專利名稱：針對三種甘薯病毒的融合基因及其干涉載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甘薯病毒的基因和干涉載體，屬于生物工程技術領域，特別是涉及針對三種甘薯病毒的融合基因及其干涉載體。
背景技術：
甘薯是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源作物，近年來甘薯的用途越來越受到人們的關注。甘薯病毒病是影響甘薯生產的重要限制因素之一，病毒病的感染可造成甘薯產量下降、品質變劣和種性退化，一般可減產30%_50%。甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle ri/YAs，SPFMV)、甘薯潛隱病毒potato latent ri/YAs，SPLV)和甘薯G病毒(5’呢對potato virus G, SPVG)是危害甘薯的三種主要病毒，這三種病毒分類上都屬于馬鈴薯Y屬(/^ij^irm)病毒。在田間這幾種病毒常常混合侵染，對甘薯生產造成嚴重危害。對甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學防治方法，利用基因工程技術構建RNA干涉(RNAi)載體，培育抗病毒轉基因甘薯是防治病毒病危害的最有效方法之一。經檢索，目前還未發(fā)現(xiàn)利用RNA干涉技術防治甘薯病毒病危害的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題克服現(xiàn)有防治甘薯病毒病的缺點，提供一種針對三種甘薯病毒的融合基因，還提供了對三種病毒有明顯干擾抑制作用的RNA干涉載體。本發(fā)明的技術方案
針對三種甘薯病毒的融合基因序列為SEQ1，命名為SPFLG。三種甘薯病毒的RNA干涉載體，其構建方法包括以下步驟
(1)引物設計根據(jù)三種甘薯病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的保守區(qū)域設計兩對引物， 具體如下
SPFLG-XbaI 5' -CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’， SPFLG-SpeI 5' -AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3'； SPFLG-KpnI 5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3，， SPFLG-ClaI 5' -AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；
(2)甘薯病毒RNA干涉載體構建
將權利要求1所述的SPFLG基因克隆到T載體上，命名為SPFLG-T，以SPFLG-T為模板， 分別以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 為引物，進行 PCR 擴增，將獲得的目的基因SPFLG分別用損al和RKpnl和CZaI酶切后，以反向重復的方式分別克隆到pBlue NiMntron載體的內含子兩側；然后利用損aI和^^I進行雙酶切，回收含有反向重復目的基因的片段，將其克隆到中間載體PR0K219上，所述含有反向重復目的基因的片段位于35S啟動子的下游、NOS終止子的上游，命名為pROKSPFLG ；用和歷/7dIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S啟動子、反向重復片段和NOS終止子的目的片段，克隆到植物表達載體pBmi9上，命名為pBINSPFLG。所述PCR擴增反應程序為94 V預變性5min，94 V變性30s，58 V退火30s，72 °C延伸40s，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。所述三種甘薯病毒為甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒和甘薯G病毒。所述的RNA干涉載體在防治病毒甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒和甘薯G病毒中的應用。本發(fā)明的積極有益效果
(1)本發(fā)明根據(jù)SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的保守區(qū)域設計兩對引物，以質粒SPFLG-T為模板，將融合基因SPFLG以反向重復的方式克隆到pBlue MRIntron載體的內含子兩側，再將含有內含子的反向重復片段插入到中間載體pR0K219 上，將包括35S啟動子、反向重復片段和NOS終止子目的片段克隆到植物表達載體PBIN19 上，成功構建了含有三種病毒CP基因保守區(qū)反向重復序列的RNA干涉載體。(2)將本發(fā)明的RNA干涉載體利用凍融直接轉化法轉入土壤農桿菌EHA105中，利用農桿菌浸潤法測定了該載體對三種/^ij^irMM病毒的干擾作用。結果表明，構建的RNA 干涉載體對SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒有明顯的干擾作用，農桿菌浸潤后，三種病毒的含量明顯減低，說明構建的RNAi載體能抑制三種甘薯病毒基因的表達。(3)本發(fā)明針對甘薯上普遍發(fā)生的三種病毒，成功構建了對三種病毒有明顯干擾抑制作用的RNAi載體，為培育同時抗三種病毒的轉基因甘薯奠定了基礎。


圖1 目的片段SPFLG的PCR擴增圖。圖中，M :DL2000分子量標記，1 SPFLG PCR擴增產物。圖2 pROKSPFLG經損a I和式ot I酶切驗證圖。圖中，M :DL2000分子量標記，1 pROKSPFLG經損aI和幻7/ I酶切的產物。圖 3 :pBINSPFLG經^boRI 禾口歷'/ dIII 酶切驗證圖。M :DL2000分子量標記，1 :pBINSPFLG經&0RI和歷idIII酶切的產物。圖4 甘薯葉片經農桿菌浸潤前后SPFMV病毒含量的變化。圖5 甘薯葉片經農桿菌浸潤前后SPVG病毒含量的變化。圖6 甘薯葉片經農桿菌浸潤前后SPLV病毒含量的變化。圖4、圖5、圖6中，橫坐標表示浸潤時間，縱坐標表示樣品在0D405時的吸光值，代表病毒的含量，黑色實柱表示未處理的病毒含量，白色實柱表示處理后的病毒含量。
具體實施例方式實施例1 針對三種甘薯病毒的融合基因及其干涉載體 (一)材料與方法
1、SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒融合基因的設計與合成
分析SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒CP基因的保守區(qū)域，各選取200 bp左右的片段， 其中SPFMV CP基因保守區(qū)l^bp，位于其CP基因的第748-945bp處；SPLV CP基因保守區(qū)189bp，位于其CP基因的第691-879bp處；SPVG CP基因保守區(qū)l^bp，位于其CP基因的第868-1065bp處。按照SPFMV-SPLV-SPVG的順序進行融合，作為完整的目的基因，命名為 SPFLG。為了便于載體的構建，在該基因的5 ‘端引入IhI位點，在其3 ‘端引入分el位點，并各加三個保護堿基，以使酶切位點更加有效。合成的基因長度為60;3bp，基因合成后克隆到T載體上，命名為SPFLG-T?；蛉蛄腥缦?br> 1 CCTTCTAGAT ACGAGCTGCA TTCAACCACC CCTGCACGTG CAAAAGAAGC ACATTTACAG
61 ATGAAGGCAG CCGCGCTTAA GAATGCGAAA AATCGGTTGT TTGGTTTGGA CGGAAACGTC121TCCACGCAAGAAGAAGATACGGAGAGGCACACGACAACTGATGTTACTAGAAATATACAT181AACCTCTTAGGAATGAGGGGTGTGCAAACATCACGCACACCCATTCGCGCCAAGGAAGCA241TACTTCCAGATGAAAGCTGTAGCGCTCACAAATACACATCATCGGCTGTTCGGTCTGGAT301GGAAATGTCTCAACCACTGAGGAAAACACCGAGCGGCATACTGCAACAGATGTGGACCGG361AACATACACACACTACTTGGAATGCGTGGCATCCATTATGAGCTGCACTCGAACACTCCT421GTTCGGGCCAGAGAGGCACATATGCAAATGAAAGCAGCAGCACTTAAGAACGCACAAAAT481CGGTTGTTTGGTTTGGACGGAAACGTCTCCACGCAGGAAGAAGATACGGAGAGGCATACA541ACGACTGATGTTACAAGGAATATACATAACCTCTTGGGTATGAGGGGTGTGCAGACTAGT601ACT。注序列中劃線部分分別代表IhI和分el的酶切位點。2、RNAi載體的構建 (1)引物的設計與合成
根據(jù)SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒外殼蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守區(qū)域設計兩對引物，用于載體的構建，引物由上海生工生物工程有限公司合成，設計的兩對引物如下 SPFLG-XbaI 5’-CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’ ， SPFLG-SpeI 5，-AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3，， SPFLG-KpnI 5，-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'， SPFLG-ClaI 5’-AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ 。注引物序列中的小寫字母分別代表損al、分el、&7/7l和Cleil的酶切位點。(2)酶和試劑(盒)
大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5a菌株和農桿菌EHA105菌株由本實驗室保存； UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)等購自上海生工生物工程有限公司；pMD18-T、DL2000 marker、dNTP、位-7 《酶、T4 DNA連接酶和各種限制性內切酶等購自TaKaRa公司；其它常用試劑為國產分析純。(3)三種甘薯病毒RNAi載體的構建
以質粒 SPFLG-T 為模板，分別以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 為引物，進行 PCR擴增，PCR 反應體系為 50μ1，包括 5μ1 10XPCR buffer、2. 5 U Taq酶、 μ 濃度各為10mM&dNTP混合物、 μ 上游引物、 μ 下游引物，其中引物濃度均為ΙΟμΜ，用 μ SPFLG-T質粒作模板，用ddH20補足至50μ1。PCR擴增反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0 將獲得的目的基因SPFLG分別用XbaY和分el RKpnl和Cla\酶切后，以反向重復的方式分別克隆到pBlue NiMntron載體的內含子兩側；經損al和^酶切后，回收含有反向重復目的基因的片段，將其克隆到中間載體PR0K219上，所述含有反向重復目的基因的片段位于35S啟動子的下游、NOS終止子的上游，命名為pROKSPFLG -MEcoRl和歷/ dIII酶切 pROKSPFLG后，回收包括35S啟動子、反向重復片段、NOS終止子的目的片段，克隆到植物表達載體pBmi9上，命名為pBINSPFLG。(4) RNAi載體對三種病毒抑制效果的測定
利用直接凍融轉化法將pBINSPFLG載體轉入土壤農桿菌EHA105菌株中，取單菌落接種于:3ml LB培養(yǎng)基[含有卡那霉素(100mg/ml Kan)和利福平(100mg/ml Rif)]中，28°C 振蕩培養(yǎng)過夜；取Iml活化后的菌液接入50ml LB培養(yǎng)基(含有100mg/ml Kan和100mg/ml Rif)中振蕩培養(yǎng)至合適濃度(0D600約0. 8-1. 0) ； 4°C、4000rpm離心15min，沉淀用 MMA 緩沖液(1 Ommol/L MgCl2、10mmol/L 2-嗎啉乙磺酸 MES、100 μ mol/L 乙酰丁香酮 AS)重懸，菌液終濃度為0D600約1. 0-2. O ；室溫靜置2 hr以上，用Iml注射器對合適苗齡的含有三種病毒的甘薯葉片進行浸潤。分別選取浸潤后O天、15天及30天的甘薯上部葉片，用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)測定浸潤前后葉片中三種甘薯病毒含量的變化，處理和未處理的甘薯各取12株， 取其平均值。(二)結果與分析 URNAi載體的構建
以質粒 SPFLG-T 為模板，分別以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI為引物，進行PCR擴增，獲得目的基因SPFLG (參見圖1)，將目的基因分別用 Xbal和分el RKpnl和Clal酶切后，以反向重復的方式分別克隆到pBlue NiRIntron載體的內含子兩側；經損al和^otI酶切后，回收目的片段，克隆至中間載體pR0K219上(參見圖 2)，命名為pROKSPFLG ；經和歷idIII酶切pROKSPFLG后，回收包括!35S啟動子、反向重復片段、NOS終止子的目的片段，克隆至雙元植物表達載體pBIN19上(參見圖3)，命名為 pBINSPFLG。2、RNAi對三種病毒的抑制效果
分別選取浸潤后O天、15天及30天的甘薯上部葉片，用ELISA檢測浸潤前后葉片中三種甘薯病毒含量的變化，處理和未處理的甘薯各取12株，取其平均值。結果表明農桿菌浸潤后，三種病毒的含量明顯降低，參見圖4、5、6，圖中可看出，在浸潤后15天左右作用效果最明顯，說明本發(fā)明構建的RNAi載體能抑制三種甘薯病毒基因的表達。
權利要求
1.針對三種甘薯病毒的融合基因，其特征在于，所述融合基因的序列為SEQ1，命名為 SPFLG。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述三種甘薯病毒為甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒和甘薯G病毒。
3.三種甘薯病毒的RNA干涉載體，其特征在于，其構建方法包括以下步驟(1)引物設計根據(jù)三種甘薯病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的保守區(qū)域設計兩對引物， 具體如下SPFLG-XbaI :5’-CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’，SPFLG-SpeI :5，-AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；SPFLG-KpnI 5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'，SPFLG-ClaI :5’-AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；(2)甘薯病毒RNA干涉載體構建將權利要求1所述的SPFLG基因克隆到T載體上，命名為SPFLG-T，以SPFLG-T為模板， 分別以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 為引物，進行 PCR 擴增，將獲得的目的基因SPFLG分別用損al和RKpnl和CZaI酶切后，以反向重復的方式分別克隆到pBlue NiMntron載體的內含子兩側；然后利用損aI和^^I進行雙酶切，回收含有反向重復目的基因的片段，將其克隆到中間載體PR0K219上，所述含有反向重復目的基因的片段位于35S啟動子的下游、NOS終止子的上游，命名為pROKSPFLG ；用和歷/7dIII 酶切pROKSPFLG，回收包括35S啟動子、反向重復片段和NOS終止子的目的片段，克隆到植物表達載體pBmi9上，命名為pBINSPFLG。
4.根據(jù)權利要求3所述的RNA干涉載體，其特征在于，所述PCR擴增反應程序為 94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30個循環(huán)，最后72°C延伸 IOmin0
5.根據(jù)權利要求3所述的RNA干涉載體，其特征在于，所述三種甘薯病毒為甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒和甘薯G病毒。
6.權利要求3所述的RNA干涉載體在防治病毒甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒和甘薯G病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對三種甘薯病毒的融合基因及其干涉載體。針對三種甘薯病毒的融合基因序列為SEQ1，命名為SPFLG。其干涉載體構建時，先設計SPFLG-XbaI和SPFLG-SpeI以及SPFLG-KpnI和SPFLG-ClaI兩對引物，將SPFLG基因克隆到T載體上，以SPFLG-T為模板，分別以兩對引物進行PCR擴增，將獲得的目的基因SPFLG分別用XbaI和SpeI及KpnI和ClaI酶切后，以反向重復的方式分別克隆到pBlueNiRIntron載體的內含子兩側；然后利用XbaI和KpnI進行雙酶切，回收目的基因的片段，將其克隆到中間載體pROK219上；用EcoRI和HindIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S啟動子、反向重復片段和NOS終止子的目的片段，克隆到植物表達載體pBIN19上，命名為pBINSPFLG。試驗表明，本發(fā)明構建的RNA干涉載體對SPFMV、SPLV和SPVG三種病毒有明顯的干擾作用，為培育同時抗三種病毒的轉基因甘薯奠定了基礎。
文檔編號C12N15/82GK102206661SQ20111007999
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權日2011年3月31日
發(fā)明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 張磊, 田雨婷, 秦艷紅, 鄭文明 申請人:河南省農業(yè)科學院