專利名稱：一種使植物器官變小的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種使植物器官變小的方法。
背景技術(shù)：
隨著人口的不斷増加，耕地的逐漸減少，如何提高作物產(chǎn)量已經(jīng)成為ー個世界性的、汲待解決的重大問題。植物器官大小直接關(guān)系到植物的產(chǎn)量。器官大小不僅受環(huán)境因素影響，而且受內(nèi)源基因的調(diào)控。所以，研究植物體如何實現(xiàn)自身對器官大小的控制已經(jīng)成為提高作物產(chǎn)量的重要策略之一。轉(zhuǎn)錄中介體是存在與所有真核生物中的一個多亞基蛋白復(fù)合體，是介于轉(zhuǎn)錄因子和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機器之間的橋梁。幾乎所有基因的表達(dá)都需要轉(zhuǎn)錄中介體的調(diào)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種使植物器官變小的方法。本發(fā)明所提供的使植物器官變小的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ IDNO :1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉(zhuǎn)基因植物，所述目的轉(zhuǎn)基因植物的器官小于所述出發(fā)植物的器官。上述方法中，所述基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。上述方法中，所述重組表達(dá)載體是向質(zhì)粒pGreen-35S的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的。上述方法中，所述多克隆位點為EcoRI酶切位點。上述方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述方法中，所述出發(fā)植物為雙子葉植物。上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。上述方法中，所述器官變小為花變小和/或葉片變小。上述方法中，所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細(xì)胞面積變小和/或花瓣細(xì)胞的數(shù)目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細(xì)胞面積變小和/或葉片細(xì)胞數(shù)目減少。SEQ ID NO 1所示蛋白在使植物器官變小中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQ ID NO :2所示編碼基因在使植物器官變小中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述出發(fā)植物為雙子葉植物。上述應(yīng)用中，所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。上述應(yīng)用中，所述器官變小為花變小和/或葉片變小。上述應(yīng)用中，所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細(xì)胞面積變小和/或花瓣細(xì)胞的數(shù)目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細(xì)胞面積變小和/或葉片細(xì)胞數(shù)目減
3少。本發(fā)明方法可以實現(xiàn)對作物器官的定向控制。通過本發(fā)明方法，可以根據(jù)實際需要來控制植物器官大小，為改變作物產(chǎn)量、優(yōu)化改良作物農(nóng)藝性狀及植物的遺傳育種奠定了堅實基礎(chǔ)，提供了有利工具，具有重要意義。


圖1為轉(zhuǎn)基因植株的表型。圖2為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、使植物器官變小的方法一、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄新鮮的野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana) (Col-O)幼苗(萌發(fā)后14天)在液氮中研碎。取IOOmg研碎的材料，用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取總RNA。提取完成后，用分光光度計檢測總RNA的濃度。取5 μ g總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(INVITR0GEN) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。ニ、E0D8編碼基因的獲得以cDNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)使用高保真DNA聚合酶試劑盒(Τ0Υ0Β0)，PCR延伸時間為2. 5分鐘，32個循環(huán)。反應(yīng)完成后用rhq (TAKALA)加A。E0D8-F :ATGTCGTCGGAGGTGAAACAGE0D8-R TTTATCCCATGAAGCCAGCTCPCR擴增后，DNA瓊脂糖凝膠電泳，得到約2. 5kb的DNA條帶。用凝膠回收試劑盒 (TIANGEN)回收該片段。回收的片段連入T載體pGEM-T (PR0MEGA)中，得到質(zhì)粒pGEM_E0D8。然后測序(北京擎科生物技術(shù)公司)。測序結(jié)果標(biāo)明，該片段大小為2511bp，核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示，是E0D8的編碼序列(⑶S)。該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO 1所示.三、植物表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒PGreen-35S 和農(nóng)桿菌 GV3IOl 均在文獻(xiàn)“ Li，Y. , Zheng, L.，Corke，F(xiàn). ,Smith, C. , and Bevan, Μ. W. (2008). Control of f final seed and organ size by theDAl gene family in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 22，1331-1336” 中公開過，公眾可從中國科
學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。EcoRI酶切質(zhì)粒pGEM-E0D8，回收251 Ibp的E0D8編碼序列片段，插入到EcoRI酶切并去磷酸化的質(zhì)粒pGreen-35S上。然后用HindIII鑒定片段出入方向。正向插入可以切出21Λ和0. 5kb的條帶(不包括骨架條帶)。反向插入可以切出0. 2kp和0. 5kp的條帶 (不包括骨架條帶)。正向插入得到的重組質(zhì)粒命名為35SpGreen-E0D8_S，用于過表達(dá)E0D8。再將質(zhì)粒35SpGreen-E0D8_S進(jìn)行測序驗證，結(jié)果在pGreen_35S的EcoRI位點間插入的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。重組質(zhì)粒中E0D8基因受35S啟動子控制，終止子為CaMV 35S poly-A terminator。將35SpGreen-E0D8-S 導(dǎo)入農(nóng)桿菌 GV3101，得到含有 35SpGreen-E0D8_S 的農(nóng)桿菌菌株，將該菌株命名為GV3101-E0D8-S。四、轉(zhuǎn)基因植株的獲得用GV3101-E0D8-S 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana)，以獲得轉(zhuǎn) E0D8 基因植株。具體操作如下YEP培養(yǎng)基配制酵母提取物(OXOID) 10g/L，大豆蛋白胨(北京雙旋微生物生物培養(yǎng)基制品廠)10g/L, NaCl 5g/L，其余為水；調(diào)PH值到7. 0。侵染農(nóng)桿菌菌液制備用YEP培養(yǎng)基28攝氏度搖床培養(yǎng)農(nóng)桿菌，直到0D600 = 2. 0-3.0。然后，14攝氏度，4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，以等體積的懸浮液(0. 5g/L MES, 2. 2g/L MS，5%蔗糖，其余為水)懸浮菌體，調(diào)PH值到5. 7后，加入萬分之三體積的Silwet L-77(LEHLE SEEDS，貨號VIS_02)溶液，混勻后進(jìn)行浸染(花序在菌液中浸泡2分鐘)。將花序被菌液侵染后的擬南芥植株在溫室中生長，幼苗抽苔IOcm左右時(約生長 4周)，把主莖花絮去棹。二次抽苔(約1周左右)后，用農(nóng)桿菌侵染正在盛開的花序；侵染條件為遮光密閉M小吋。再將花序被菌液侵染后的擬南芥植株在溫室中生長1個月收種。擬南芥培養(yǎng)條件為長光照(16小時光照)，強度為4000LUX，溫度22攝氏度士 1 攝氏度，濕度60-80%。培養(yǎng)介質(zhì)為按2 1體積混勻的蛭石和營養(yǎng)土?？敲顾乜剐耘囵B(yǎng)基組成由葡萄糖、卡那霉素和1/2MS固體培養(yǎng)基組成，葡萄糖、卡那霉素和1/2MS固體培養(yǎng)基的配比為IOg葡萄糖50μ g卡那霉素1L 1/2MS固體培
ο所收種子在卡那霉素抗性培養(yǎng)基上篩選得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗。方法為異丙醇表面消毒ι分鐘，10%次氯酸鈉表面消毒10分鐘，無菌雙蒸水沖洗5遍，播種于卡那霉素抗性培養(yǎng)基上，4攝氏度春花3天后置于正常培養(yǎng)間長光照培養(yǎng)，約十天后將抗性苗移栽到蛭石和營養(yǎng)土混合基質(zhì)中，常規(guī)培養(yǎng)，10周左右收種，記為Tl代結(jié)的種子。共得到50個株系的Tl 代轉(zhuǎn)E0D8基因擬南芥。同時轉(zhuǎn)入空載體pGreen-35S的擬南芥為轉(zhuǎn)空載體對照。轉(zhuǎn)E0D8基因擬南芥的鑒定得到的Tl代轉(zhuǎn)基因植株通過PCR來進(jìn)ー步鑒定。以新鮮的轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA為模板，用引物對Atlg22M0CAPS-F/Atlg22540CAPS-R 進(jìn)行PCR擴增。引物如下Atlg22540CAPS-F GAAAGCCCAATCAACAAAGTGAtlg22540CAPS-R TTCACAGTAGCAGTTGGAACT。檢測結(jié)果如圖2所示。轉(zhuǎn)基因植株可以擴增出兩條帯，一條是基因組DNA中E0D8 基因?qū)?yīng)的條帶，一條是轉(zhuǎn)基因中E0D8基因cDNA對應(yīng)的條帶。圖中，泳道1_16為轉(zhuǎn)基因擬南芥，泳道17為野生型擬南芥(Col-O)，泳道18為質(zhì)粒35SpGreen-E0D8-S。轉(zhuǎn)空載體對照與野生型對照結(jié)果一祥。五、表型鑒定一、方法
得到的轉(zhuǎn)基因株系在正常條件下培養(yǎng)，期間觀察記錄表型，測量相應(yīng)參數(shù)?；ò旰腿~片面積的測量拍照后用Image J軟件測量。細(xì)胞學(xué)分析首先用透明液(8g水合氯醛，Ilml雙蒸水，Iml甘油)透明花瓣和葉片。透明時間為2天。然后用差相顯微鏡(DIC) (LEICA DM2500)觀察并通過CCD (SPOT FLEX)拍照。最后花瓣的內(nèi)側(cè)表皮細(xì)胞和葉子的葉肉細(xì)胞被測量和統(tǒng)計。細(xì)胞面積測量使用Image J軟件。表達(dá)量分析通過real-time PCR(Lightcycler 480，ROCHE)來分析轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量。熒光染料為 Lightcycler 480 SYBR Green | Master (ROCHE)。內(nèi)參為 ACTIN2。 real-time PCR 弓|物如下Atlg22540CAPS-F GAAAGCCCAATCAACAAAGTGAtlg22540CAPS-R TTCACAGTAGCAGTTGGAACT。ACTIN2F GAAATCACAGCACTTGCACCACTIN2R :AAGCCTTTGATCTTGAGAGC。ニ、結(jié)果見圖1。圖IA I為萌發(fā)后27天的野生型擬南芥植株(Col-O)，II為萌發(fā)后27天的轉(zhuǎn)E0D8 基因擬南芥植株(35S::E0D8#14)。表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉子明顯比野生型植株小。圖IB 1為萌發(fā)后35天的Col_0，II為萌發(fā)后35天的35S: :E0D8#14。此時植株均已抽薹，轉(zhuǎn)基因擬南芥的植株及葉子明顯比野生型植株小。圖IC :1為Col-O的花，II為35S: :E0D8#14的花。表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花明顯
比野生型花小。圖ID 第五片葉子面積的測量，I為Col-0, II為35S: :E0D8#14?？v坐標(biāo)指轉(zhuǎn)基因株系35S: :E0D8#14相對于Col-O第五片葉子最終面積的百分?jǐn)?shù)；橫坐標(biāo)指第五片葉子長出來的天數(shù)。表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的第五片葉子明顯比野生型小。圖IE 第5片葉子的葉片細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目的測量?？v坐標(biāo)指轉(zhuǎn)基因株系 35S::E0D8#14相對于Col-O第五片葉子的葉片細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目的百分?jǐn)?shù)；CA，細(xì)胞面積；CN，細(xì)胞數(shù)目。I 指 Col-0，II 指;35S: :E0D8#14。轉(zhuǎn)基因擬南芥的第5片葉子的葉片細(xì)胞面積平均為野生型的30. 94%。轉(zhuǎn)基因擬南芥的第5片葉子的葉片細(xì)胞數(shù)目平均為野生型的62. 59%。圖1F-1G =IF為Col-O第5片葉子的葉片細(xì)胞；圖IG為35S: :E0D8#14第5片葉子的葉片細(xì)胞。圖IH 花參數(shù)的測量。縱坐標(biāo)指轉(zhuǎn)基因株系相對Col-O的百分比。PA，花瓣面積； CA，花瓣細(xì)胞面積；CN in LD，花瓣長向上的細(xì)胞數(shù)目；CN in WD ；花瓣寬向上的細(xì)胞數(shù)目。 I為Col-0, II為轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#14, III為轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#6。花瓣長向上的細(xì)胞數(shù)目的解釋沿花瓣的最長的方向上畫一條直線，該直線經(jīng)過的細(xì)胞的數(shù)目?；ò陮捪蛏系募?xì)胞數(shù)目的解釋沿花瓣的最寬的方向上畫一條直線，該直線經(jīng)過的細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果花瓣面積轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#14平均為Col-O的84. 34% ；轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#6 平均為 Col-O 的 80. 29%?；ò昙?xì)胞面積轉(zhuǎn)基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的86. 52% ；轉(zhuǎn)基因擬南芥 35S: :E0D8#6 平均為 Col-O 的 80. 21%?；ò觊L向上的細(xì)胞數(shù)目轉(zhuǎn)基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的89. 17% ； 轉(zhuǎn)基因擬南芥:35S: :E0D8#6平均為Col-O的82. 65%。花瓣寬向上的細(xì)胞數(shù)目轉(zhuǎn)基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的94. 38% ； 轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#6平均為為Col-O的90. 21%。圖II :E0D8基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量?？v坐標(biāo)指轉(zhuǎn)基因株系相對Col-O的百分比。I為Col-0, II為轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#14, III為轉(zhuǎn)基因擬南芥35S: :E0D8#6。轉(zhuǎn)空載體對照與野生型對照結(jié)果相同。結(jié)果表明，過表達(dá)E0D8基因使擬南芥整個植株變小，包括花和葉子。而變小的原因是數(shù)目的減少和細(xì)胞的變小共同作用的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.ー種使植物器官變小的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ ID N0:1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉(zhuǎn)基因植物，所述目的轉(zhuǎn)基因植物的器官小于所述出發(fā)植物的器官。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體是向質(zhì)粒 pGreen-35S的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述多克隆位點為EcoRI酶切位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在干所述SEQID NO :1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述出發(fā)植物為雙子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥 (Araoidopsis thaiiana)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述器官變小為花變小和/或葉片變小。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細(xì)胞面積變小和/或花瓣細(xì)胞的數(shù)目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細(xì)胞面積變小和/或葉片細(xì)胞數(shù)目減少。
10.SEQ ID NO :1所示蛋白和/或SEQ ID NO :2所示編碼基因在使植物器官變小中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使植物器官變小的方法。該方法是向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ IDNO1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉(zhuǎn)基因植物，所述目的轉(zhuǎn)基因植物的器官小于所述出發(fā)植物的器官。本發(fā)明方法為改變作物產(chǎn)量、優(yōu)化改良作物農(nóng)藝性狀及植物的遺傳育種奠定了堅實基礎(chǔ)，提供了有利工具，具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK102586265SQ20111000170
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者徐冉, 李云海 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所