，即得α-D-甘露糖苷酶檢測樣品處理試劑。稱5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷(SIGMA公司，CAS號(hào)1252四-64_3) 用IOOmM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0，內(nèi)含v/vTriton X-100)溶解后，使 5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷濃度達(dá)到lmg/ml，混合均勻，即得α -D-甘露糖苷酶檢測顯色試劑。二、本發(fā)明試劑使用方法1、分泌物標(biāo)本拭子，置于一潔凈試管中，加入α-D-甘露糖苷酶檢測樣品處理試劑300-400μ 1，充分?jǐn)嚢枋米?，使拭子中的分泌物充分溶解于樣品處理試劑中?、取檢測條，每孔加入α -D-甘露糖苷酶檢測顯色試劑50_100 μ 1，再加入上述已溶解分泌物的樣品處理試劑50 μ 1，振蕩混合均勻，室溫放置10分鐘。3、目測或儀器判讀結(jié)果，其中目測根據(jù)顏色變化與否，儀器判讀根據(jù)檢測值與預(yù)置界值的差異與否。實(shí)施例二 一、本發(fā)明方法試劑制備稱對(duì)氨基苯基-α -D-甘露糖苷(北京凱森萊公司，CAS號(hào)34213_86_0)用IOOmM 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(ΡΗ4.0，內(nèi)含V/VTriton X-100)溶解后，使其濃度達(dá)到2mg/ml，混合均勻。按15ul/片加到5mm邊長的制片上，干燥過夜，即得α-D-甘露糖苷酶檢測試劑。稱氯化鈉用純化水溶解后，使氯化鈉濃度達(dá)到0. 9%w/v，往此溶液中加維生素 C，混合均勻，使維生素C的濃度達(dá)到0.125%w/v，即得α-D-甘露糖苷酶檢測樣品處理 A試劑。稱過氧化脲用0. 05%w/v酒石酸(Tartaric acid)溶液溶解后，使過氧化脲的濃度達(dá)到0.125%w/v，即得α-D-甘露糖苷酶檢測樣品處理B試劑。二、本發(fā)明試劑使用方法1、分泌物標(biāo)本拭子，置于一潔凈試管中，加入α -D-甘露糖苷酶檢測樣品處理A試劑4滴(約200 μ 1)和α -D-甘露糖苷酶檢測樣品處理B試劑4滴(約200 μ 1)，充分?jǐn)嚢枋米?，使拭子中的分泌物充分溶解于樣品處理試劑中?、取檢測條，每孔加入上述已溶解分泌物的樣品處理試劑1滴(約50 μ 1)，振蕩混合均勻，室溫放置10分鐘。3、目測或儀器判讀結(jié)果，其中目測根據(jù)顏色變化與否，儀器判讀根據(jù)檢測值與預(yù)置界值的差異與否。臨床基本情況以實(shí)施例二的試劑為例。306例鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院性病門診患者189例和婦科門診患者117例，其中男性122例，用無菌拭子取尿道分泌物或前列腺按摩液各三份(尿道分泌物101例，前列腺按摩液21例)，女性184例，通過擴(kuò)陰器，用無菌拭子取宮頸分泌物或陰道分泌物各三份(宮頸分泌物1 例，陰道分泌物60例)。這些患者就診前一周沒有使用任何抗生素。其中一份標(biāo)本采用本發(fā)明方法檢測α-D-甘露糖苷酶來指示沙眼衣原體的有無，一份標(biāo)本采用細(xì)胞培養(yǎng)法直接檢測沙眼衣原體的有無，另一份標(biāo)本采用連接酶鏈反應(yīng) (Ligase chain reaction,LCR)檢測沙眼衣原體核酸來指示沙眼衣原體的有無。沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)采用以McCoy細(xì)胞為宿主細(xì)胞、經(jīng)放線菌酮處理的方法，LCR采用美國雅培公司 (Abbott) LCx分析儀及相應(yīng)的試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。由于沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)雖然特異性可達(dá)100%，但其敏感性受各種因素的影響較大。因此本次臨床得結(jié)果分析判斷標(biāo)準(zhǔn)采用“擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)”(Expanded Gold Standard)即所有細(xì)胞培養(yǎng)陽性者均為真陽性，任意兩種試驗(yàn)同時(shí)為陽性者判為真陽性。三種沙眼衣原體檢測方法檢測306例標(biāo)本結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種衣原體診斷方法，包括下列步驟a)收集受試者的標(biāo)本；b)檢測標(biāo)本中的α-甘露糖苷酶活性；c)α -甘露糖苷酶活性高于診斷實(shí)驗(yàn)臨界值時(shí)，受試者即可診斷為衣原體陽性患者。
2.如權(quán)利要求書1所述的衣原體診斷方法，其特征在于衣原體為沙眼衣原體或肺炎衣原體。
3.如權(quán)利要求書1所述的衣原體診斷方法，其特征在于受試者標(biāo)本為尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宮頸分泌物、陰道分泌物、痰液或咽分泌物。
4.一種衣原體診斷的試劑盒，包括選自α-甘露糖苷酶顯色底物或α-甘露糖苷酶產(chǎn)熒光底物的檢測α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物。
5.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒的用途是診斷衣原體的存在。
6.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒根據(jù)受試者標(biāo)本的不同，增減標(biāo)本處理液、增強(qiáng)酶反應(yīng)的增強(qiáng)劑以及祛除干擾的抗干擾劑。
7.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒可以通過儀器進(jìn)行自動(dòng)化或半自動(dòng)化操作，而且α-甘露糖苷酶酶促顯色底物的這種形式檢測試劑盒還可以直接通過肉眼觀察顏色變化判斷結(jié)果。
8.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒使用的顯色底物可以是基于吲哚酚衍生物的顯色底物，或基于萘酚衍生物的顯色底物，或基于萘胺衍生物的顯色底物，或基于硝基苯衍生物的顯色底物，或基于苯胺衍生物的顯色底物，或基于苯酚衍生物的顯色底物。
9.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒使用的熒光底物可以是基于傘形酮衍生物的產(chǎn)熒光的底物，或基于香豆素衍生物的產(chǎn)熒光的底物。
10.如權(quán)利要求書4所述的衣原體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒可以把α-甘露糖苷酶酶促底物固化到固相載體以干化學(xué)的形式進(jìn)行檢測，也可以把α-甘露糖苷酶酶促底物配成溶液以液體的形式進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷衣原體感染的新方法，具體而言包括下列步驟a)收集受試者的標(biāo)本；b)檢測標(biāo)本中的α-甘露糖苷酶活性；c)α-甘露糖苷酶活性高于診斷實(shí)驗(yàn)臨界值時(shí)，受試者即可診斷為衣原體陽性患者。本發(fā)明診斷方法中的衣原體為沙眼衣原體或肺炎衣原體，受試者標(biāo)本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宮頸分泌物、陰道分泌物、痰液或咽分泌物。本發(fā)明還涉及可用于所述方法的試劑盒，包括選自α-甘露糖苷酶顯色底物或α-甘露糖苷酶產(chǎn)熒光底物的檢測α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，這種試劑盒用途是診斷衣原體的有無。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102286608SQ20111015111
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者寇潔, 崔晶, 王中全, 王則宇 申請人:王則宇