專利名稱：一種醋酸棉酚降解菌s6的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一種高濃度棉酚耐受菌株，屬于生物高技術領域，是利用微生物的方法降解游離棉酚，適用于現(xiàn)代高濃度棉酚含量的棉籽粕的生物處理。
背景技術：
棉籽餅粕是重要的植物蛋白飼料資源，但由于棉籽餅粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡、粗纖維含量高等原因，成為限制其在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的主要因素。飼糧中包含一定量的棉酚(re)可對動物生長、繁殖以及胃腸道和體組織器官產(chǎn)生負面作用，re可與棉仁中的蛋白、糖類、氨基酸、磷脂等結合而被“封閉”，使re失去毒性，其結合后難以被動物消化吸收，但有報道指出結合棉酚在動物消化過程中又能釋放出re，產(chǎn)生毒性。有研究表明反芻動物對棉酚具有較大的耐受力；研究者還發(fā)現(xiàn)霉變的棉籽粕中棉酚含量非常低， 進一步的研究表明霉菌對棉酚具有降解作用。顧賽紅等和^iang等Q006)研究表明，微生物發(fā)酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同時提高了蛋白質、氨基酸等營養(yǎng)物質含量及消化吸收率，mi等(1989)和Kornegay等(197 亦有類似的研究結果。近年來發(fā)酵棉籽粕的研究主要集中于脫毒菌株的選育及其脫毒效果等的研究，但復合發(fā)酵菌株間協(xié)同或拈抗作用機理不明，工藝條件尚缺乏充分的理論基礎。因此，本研究針對上述問題對發(fā)酵棉籽粕菌株做了進一步的篩選，研究了不同菌株的復合發(fā)酵及其適宜發(fā)酵工藝參數(shù)條件，以期為棉籽粕資源的充分利用提供更為有力的理論支持和指導。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的游離棉酚降解菌，使用本發(fā)明的微生物可以使高棉酚含量棉粕中的游離棉酚去除率達88. 88%，并且有很好的菌株穩(wěn)定性。使用該降解菌株可以高效降解棉籽粕中的游離棉酚，使之達到使用標準，把棉籽粕變成可利用的飼料蛋白源，對促進我國飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。技術方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容一種醋酸棉酚降解菌S6，其特征在于菌種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏時間為2010年11月 26日，保藏號為CGMCC No. 4371。，該菌種S6命名為Kloeckeralindneri，經(jīng)鑒定為克勒克酵母屬lindneri，主要生物學特性為克雷克酵母(S6)乳白色，圓形；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中生長，能在查氏培養(yǎng)基中生長，發(fā)酵葡萄糖；能以0.3%醋酸棉酚為唯一碳源進行生長。該菌株的基因序列為kq NO. 1。電鏡檢驗結果可見圓形或卵圓形的單細胞，無鞭毛。在實驗室三角瓶培養(yǎng)條件下對游離棉酚的降解率達88. 88%。經(jīng)發(fā)酵效果較好的菌株S1、S3、S6分別組合發(fā)酵，棉籽粕re含量較發(fā)酵前極顯著降低(P<0.01)，粗蛋白(CP) 含量亦極顯著提高(P <0.01)，其中三菌種復合發(fā)酵效果最優(yōu)re降解率為66. 86%，CP提高率為19. 36%。使用上述醋酸棉酚降解菌工藝為保藏菌種-搖瓶種活化-篩選培養(yǎng)基-一級菌種-二級菌種。具體實施步驟為1)霉變棉籽粕稀釋制成不同梯度后涂布于0. 醋酸棉酚查氏培養(yǎng)基平板上， 300C，恒溫靜置培養(yǎng)3-5天，挑選長勢良好的不同類型菌落，進一步于0. 2 %、0. 3 %的醋酸無糖查氏培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)得到耐較高棉酚含量的菌株。2)將活化好的菌種接入20ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基于IOOml三角瓶得到一級菌種 (條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)，取一級菌種接入Iml于裝有IOOml馬鈴薯液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中為二級菌種(條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)。3)將篩選純化得到的菌株制備成液體菌種，接入到100g棉籽粕發(fā)酵底物，接種量為5%，30°C培養(yǎng)48h。烘干測定TO及CP含量，分析發(fā)酵效果。棉籽粕發(fā)酵底物的配方為 將粉碎過篩后的棉籽粕、玉米、麥麩按7 2 1的比例混合均勻構成基礎底物。按底物與水為1 0.8的比例加入水分發(fā)酵，121°C滅菌30min。4)將篩選得到的性能優(yōu)良的菌株(S6)制備成液體菌種，接入100g棉籽粕底物中， 接種比例分別按1 1和1 1 1的比例，接種量為5%，置于500ml三角瓶中，30°C，恒溫靜置培養(yǎng)48h。烘干測定re及CP含量，分析發(fā)酵效果。分析發(fā)酵效果，其中經(jīng)菌株S6發(fā)酵后re降解率最高，達88. 88%，粗蛋白提高率為 34.45%。經(jīng)菌種鑒定，結果為克雷克酵母(S6)。經(jīng)發(fā)酵效果較好的菌株S1、S3、S6分別組合發(fā)酵，棉籽粕re含量較發(fā)酵前極顯著降低(p<0.01)，CP含量亦極顯著提高(p<0.01)， 其中三菌種復合發(fā)酵效果最優(yōu)re降解率為66. 86%, CP提高率為19. 36%。有益效果用樹下土壤、池塘水處理棉籽粕，本發(fā)明從霉變的棉籽粕中分離到耐高濃度棉酚的優(yōu)勢菌，對其生物學特性和耐棉酚機理進行了初步研究，并在棉籽粕的發(fā)酵工藝中得到了成功應用。使用該發(fā)明生產(chǎn)的高濃度醋酸棉酚降解菌株，具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，適合在動物飼料的發(fā)酵工藝中投加使用，可以縮短生化處理系統(tǒng)的啟動時間，并提高處理效果。優(yōu)勢菌對游離棉酚的降解率都在60. 44% -88. 88%之間，三株菌株按1 1 1比例復合發(fā)酵，效果最優(yōu)，TO降解率為66. 86%，CP提高率為19.36%。并且菌株有很好的穩(wěn)定性，使棉籽粕達到使用標準，加大棉籽粕的利用率。本發(fā)明對于緩解蛋白質資源緊缺，減少大豆進口及棉籽粕廉價出口日本，控制蛋白質資源價格的不斷攀升，增強國力，具有重要的意義。
具體實施例方式以下敘述本發(fā)明的實施例。將本實驗中篩選得到的幾株菌株原種在篩選培養(yǎng)基上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基IOOOml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，將活化好的菌種接入20ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基于IOOml三角瓶得到一級菌種 (條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)，取一級菌種接入Iml于裝有IOOml馬鈴薯液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中為二級菌種(條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)。醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基配方為醋酸棉酚 3g/L，NaN03 2g/L，KCl 0. 5g/L,FeS04 0. 01g/L，MgS04 · 7H20 0. 5g/L, K2HP041. 00g/L，瓊月旨 17g/L, PH 自然，121°C滅菌 30min。具體實施步驟為1)霉變棉籽粕稀釋制成不同梯度后涂布于0. 醋酸棉酚查氏培養(yǎng)基平板上， 300C，恒溫靜置培養(yǎng)3-5天，挑選長勢良好的不同類型菌落，進一步于0. 2 %、0. 3 %的醋酸無糖查氏培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)得到耐較高棉酚含量的菌株。2)將活化好的菌種接入20ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基于IOOml三角瓶得到一級菌種 (條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)，取一級菌種接入Iml于裝有IOOml馬鈴薯液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中為二級菌種(條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)。3)將篩選純化得到的菌株制備成液體菌種，接入到IOOg棉籽粕發(fā)酵底物，接種量為5%，30°C培養(yǎng)48h。烘干測定TO及CP含量，分析發(fā)酵效果。棉籽粕發(fā)酵底物的配方為 將粉碎過篩后的棉籽粕、玉米、麥麩按7 2 1的比例混合均勻構成基礎底物。按底物與水為1 0.8的比例加入水分發(fā)酵，121°C滅菌30min。4)將篩選得到的性能優(yōu)良的菌株(S6)制備成液體菌種，接入IOOg棉籽粕底物中， 接種比例分別按1 1和1 1 1的比例，接種量為5%，置于500ml三角瓶中，30°C，恒溫靜置培養(yǎng)48h。烘干測定re及CP含量，分析發(fā)酵效果。用本發(fā)明的微生物按5%的接種量接種到發(fā)酵底物中，進行發(fā)酵，48小時后分別取樣測定發(fā)酵底物中的游離棉酚的去除率，從表2可以看出，優(yōu)勢菌株對游離棉酚的降解率都在60. 44% -88. 88%之間，并且有很好的穩(wěn)定性，使棉籽粕達到使用標準，加大棉籽粕的利用率。本發(fā)明對于緩解蛋白質資源緊缺，減少大豆進口及棉籽粕廉價出口日本，控制蛋白質資源價格的不斷攀升，增強國力，具有重要的意義。試驗表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌株能顯著降低棉籽粕的毒性，提高棉籽粕的營養(yǎng)價值，豐富了優(yōu)良菌種資源。本發(fā)明成功地解決了飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中棉籽粕飼用率低、 蛋白質飼料資源緊缺的問題。表1醋酸棉酚無糖查氏培養(yǎng)基篩選菌株生長情況
培養(yǎng)基SlS2 S3S4S5S6S7S80.1%醋趣I棉酚無糖查氏培養(yǎng)基+++++++ +++++++++++++++++++++0.2%醋趣I棉酚無糖查氏培養(yǎng)基+++++++ +++++++++++++++++0.3%醋趣I棉酚無糖查氏培養(yǎng)基++++++ ++++++++++++++++++
注:“+”表示菌種的生長情況，“4_”越多表示生長狀況越好?！甠”表示不生長。表2不同菌種及組合發(fā)酵對發(fā)酵效果的影響
權利要求
1.一種醋酸棉酚降解菌S6，其特征在于菌種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏時間為2010年11月沈日，保藏號為CGMCC No. 4371。
2.一種用權利要求1所述的醋酸棉酚降解菌，其特征在于通過以下方法獲得1)發(fā)酵棉籽粕菌種的篩選用樹下土壤和池塘水處理棉籽粕，然后將霉變棉籽粕稀釋不同梯度后涂布于0. 1%醋酸棉酚查氏培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫靜置培養(yǎng)3-5天，挑選長勢良好的不同類型菌落，進一步于0. 2%、0. 3%的醋酸無糖查氏培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)得到耐較高棉酚含量的菌株；2)試驗種子培養(yǎng)制備及方法斜面保存菌種接入20ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基于IOOml三角瓶得到一級菌種(條件為 30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h)，取一級菌種接入Iml于裝有IOOml馬鈴薯液體培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中為二級菌種，其條件為30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h ；3)單菌發(fā)酵效果研究將篩選純化得到的菌株制備成液體菌種，接入IOOg到棉籽粕發(fā)酵底物，接種量為5%， 30°C培養(yǎng)48h ；烘干測定re及CP含量，分析發(fā)酵效果，對優(yōu)勢菌株進行菌種鑒定；棉籽粕發(fā)酵底物的配方為將粉碎過篩后的棉籽粕、玉米、麥麩按7 :2 1的比例混合均勻構成基礎底物；按底物與水為1 0. 8的比例加入水分發(fā)酵，121°C滅菌30min ；4)菌株組合發(fā)酵效果研究將篩選得到的性能優(yōu)良的菌株制備成液體菌種，接入IOOg棉籽粕底物中，接種比例分別按1 :1和1 :1 :1的比例，接種量為5%，置于500ml三角瓶中，30°C，恒溫靜置培養(yǎng)48h ；烘干測定re及CP含量，分析發(fā)酵效果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能降解游離棉酚的一種醋酸棉酚降解菌S6，經(jīng)鑒定為酵母菌目酵母菌科克勒克酵母屬lindneri(Kloeckeralindneri)。主要生物學特性為克雷克酵母乳白色，圓形；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中生長，能在查氏培養(yǎng)基中生長，發(fā)酵葡萄糖；能以0.3%醋酸棉酚為唯一碳源進行生長。并且菌株有很好的穩(wěn)定性，使棉籽粕達到使用標準，加大棉籽粕的利用率。本發(fā)明對于緩解蛋白質資源緊缺，減少大豆進口及棉籽粕廉價出口日本，控制蛋白質資源價格的不斷攀升，增強國力，具有重要的意義。
文檔編號C12R1/645GK102154131SQ201110004190
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權日2011年1月11日
發(fā)明者周光宏, 夏新成, 林海晶, 江蕓, 高峰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學