專利名稱：一種¹³C、¹⁵N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于穩(wěn)定同位素標記化合物的生產制備領域，涉及微生物發(fā)酵工藝和生物下游分離領域，尤其是涉及一種13C^N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法。
背景技術：
傳統的生產穩(wěn)定同位素標記的L-氨基酸的方法可采用標記蛋白質分解分離制備法、有機合成法、酶法及微生物發(fā)酵法等。標記蛋白質分解分離制備法常用于制備標記的復合氨基酸，要分離得到標記的單一氨基酸很困難，現今由于受到原料限制已很少使用。采用有機合成法比較簡單，但制備L-氨基酸需要光學拆分使13C^N穩(wěn)定同位素的原料利用率大為降低，成本上升。而酶法制備標記的L-氨基酸需得到標記的底物和可用的酶源，視具體的氨基酸而定。微生物發(fā)酵法則在合適的氨基酸產生菌的存在下輔以良好的生產工藝便可得到標記的氨基酸，有一定的優(yōu)越性。L-賴氨酸的生產歷程從蛋白質水解法、化學合成法、酶法到當今的發(fā)酵法。對13C、 1N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備而言，采用微生物直接發(fā)酵的生產工藝更簡單成熟。近年來，L-賴氨酸的生產多采用發(fā)酵法，關于發(fā)酵法生產L-賴氨酸的研究報道很多，但是在關于用生物合成法研究13C，1N穩(wěn)定同位素標記的L-賴氨酸鹽酸鹽的生產領域中還不見有專利和文獻報道。采用直接發(fā)酵法制備，目標氨基酸大量富集，分離相對簡單，但由于種子、 發(fā)酵配方中存在有機碳、氮源，會稀釋穩(wěn)定同位素的豐度，如不加以工藝優(yōu)化控制，常使產品的同位素豐度大為下降，以致達不到產品的質量要求。故需對工藝(主要為發(fā)酵工藝) 進行優(yōu)化以控制產品的豐度下降，提高穩(wěn)定同位素的利用率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了 g服上述現有技術存在的缺陷而提供一種提高了生產效率、降低了成本的13C^N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選取選取適用于13Cn雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的菌種包括短桿菌屬及棒桿菌屬的變異株，包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicium)、黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)或 1 " 棒桿菌(Corynebacterium crenatum)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加或添加極少量的玉米漿等作為有機氮源，有機氮源的濃度為 Owt % 2. Owt %，以13C-葡萄糖為碳源，葡萄糖總的濃度為8wt% 15wt%，以含15N的硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素中的一種或幾種為初始氮源，初始氮源的添加量為氮元素含量占總量的0. 3wt% 1. 5wt%，發(fā)酵過程中可流加含15N的尿素或氨水補充氮源，不添加或添加極少量的玉米漿、豆餅水解液、酪蛋白水解液、菌體水解液中的一種或多種作為有機氮源，該有機氮源的濃度為 2. 0wt%，隨菌種不同添加不同量的磷酸鹽包括K2HPO4或 KH2PO4,添加量為0. 5g/L 4g/L ；鎂鹽，包括MgSO4,添加量為0. 2g/L 0. 8g/L ；亞鐵鹽，包括FeSO4 · 7H20,添加量為0. 01g/L 0. 06g/L及錳鹽，包括MnSO4 · 4H20,添加量為0. Olg/ L 0. 06g/L ；另外添加高絲氨酸，添加量為0. 05g/L 0. 30g/L ；生物素，添加量為100 μ g/ L 1000 μ g/L ；維生素B1，添加量為100 μ g/L 1000 μ g/L等;⑶發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵得到發(fā)酵液，所述的搖瓶發(fā)酵的工藝將菌體接種于活化培養(yǎng)基的斜面或平板上，在觀 35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 M小時，再將長好的菌體接一環(huán)于經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL三角瓶的裝液量為20 30mL，于搖床上進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵罐發(fā)酵的工藝將菌體接種于活化培養(yǎng)基的斜面或平板上，在觀 35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 M小時，再將長好的菌體接種于經滅菌的種子培養(yǎng)基中，在 28 35°C搖床培養(yǎng)16 M小時，搖床轉速180 220轉/分鐘，得到的種子培養(yǎng)液按體積比3% 10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)；⑷分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13Cn雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離，得到13C^N雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于50°C 60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽
女口
廣 PFt ο所述步驟(3)中的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的斜面保藏培養(yǎng)基的組成成分為蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaC15. Og/L、 瓊脂20g/L。所述的斜面活化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏IOg/ L、NaCl 5. 0g/L、瓊脂 20g/L。所述步驟(3)中的種子培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖25g/L、硫酸銨5g/L、K2HPO4 1. 0g/L、MgSO4 0. 25g/L、玉米菜 5 20g/L。所述步驟(3)中搖瓶發(fā)酵的控制條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度^ 35°C，搖床轉速 180 240轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72 96小時。所述步驟(3)中發(fā)酵罐發(fā)酵的控制條件為發(fā)酵溫度觀 351，初始pH6.2 6. 8，通氣量0. 5 1. 5VVM，罐壓0. 02 0. 05Mpa，溶解氧1 90%，發(fā)酵過程中通過添加尿素溶液或氨水控制發(fā)酵液的pH值為6. 4 7. 0，以消泡劑消泡，發(fā)酵時間60 72小時。與現有技術相比，本發(fā)明采用的發(fā)酵工藝是適合13Cn雙標記L-賴氨酸的制備的。在該工藝條件下13C^N雙標記L-賴氨酸的產酸率比采用全合成培養(yǎng)基的相應提高 40% 60%，效果明顯，通過控制碳源葡萄糖、無機氮源硫酸銨等及有機氮源玉米漿等的添加量，添加高絲氨酸、生物素、維生素B1等物質，改善了發(fā)酵配方。既使同位素豐度得到了控制，減少了豐度下降的風險，又保證了產酸率，使同位素原料得到有效利用，降低了生產成本，使產品更有市場競爭力。本發(fā)明可利用不同豐度規(guī)格的原料來制備不同豐度的產品， 滿足各種豐度需求。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例中13CN的豐度采用同位素專用質譜儀測定，產品的純度采用HPLC法或凱氏定氮法。實施例1以黃色短桿菌(Brevikicterium flavum)ATCC14067為出發(fā)菌株，使用的培養(yǎng)基包
括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、豐度搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)普通發(fā)酵的，配方如下斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，瓊脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，瓊脂20， pH7. 0 7. 2。以上培養(yǎng)基均用濃度為2mol/L的NaOH調節(jié)pH，121°C滅菌20分鐘。低豐度發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 150，15N-硫酸銨 40，MgSO4 0. 35，KH2PO4 1. 0，生物素 300 μ g/L,維生素 B^OO μ g/L,高絲氨酸 0. 25，玉米菜 4. 5mL/L, MnSO4 · 4Η20 0· 01，FeSO4 · 7H20 0· 01，CaCO3 25。以上發(fā)酵培養(yǎng)基用濃度為2mol/L的KOH調節(jié)pH至7. 0 7. 2，115°C滅菌15分鐘，CaCO3分消。裝液量為20mL/500mL三角瓶，共配制5瓶，計0. IL0將菌體接種于活化培養(yǎng)基斜面上，在32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時，再將長好的菌體接一環(huán)于裝有經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度 320C，搖床轉速220轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72小時，產酸達30. 2g/L。發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13C、15N雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液用濃度為2mol/L的HCl調節(jié)pH至3 4，在離心機上 4000轉/分鐘離心20分鐘，所得上清液上732銨型樹脂柱，經水洗及0. lmol/L的氨水洗脫后，分離得到13Cn雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，于50°C 60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品2. 33g，產品的豐度經同位素質譜儀檢測為=13C 9.98%，15附0.07%，下降幅度較小， 可以進行高豐度產品的制備。產品的純度經凱氏定氮檢測大于98.5%。實施例2以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicium) AS 1. 563為出發(fā)菌株，使用的
培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、豐度搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)普通發(fā)酵的，配方如下斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，瓊脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10, NaCl 5.0，瓊脂20， pH7. 0 7. 2。以上培養(yǎng)基均用濃度為2mol/L的NaOH調節(jié)pH，121°C滅菌20分鐘。高豐度發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 145，15N-硫酸銨 45，MgSO4 0. 25，K2HPO4 1. 0，生物素 400 μ g/L,維生素 Β^ΟΟ μ g/L,高絲氨酸 0. 15g,玉米漿 7. 5mL/L, MnSO4 · 4H20 0. 02，FeSO4 · 7H20 0. 02，CaCO325。以上發(fā)酵培養(yǎng)基用濃度為2mol/L的KOH調節(jié)pH至7. 0 7. 2，115°C滅菌15分鐘，CaCO3分消。裝液量為25mL/500mL三角瓶，共配制4瓶，計0. IL0將菌體接種于活化培養(yǎng)基斜面上，在30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22小時，再將長好的菌體接一環(huán)于裝有經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度 300C，搖床轉速200轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵96小時，產酸達31. 6g/L。發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13C、15N雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液用濃度為2mol/L的HCl調節(jié)pH至3 4，在離心機上 4000轉/分鐘離心20分鐘，所得上清液上732銨型樹脂柱，經水洗及0. lmol/L的氨水洗脫后，分離得到13Cn雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，于50°C 60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品2. 58g，產品的豐度經同位素質譜儀檢測為1 98. 61%,15N98. 07%。產品的純度經 HPLC檢測大于98. 5%。實施例3以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicium) ATCC13869為出發(fā)菌株，使用的
培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、豐度搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)普通發(fā)酵的，配方如下斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，瓊脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖5. 0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，瓊脂20， pH7. 0 7. 2。以上培養(yǎng)基均用濃度為2mol/L的NaOH調節(jié)pH，121°C滅菌20分鐘。高豐度發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 130，15N-硫酸銨 35，MgSO4 0. 25，K2HPO4 1. 0，生物素 600 μ g/L,維生素 BJOO μ g/L,高絲氨酸 0. 20g，豆餅水解液 4. OmL/L，MnSO4. 4H20 0. 02，FeSO4 · 7H20 0. 02， CaCO3 25ο以上發(fā)酵培養(yǎng)基用濃度為2mol/L的KOH調節(jié)pH至7. 0 7. 2，115°C滅菌15分鐘，CaCO3分消。裝液量為25mL/500mL三角瓶，共配制20瓶，計0. 5L。將菌體接種于活化培養(yǎng)基斜面上，在31°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時，再將長好的菌體接一環(huán)于裝有經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度 31°C，搖床轉速200轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵84小時，產酸達33. 4g/L。發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13C、15N雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液用濃度為2mol/L的HCl調節(jié)pH至3 4，在離心機上 4000轉/分鐘離心20分鐘，所得上清液上732銨型樹脂柱，經水洗及0. lmol/L的氨水洗脫后，分離得到13Cn雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，于50°C 60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品14. 23g，產品的豐度經同位素質譜儀檢測為1 98. 23%, 15N 98. 16%。產品的純度經HPLC檢測大于98. 5%0實施例4一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選取選取適用于13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicium) ATCC 13869 作為菌禾中；(2)發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵得到發(fā)酵液，搖瓶發(fā)酵采用以下工藝將菌體接種于斜面活化培養(yǎng)基上，在的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時，再將長好的菌體接一環(huán)于裝有經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL三角瓶的裝液量為20mL，控制搖床轉速為180轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵96小時，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13CN雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離，得到13C^N雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于50°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品。發(fā)酵工藝中的發(fā)酵培養(yǎng)基以13C-葡萄糖為碳源，配方中13C-葡萄糖總的濃度為 8wt%，以15N-硫酸銨作為初始氮源，初始氮源的添加量為氮元素含量占總量的0. 3wt%，發(fā)酵過程中流加15N-尿素補充氮源，然后向其中加入K2HPO4，添加量為0. 5g/L ；MgSO4,添加量為0. 2g/L ；FeSO4 · 7H20，添加量為0. 02g/L ；MnSO4 · 4H20添加量為0. 02g/L。另外添加高絲氨酸，添加量為0. 05g/L;生物素，添加量為100yg/L;維生素B1，添加量為100yg/L。實施例5一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選取選取適用于13C、15N雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum) ATCC14067 作為菌種；(2)發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵得到發(fā)酵液，搖瓶發(fā)酵采用以下工藝將菌體接種于斜面活化培養(yǎng)基上，在35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，再將長好的菌體接一環(huán)于裝有經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL三角瓶的裝液量為30mL，控制搖床轉速240轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72小時進行發(fā)酵
培養(yǎng)；(3)分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13CN雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離，得到13C^N雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品。發(fā)酵工藝中斜面活化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏 10g/L、NaCl 5. 0g/L、瓊脂20g/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基以玉米漿為有機氮源，添加量為2. Owt%,以 13C-葡萄糖為碳源，配方中13C-葡萄糖總的濃度為15wt%，以15N-氯化銨為初始氮源，初始氮源的添加量為氮元素含量占總量的1.5wt%，發(fā)酵過程中流加15N-氨水補充氮源，再向其中添加KH2PO4,添加量為4g/L ；MgSO4，添加量為0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，添加量為0. 06g/L ； MnSO4 · 4H20添加量為0. 06g/L。另外添加高絲氨酸，添加量為0. 30g/L ；生物素，添加量為 1000 μ g/L ；維生素B1，添加量為1000 μ g/L。實施例6一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選取
選取適用于雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的北京棒桿菌 (Corynebacterium pekinense) As 1. 299 作為菌禾中；(2)發(fā)酵工藝采用發(fā)酵罐發(fā)酵得到發(fā)酵液，發(fā)酵罐發(fā)酵采用工藝將菌體接種于斜面活化培養(yǎng)基斜面上，在的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時，再將長好的菌體接種于裝有經滅菌的種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在搖床培養(yǎng)M小時，搖床轉速180轉/分鐘，得到的種子培養(yǎng)液按體積比5%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH6. 8，通氣量 0. 5VVM，罐壓0. 02Mpa,溶解氧1 %，發(fā)酵過程中通過添加15N-尿素溶液控制發(fā)酵液的pH值為7. 0，以消泡劑消泡，發(fā)酵時間60小時；(3)分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13CN雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離，得到13C^N雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于50°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品。發(fā)酵工藝中斜面活化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏 10g/L、NaCl 5. Og/L、瓊脂20g/L ；種子培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖25g/L、硫酸銨5g/L、 K2HPO4 1. Og/L、MgSO4 0.25g/L、玉米漿5g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為13C-葡萄糖120g/ L, 15N-尿素 13g/L，MgSO4 0. 50g/L，Κ2ΗΡ042· 0g/L,生物素 500 μ g/L，維生素 Β^ΟΟ μ g/L，高絲氨酸 0. 30g/L，玉米漿 7. 5mL/L，MnSO4 · 4H20 0. 06g/L, FeSO4 · 7H20 0. 06g/L。發(fā)酵過程中流加15N-尿素補充氮源，也調節(jié)pH值。實施例7一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選取選取適用于13C、15N雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)ATCC 14067 作為菌種;(2)發(fā)酵工藝采用發(fā)酵罐發(fā)酵得到發(fā)酵液，發(fā)酵罐發(fā)酵采用以下工藝將菌體接種于平板上， 在35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，再將長好的菌體接種于裝有經滅菌的種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在35°C搖床培養(yǎng)16小時，搖床轉速220轉/分鐘，得到的種子培養(yǎng)液按體積比10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，初始PH6. 3，通氣量1. 5VVM，罐壓 0. 05Mpa,溶解氧90%，發(fā)酵過程中通過添加15N-氨水控制發(fā)酵液的pH值為6. 5，以消泡劑消泡，發(fā)酵時間60小時；(3)分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13CN雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離，得到13C^N雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于60°C真空烘干，最終得到13CN雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品。發(fā)酵工藝中種子培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖25g/L、硫酸銨5g/L、K2HPO4L Og/ L、MgSO4 0.25g/L、玉米漿20g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為13C_葡萄糖100g/L,N_尿素 16g/L，MgSO4 0. 50g/L，K2HPO4 2. 0g/L,生物素 500 μ g/L,維生素 Β^ΟΟ μ g/L,高絲氨酸 0. 20g/L,玉米菜 5. 0mL/L, MnSO4 · 4H20 0. 06g/L, FeSO4 · 7H20 0. 06g/L。
權利要求
1. 一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(ι)發(fā)酵菌種的選取選取適用于13Cn雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽發(fā)酵生產的菌種包括短桿菌屬及棒桿菌屬的變異株，包括黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicium)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)或純齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)等；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加或添加極少量的玉米漿等作為有機氮源，有機氮源的濃度為 Owt % 2. Owt %，以13C-葡萄糖為碳源，葡萄糖總的濃度為8wt% 15wt%，以含15N的硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素中的一種或幾種為初始氮源，初始氮源的添加量為氮元素含量占總量的0. 3wt% 1. 5wt%，發(fā)酵過程中可流加含15N的尿素或氨水補充氮源，不添加或添加極少量的玉米漿、豆餅水解液、酪蛋白水解液、菌體水解液中的一種或多種作為有機氮源，該有機氮源的濃度為 2. Owt%，隨菌種不同添加不同量的磷酸鹽包括K2HPO4或 KH2PO4,添加量為0. 5g/L 4g/L ；鎂鹽，包括MgSO4,添加量為0. 2g/L 0. 8g/L ；亞鐵鹽，包括FeSO4 · 7H20,添加量為0. 01g/L 0. 06g/L及錳鹽，包括MnSO4 · 4H20,添加量為0. Olg/ L 0. 06g/L ；另外添加高絲氨酸，添加量為0. 05g/L 0. 30g/L ；生物素，添加量為100 μ g/ L 1000 μ g/L ；維生素B1，添加量為100 μ g/L 1000 μ g/L等;(3)發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵得到發(fā)酵液，所述的搖瓶發(fā)酵的工藝將菌體接種于活化培養(yǎng)基的斜面或平板上，在觀 35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 M小時，再將長好的菌體接一環(huán)于經滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL三角瓶的裝液量為20 30mL，于搖床上進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵罐發(fā)酵的工藝將菌體接種于活化培養(yǎng)基的斜面或平板上，在觀 35°C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 M小時，再將長好的菌體接種于經滅菌的種子培養(yǎng)基中，在觀 35°C搖床培養(yǎng)16 M小時，搖床轉速180 220轉/分鐘，得到的種子培養(yǎng)液按體積比 3% 10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)分離提取發(fā)酵培養(yǎng)結束后，將含有13CN雙標記L-賴氨酸的發(fā)酵液采用離子交換法提取分離， 得到13CN雙標記L-賴氨酸的單斑洗脫液，經真空濃縮趕氨、脫色，所得濾液再濃縮后用乙醇和水進行結晶，再于50°C 60°C真空烘干，最終得到13C^N雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽產品。
2.根據權利要求ι所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。
3.根據權利要求2所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述的斜面保藏培養(yǎng)基的組成成分為蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5. Og/L、瓊脂 20g/L。
4.根據權利要求2所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述的斜面活化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5. Og/L、瓊脂 20g/L。
5.根據權利要求1所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的種子培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖25g/L、硫酸銨5g/L、K2HP04 l.Og/ L、MgSO4 0. 25g/L、玉米漿 5 20g/L。
6.根據權利要求1所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟C3)中搖瓶發(fā)酵的控制條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度^ 35°C，搖床轉速180 MO 轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72 96小時。
7.根據權利要求1所述的一種13CN雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中發(fā)酵罐發(fā)酵的控制條件為發(fā)酵溫度觀 351，初始？!16.2 6.8，通氣量0. 5 1. 5VVM,罐壓0. 02 0. 05Mpa,溶解氧1 90 %，發(fā)酵過程中通過添加氨水或尿素溶液控制發(fā)酵液的PH值為6. 4 7. 0，以消泡劑消泡，發(fā)酵時間60 72小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種13C、15N雙標記-L-賴氨酸鹽酸鹽的制備方法，該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵菌種的選?。?2)發(fā)酵培養(yǎng)配方；(3)發(fā)酵工藝；(4)分離提取。本發(fā)明采用的發(fā)酵工藝適合13C、15N雙標記L-賴氨酸鹽酸鹽的制備，在該工藝條件下的產酸率比采用全合成培養(yǎng)基的相應提高40％～60％，效果明顯，通過控制碳源葡萄糖、無機氮源硫酸銨等及有機氮源玉米漿等的添加量，添加高絲氨酸、生物素、維生素B1等物質，改善了發(fā)酵配方。既使同位素豐度得到了控制，減少了豐度下降的風險，又保證了產酸率，使同位素原料得到有效利用，降低了生產成本，可利用不同豐度規(guī)格的原料來制備不同豐度的產品，滿足各種豐度需求。
文檔編號C12R1/13GK102174603SQ20111005799
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權日2011年3月10日
發(fā)明者侯靜華, 劉占鋒, 孫建春, 李良君, 杜曉寧 申請人:上海化工研究院