專利名稱：一種提取單個(gè)魚卵仔魚微量總dna的簡便快速方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA提取技術(shù)，具體地說是一種提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法。
背景技術(shù)：
為研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA。高質(zhì)量總DNA的制備是進(jìn)行分子生物學(xué)等研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)之一?？侱NA的常用提取方法主要包括高鹽法、有機(jī)溶劑萃取法、Chelex-IOO提取法、酶裂解法和使用商品化的試劑盒等。 傳統(tǒng)高鹽法適用于組織樣品較多的情況，對(duì)于單個(gè)魚卵仔魚等總DNA含量較少的樣品難以提取出足夠的DNA。有機(jī)溶劑萃取法雖然可以獲得較為純凈的DNA，但需要時(shí)間較長，DNA損失較大，也不適于微量DNA的提取。Chelex-100提取法雖然較為簡單快速，減少了提取過程中污染的機(jī)會(huì)，但提取終體積相對(duì)較大，DNA濃度較低，可能會(huì)使后續(xù)的分析受到影響。酶裂解法是向標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中加入蛋白酶K孵育靶組織或細(xì)胞，高溫滅活蛋白酶K后，即可取上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。但該法同樣存在提取終體積較大，DNA濃度低的缺點(diǎn)。商品化的微量DNA 試劑盒主要通過膜的吸附和洗脫等過程來完成DNA的收集和純化，雖然可以提取到較高濃度的DNA，但其操作相對(duì)復(fù)雜，成本較高，且受洗脫效率的影響較大。因此，需要建立一種簡單快捷、穩(wěn)定性和得率高的單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA提取的方法，以滿足進(jìn)一步其分子鑒定或遺傳來源分析的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種適用于不同發(fā)育階段單個(gè)魚卵或仔魚微量總DNA提取的快速簡便方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法1)樣品固定采集魚卵或仔魚，濾去水后立即加入無水乙醇，而后于_20°C或室溫保存?zhèn)溆?，魚卵或仔魚與無水乙醇比例為lmL魚卵Λ-διΛ無水乙醇；1尾仔魚/0. 05-0. 5mL無水乙醇；2)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的單個(gè)魚卵或仔魚樣品，加入生理鹽水洗滌，1000-2000g離心20-60秒去除多余生理鹽水，再用濾紙吸干樣品，重復(fù)2-3次；3)樣品消化取上述洗滌過的單個(gè)魚卵或仔魚，加入100-300 μ L DNA提取緩沖液和10-30 μ L 細(xì)胞裂解緩沖液，使細(xì)胞破壁，而后將細(xì)胞破壁的單個(gè)魚卵或仔魚加入IO-IOOyg蛋白酶K 和10-100 μ g RNA酶，震蕩混勻，于50-70°C溫育，每10-20分鐘顛倒混勻一次，消化至溶液
澄清，待用；4)提取總 DNA:
將步驟3)消化至澄清的溶液中加入100-300 μ L 5-6mol/L NaCl溶液，震蕩20-30 秒。15000g離心30分鐘，吸取上清液使蛋白質(zhì)去除，然后在上清液中加入等體積異丙醇，輕輕混勻，_20°C靜置1-2小時(shí)，15000g離心15分鐘，沉淀即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA。所述步驟1)魚卵或仔魚與無水乙醇混合后M小時(shí)，再更換一次無水乙醇。所述步驟2)生理鹽水為質(zhì)量體積比為0.9%的NaCl溶液。所述步驟3)DNA提取緩沖液為終濃度 0. 01mol/L 的 pH = 8. 0，Tris-HCl、終濃度 0. lmol/L 的 pH = 8. 0，EDTA，和終濃度 0. Imol/ L的NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的SDS溶液。所述步驟3)消化20-60分鐘至溶液液澄清，待用。所述步驟4)所得沉淀中加入70%無水乙醇洗滌沉淀1-2次；而后將洗滌后沉淀于通風(fēng)處放置，待乙醇完全揮發(fā)，加入10-40 μ L超純水或TE溶液，4°C靜置溶解，-20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明原理是DNA提取是利用化學(xué)或物理方法獲得不同生物樣品或組織中含有的DNA，以備進(jìn)一步的分子生物學(xué)或遺傳分析的一種方法。本發(fā)明利用蛋白質(zhì)在高鹽離子濃度下生成沉淀的特性，將已消化的組織液中的RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等通過酶解、沉淀或離心等方式去除，從而得到高質(zhì)量的DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、本發(fā)明提取方法，可以提取不同發(fā)育時(shí)期魚卵或仔魚中的總DNA，特別是包括2 細(xì)胞期、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、胚體期甚至未受精的魚卵，以及孵化后不同時(shí)期仔魚的總DNA提取。應(yīng)用范圍廣泛。2、本發(fā)明將采取的樣品用無水乙醇進(jìn)行固定，可在室溫下保存。避免了凍存需要的冷凍設(shè)備，樣品采集保存更加方便。3、本發(fā)明針對(duì)提取的樣品為單個(gè)魚卵或仔魚，個(gè)體較小，其DNA含量較少的情況， 通過減小反應(yīng)體系中各組成的用量，保證了獲得總DNA的效率；同時(shí)，縮短了消化的時(shí)間和加入的蛋白酶K與RNA酶的量。提高了獲得的總DNA的質(zhì)量。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的提取獲得的不同發(fā)育時(shí)期單個(gè)牙鲆魚卵、仔魚和大菱鲆魚卵總DNA用于COI片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。其中1、2為提取獲得的不同發(fā)育時(shí)期單個(gè)大菱鲆魚卵，3、4為單個(gè)牙鲆魚卵，5、6為單個(gè)牙鲆仔魚總DNA用于COI片段序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，M為分子標(biāo)記DL2000。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提出一種單個(gè)魚卵或仔魚DNA的提取方法，首先對(duì)采集的魚卵或仔魚進(jìn)行固定。在提取DNA前用生理鹽水洗去固定液，加入DNA提取緩沖液和細(xì)胞裂解緩沖液后，將魚卵或仔魚剪碎。再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。待消化完全后用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明。實(shí)施例1
1)樣品固定采集大菱鲆的受精卵0. 5mL，解剖鏡觀察受精卵已發(fā)育到2細(xì)胞期，濾去海水后加入ImL無水乙醇。M小時(shí)后更換一次無水乙醇。室溫保存；2)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的魚卵1粒，加入質(zhì)量體積比為0. 9%的NaCl溶液的生理鹽水洗滌，以1500g轉(zhuǎn)速離心30秒，吸棄多余的生理鹽水，用濾紙吸干水分，重復(fù)上述操作 2次；3)樣品消化將洗滌過的魚卵放入1. 5mL離心管中，加入100 μ L DNA提取緩沖液和10 μ L細(xì)胞裂解緩沖液。而后用潔凈的解剖剪將魚卵卵膜剪破，加入3 μ L 10mg/mL的蛋白酶K和3 μ L 10mg/mL的RNA酶。震蕩混勻后置于55°C溫育，每10分鐘顛倒混勻一次，消化20分鐘至溶液澄清；其中DNA提取緩沖液為終濃度0. Olmol/L的pH = 8. 0，Tri s-HCl，終濃度0. Imol/ L的pH = 8. 0，EDTA和終濃度0. lmol/L的NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的SDS 溶液。4)蛋白質(zhì)去除將上述消化后澄清液中加入100 μ L 6mol/L NaCl溶液，震蕩20秒。15000g離心 30分鐘；5) DNA 的沉淀吸取上清液，加入沉淀等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，_20°C靜置2小時(shí)，15000g 離心15分鐘，吸棄上清液；6) DNA 洗滌加入70%無水乙醇，將沉淀彈起后輕輕顛倒幾次，15000g離心5分鐘，吸棄上清。 重復(fù)1次上述操作。而后在通風(fēng)處放置15分鐘，使乙醇完全揮發(fā)。7) DNA 溶解乙醇揮發(fā)后，在沉淀中加入20 μ L超純水，4°C靜置溶解，即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?) DNA提取效果檢測以上述提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增大菱鲆的線粒體DNA COI片段(參見圖1)， PCR產(chǎn)物測序后，得到662bp的序列，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得的序列確實(shí)為大菱鲆COI序列。表明提取的是所需的大菱鲆基因組DNA，可用于進(jìn)一步的相關(guān)研究和應(yīng)用。實(shí)施例21)樣品固定采集牙鲆的受精卵lmL，解剖鏡觀察受精卵已發(fā)育到胚體期，濾去海水后加入5mL 無水乙醇。M小時(shí)后更換一次無水乙醇。-20°C保存；2)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的魚卵1粒，加入質(zhì)量體積比為0.9%的NaCl溶液的生理鹽水洗滌；以IOOOg轉(zhuǎn)速離心60秒，吸棄多余的生理鹽水，用濾紙吸干水分，重復(fù)2次。3)樣品消化將洗滌過的魚卵放入1.5mL離心管中，加入200 μ L DNA提取緩沖液和20 μ L細(xì)胞裂解緩沖液。而后用潔凈的解剖剪將魚卵卵膜剪破。加入2 μ L 20mg/mL的蛋白酶K和2 μ L 20mg/mL的RNA酶。震蕩混勻后置于60°C溫育，每15分鐘顛倒混勻一次，消化30分鐘至溶液澄清；其中DNA提取緩沖液為終濃度0. 01mol/L的pH = 8. 0，TrisHCl，終濃度0. Imol/ L的pH = 8. 0，EDTA，終濃度0. lmol/L NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的SDS溶液。4)蛋白質(zhì)去除將上述消化后澄清液中加入200 μ L 6mol/L NaCl溶液，震蕩20秒。15000g離心 30分鐘；5) DNA 的沉淀吸取上清液，加入沉淀等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，_20°C靜置1小時(shí)，15000g 離心15分鐘，吸棄上清液；6) DNA 洗滌加入70%無水乙醇，將沉淀彈起后輕輕顛倒幾次，15000g離心5分鐘，吸棄上清。 重復(fù)1次。在通風(fēng)處放置15分鐘，使乙醇完全揮發(fā)；7) DNA 溶解乙醇揮發(fā)后，在沉淀中加入15 μ L超純水，4°C靜置溶解即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?) DNA提取效果檢測以上述提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增牙鲆的線粒體DNA COI片段(參見圖1)， PCR產(chǎn)物測序后，得到660bp的序列，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得的序列確實(shí)為牙鲆COI序列。表明提取的是所需的牙鲆基因組DNA，可用于進(jìn)一步的相關(guān)研究和應(yīng)用。實(shí)施例31)樣品固定采集牙鲆的初孵仔魚10尾，濾去海水后加入2mL無水乙醇。24小時(shí)后更換一次無水乙醇。室溫保存；2)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的初孵仔魚1尾，加入質(zhì)量體積比為0.9%的NaCl溶液的生理鹽水洗滌；以2000g轉(zhuǎn)速離心20秒，用濾紙吸干水分，重復(fù)上述操作3次。3)樣品消化將洗滌過的仔魚放入1. 5mL離心管中，加入300 μ L DNA提取緩沖液和30 μ L細(xì)胞裂解緩沖液。而后用潔凈的解剖剪將仔魚剪碎。加入5 μ L 20mg/mL的蛋白酶K和5 μ L 20mg/mL的RNA酶。震蕩混勻后置于55°C溫育，每20分鐘顛倒混勻一次，消化1小時(shí)至溶液澄清；其中DNA提取緩沖液為終濃度0. 01mol/L的pH = 8. 0，TrisHCl，終濃度0. Imol/ L的pH = 8. 0，EDTA，終濃度0. lmol/L NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的SDS溶液。4)蛋白質(zhì)去除將上述消化后澄清液中加入300 μ L 5mol/L NaCl溶液，震蕩20秒。15000g離心 30分鐘；5) DNA 的沉淀
吸取上清液，加入沉淀等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20°C靜置1. 5小時(shí)， 15000g離心15分鐘，吸棄上清液；6) DNA 洗滌加入70%無水乙醇，將沉淀彈起后輕輕顛倒幾次，15000g離心5分鐘，吸棄上清。 重復(fù)1次。在通風(fēng)處放置15分鐘，使乙醇完全揮發(fā)；7) DNA 溶解乙醇揮發(fā)后，在沉淀中加入30 μ L超純水，4°C靜置溶解即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?) DNA提取效果檢測以上述提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增牙鲆的線粒體DNA COI片段(參見圖1)， PCR產(chǎn)物測序后，獲得660bp的序列，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得的序列確實(shí)為牙鲆COI序列。表明提取的是所需的牙鲆總DNA，可用于進(jìn)一步的相關(guān)研究和應(yīng)用。實(shí)施例41)樣品固定采集魚卵或仔魚，濾去水后立即按照ImL魚卵/5mL無水乙醇、1尾仔魚/0. ImL無水乙醇的比例進(jìn)行固定。M小時(shí)后更換一次無水乙醇。室溫下保存?zhèn)溆茫?)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的單個(gè)魚卵或仔魚，加入質(zhì)量體積比為0. 9%的NaCl溶液的生理鹽水洗滌，以2000g轉(zhuǎn)速離心20秒，吸棄多余的生理鹽水并將樣品用濾紙吸干，重復(fù) 2-3 次；3)樣品消化取上述洗滌過的單個(gè)魚卵或仔魚，加入100 μ L DNA提取緩沖液和10 μ L細(xì)胞裂解緩沖液。用潔凈的解剖剪將魚卵卵膜剪破，仔魚剪碎。加入10 μ L 10mg/mL的蛋白酶K和 2 μ L 10mg/mL的RNA酶。震蕩混勻后置于60°C溫育，每20分鐘顛倒混勻一次，消化40分鐘至消化液澄清；其中DNA提取緩沖液為終濃度0. Olmol/L的pH = 8. 0，TrisHCl，終濃度 0. lmol/L的？!1 = 8.0工0了六，終濃度0. lmol/L NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的 SDS溶液。4)蛋白質(zhì)去除將上述消化后澄清液中加入IOOyL 5mol/L NaCl溶液，震蕩20-30秒。15000g 離心30分鐘；5) DNA 的沉淀吸取上清液，加入沉淀等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20°C靜置1-2小時(shí)， 15000g離心15分鐘，吸棄上清液；6) DNA 洗滌加入70%無水乙醇，將沉淀彈起后輕輕顛倒幾次，15000g離心5分鐘，吸棄上清。 重復(fù)1次。在通風(fēng)處放置10-20分鐘，使乙醇完全揮發(fā)；7) DNA 溶解乙醇揮發(fā)后，在沉淀中加入40 μ L TE溶液，4°C靜置溶解即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于1)樣品固定采集魚卵或仔魚，濾去水后立即加入無水乙醇，而后于-20°C或室溫保存?zhèn)溆?，魚卵或仔魚與無水乙醇比例為=ImL魚卵/2-5mL無水乙醇；1尾仔魚/0. 05-0. 5mL無水乙醇；2)樣品中固定液的去除取步驟1)所得已固定的單個(gè)魚卵或仔魚樣品，加入生理鹽水洗滌，1000-2000g離心 20-60秒去除多余生理鹽水，再用濾紙吸干樣品，重復(fù)2-3次；3)樣品消化取上述洗滌過的單個(gè)魚卵或仔魚，加入100-300 μ L DNA提取緩沖液和10-30 μ L細(xì)胞裂解緩沖液，使細(xì)胞破壁，而后將細(xì)胞破壁的單個(gè)魚卵或仔魚加入10-100 μ g蛋白酶K禾口 10-100 μ g RNA酶，震蕩混勻，于50-70°C溫育，每10-20分鐘顛倒混勻一次，消化至溶液澄清，待用；4)提取總DNA將步驟3)消化至澄清的溶液中加入100-300 μ L 5-6mol/L NaCl溶液，震蕩20-30秒。 15000g離心30分鐘，吸取上清液使蛋白質(zhì)去除，然后在上清液中加入等體積異丙醇，輕輕混勻，-20°C靜置1-2小時(shí)，15000g離心15分鐘，沉淀即得到單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA。
2.按權(quán)利要求1所述的提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于 所述步驟1)魚卵或仔魚與無水乙醇混合后M小時(shí)，再更換一次無水乙醇。
3.按權(quán)利要求1所述的提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于 所述步驟2)生理鹽水為質(zhì)量體積比為0. 9%的NaCl溶液。
4.按權(quán)利要求1所述的提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于 所述步驟:3)DNA提取緩沖液為終濃度0. 01mol/L的pH = 8. 0，"Tris-HCl、終濃度0. lmol/L 的pH = 8. 0，EDTA，和終濃度0. lmol/L的NaCl ；細(xì)胞裂解緩沖液為質(zhì)量體積比10%的SDS 溶液。
5.按權(quán)利要求1所述的提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于 所述步驟幻消化20-60分鐘至溶液液澄清，待用。
6.按權(quán)利要求1所述的提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法，其特征在于 所述步驟4)所得沉淀中加入70%無水乙醇洗滌沉淀1-2次；而后將洗滌后沉淀于通風(fēng)處放置，待乙醇完全揮發(fā)，加入10-40 μ L超純水或TE溶液，4°C靜置溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA提取技術(shù)，具體地說是一種提取單個(gè)魚卵仔魚微量總DNA的簡便快速方法。對(duì)采集的魚卵或仔魚進(jìn)行固定保存。沖洗去除固定液后，加入DNA提取緩沖液和細(xì)胞裂解緩沖液，將魚卵或仔魚剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。本方法解決了常規(guī)總DNA提取方法在魚卵或仔魚等基因組DNA含量較少樣品中應(yīng)用的限制問題。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102161988SQ20111002764
公開日2011年8月24日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者吳志昊, 尤鋒, 張培軍, 張毅, 徐冬冬, 徐永立, 王偉 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所