專利名稱：針對(duì)生產(chǎn)琥珀酸路徑的工程方法
針對(duì)生產(chǎn)琥珀酸路徑的工程方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年4月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/166，093的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)也是2009年2月3日提交的美國(guó)申請(qǐng)12/529,826的附加部分，所述美國(guó)申請(qǐng)12/529,826是2009年3月19日提交的PCT/US2008/057439的美國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)，該申請(qǐng)要求2007年3月20日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/895，806的權(quán)益，上述每一個(gè)公開文本的整體以引用方式并入本發(fā)明，包括所有圖示、表格和氨基酸或核酸序列。政府支持本發(fā)明是在美國(guó)能源部授予的基金號(hào)USDOE-DE FG02-96ER20222的基金以及美國(guó)能源部協(xié)同美國(guó)農(nóng)業(yè)部一起授予的基金號(hào)USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04G014019的基金支持下完成的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使用微生物催化劑由可再生生物原料生產(chǎn)琥珀酸的領(lǐng)域。本發(fā)明公開了對(duì)生物催化劑的基因修飾，所述基因修飾有助于實(shí)現(xiàn)高效率生產(chǎn)琥珀酸。更具體地說，本發(fā)明提供了基因修飾的生物催化劑，所述催化劑適用于由可再生原料生產(chǎn)商業(yè)上有效量的琥珀酸。一份美國(guó)能源部 2004 年題為“Top value added chemicals from biomass”的報(bào)道識(shí)別了 12種可由可再生原料制備的砌塊化學(xué)品。這12種糖基合成砌塊是1，4_ 二元酸(琥珀酸、反丁烯二酸和順丁烯二酸)、2，5-呋喃二羧酸、3-羥基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羥基丁內(nèi)酯、甘油、山梨醇、和木糖醇/阿拉伯糖醇。在石油價(jià)格上漲的情況下，這些來自可再生原料的砌塊化學(xué)品的發(fā)酵產(chǎn)品將越來越具有競(jìng)爭(zhēng)力。這些砌塊化學(xué)品是含多功能基團(tuán)的分子，有望成為一類新的有用分子家族。這12種砌塊化學(xué)品隨后能被轉(zhuǎn)化為許多高價(jià)值生物基化學(xué)品或材料。例如，琥珀酸鹽能夠作為底物轉(zhuǎn)化成塑料、溶劑和其他通常由石油制備的化學(xué)品((Lee等人，2004 ；Lee等人，2005 ；McKinlay等人,2007 ;Wendisch等人,2006 ;Zeikus等人，1999)。許多細(xì)菌已被描述為具有生產(chǎn)琥珀酸鹽的天然能力，所述琥珀酸鹽是作為一種主要的發(fā)酵產(chǎn)品(如表I所示)。然而，從這些天然發(fā)生的產(chǎn)琥珀酸微生物制備琥珀酸的過程復(fù)雜，并需要昂貴的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。先前各種基因方法已被用于設(shè)計(jì)產(chǎn)琥拍酸大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)菌株，獲得了不同程度的成功(如表I所示)。在大多數(shù)研究中，獲得的效價(jià)較低并且需要天然培養(yǎng)基組分，例如酵母提取物或玉米漿。大腸桿菌菌株NZNlll生產(chǎn)IOSmM琥珀酸鹽，摩爾產(chǎn)率是每摩爾代謝葡萄糖生成O. 98mol琥拍酸鹽(Chatterjee等人,2001 ;Millard等人，1996 ；Stols和Donnelly，1997)。這種菌株的設(shè)計(jì)方法是使兩種基因(pflB編碼丙酮酸甲酸裂解酶和IdhA編碼乳酸脫氫酶)失活，并從多拷貝質(zhì)粒過量表達(dá)兩種大腸桿菌基因(蘋果酸脫氫酶基因(mdh)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc))。大腸桿菌菌株HL27659k的設(shè)計(jì)方法是使琥珀酸脫氫酶(sdhAB)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ackA)、丙酮酸鹽氧化酶(poxB)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ptsG)和異檸檬酸裂解酶抑制劑(iclR)發(fā)生突變。這種菌株生成效價(jià)低于IOOmM的琥拍酸鹽,且要求氧限制發(fā)酵條件(Cox等人,2006 ；Lin等人，2005a，2005b, 2005c ；Yun等人，2005)。新陳代謝的計(jì)算機(jī)模擬分析被用于設(shè)計(jì)基因敲除以在大腸桿菌中創(chuàng)造一條類似于曼海姆產(chǎn)琥拍酸菌(Mannheimia succiniciproducens)中的天然琥珀酸路徑的路徑(Lee等人，2005and 2006)。然而，所合成的菌株生成非常少的琥珀酸鹽。Andersson等人(2007)報(bào)道由僅含天然基因的工程大腸桿菌獲得了最高水平的琥珀酸鹽產(chǎn)品(339mM)。其他研究者致力于研究另一些方法表達(dá)大腸桿菌中的異源性基因。菜豆根瘤菌(Rhizobium eteloti)丙酮酸羧化酶(pyc)從多拷貝質(zhì)粒中過量表達(dá),引導(dǎo)碳流向琥拍酸鹽(Gokarn等人，2000 ；Vemuri等人，2002a, 2002b)。菌株SBS550MG通過使異檸檬酸裂解 酶(iclR)、乙醇脫氫酶(adhE)、乳酸脫氫酶(IdhA)和乙酸激酶(ackA)失活,并從多拷貝質(zhì)粒中過量表達(dá)枯草芽孢桿菌CitZ(檸檬酸鹽合成酶)和菜豆根瘤菌丙酮酸羧化酶(R. etlipyc)而被構(gòu)建(Sanchez等人,2005a)。利用該菌株，由葡萄糖生成160mM琥拍酸鹽,摩爾產(chǎn)率為I. 6。還有更多復(fù)雜的過程被研究用于琥珀酸鹽生產(chǎn)(表I所示)。許多方法包括一個(gè)有氧生長(zhǎng)期和隨后的一個(gè)厭氧生產(chǎn)期。厭氧期通常需供給二氧化碳、氫氣或以上兩種(Andersson 等人，2007 ；Sanchez 等人，2005a 和 2005b ；Sanchez 等人，2006 ；US 5，869，301 ；Vemuri等人，2002a和2002b)。在最近一個(gè)使用天然琥珀酸鹽生產(chǎn)原料的研究中，產(chǎn)琥珀酸厭氧螺旋菌(A. succiniciproducens)、電透析、CO2鼓泡、細(xì)胞再生和分批給料相結(jié)合,用葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸鹽，獲得了高產(chǎn)率、效價(jià)和產(chǎn)量(Meynial-Salles等人，2007)。目前為止，大多數(shù)大腸桿菌的科學(xué)知識(shí)是來自于在天然培養(yǎng)基(例如LB培養(yǎng)基)而非在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的研究，在這些研究中使用低濃度的糖底物(典型地0. 2% w/V ；llmM)而非此處報(bào)道的研究中所用的5% (w/v)葡萄糖(278mM)和10% (w/v)葡萄糖(555mM)。生產(chǎn)商業(yè)上有效水平的產(chǎn)品需要使用大量的糖。先前的研究者已經(jīng)描述了許多大腸桿菌派生物的構(gòu)建，用于在天然培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸鹽(表I所示)。使用天然培養(yǎng)基，基于主要路徑的合理設(shè)計(jì)在代謝工程的學(xué)術(shù)證明上已經(jīng)相當(dāng)?shù)爻晒?。然而，天然營(yíng)養(yǎng)物在生產(chǎn)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)品中的使用，增加了材料成本、提純成本，以及與廢物處理相關(guān)的成本。使用不含天然培養(yǎng)基成分的無機(jī)鹽培養(yǎng)基在節(jié)約成本方面更加可取。E. coli C在含葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，生成的發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇和琥珀酸鹽的混合物(見圖1A，表4)。與其他關(guān)于大腸桿菌的研究(見表
I)相比，此處報(bào)道的研究主要集中于菌株的培育，所述菌株能夠使用無機(jī)鹽培養(yǎng)基將高水平的糖轉(zhuǎn)化成琥珀酸鹽，以減少材料、琥珀酸鹽純化和廢物處理的成本。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了多種大腸桿菌菌株，所述菌株在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中在簡(jiǎn)單的、PH控制的、分批的發(fā)酵過程中生成高效價(jià)和產(chǎn)率的琥珀酸鹽，而無需異源基因或質(zhì)粒。發(fā)明人意外地識(shí)別了一些目標(biāo)基因，這些目標(biāo)基因在為了實(shí)現(xiàn)高效率生產(chǎn)琥珀酸而進(jìn)行的對(duì)生物催化劑的基因操作中是有用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種獲得生物催化劑的方法，該生物催化劑用于由生物原料制備琥珀酸。所述方法兼有合理的基因操作和代謝進(jìn)化過程。在獲得用于由生物原料生產(chǎn)琥珀酸的生物催化劑的過程中，使用一種合理的設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)來源于我們現(xiàn)有的關(guān)于微生物代謝路徑的知識(shí)，使一組細(xì)菌染色體內(nèi)的基因失活，隨后進(jìn)行代謝進(jìn)化過程以篩選具有所希望表型的菌株。本發(fā)明的一個(gè)方面，細(xì)菌染色體內(nèi)基因的突變是在不引入任何外源基因材料的條件下完成的。本發(fā)明另一個(gè)方面，內(nèi)源基因的突變是通過在內(nèi)源基因的開放閱讀框引入點(diǎn)突變或引入終止密碼子完成的。本發(fā)明的另一個(gè)方面，內(nèi)源基因的整個(gè)開放閱讀框被從染色體DNA中刪除。
在本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方式中，某些內(nèi)源基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄通過在內(nèi)源基因的啟動(dòng)子區(qū)域引入某些突變而得到增強(qiáng)。在本發(fā)明的其他方面，內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平通過解除目標(biāo)基因的阻遏調(diào)控而得到提高。在本發(fā)明的某一方面，為了篩選含有突變基因的細(xì)菌菌株，所述突變基因具有所希望的表型，可以引入外源核苷酸序列使目標(biāo)基因失活。本發(fā)明最優(yōu)選的方面，引入微生物基因組的外源核苷酸序列，隨后以無縫方式被消除，沒有留下任何殘余外源核苷酸序列。合理的基因操作可以是通過單階段或多階段完成，其中單階段基因改變是一次性完成。由基因操作獲得的微生物菌株可以進(jìn)行代謝進(jìn)化以提高所希望獲得的有機(jī)酸的產(chǎn)率、效價(jià)和體積產(chǎn)量。在本發(fā)明最優(yōu)選的方面，合理的基因操作是分階段完成，且在基因操作的各階段之間進(jìn)行代謝進(jìn)化過程。本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在代謝進(jìn)化過程中發(fā)生的自發(fā)突變通過對(duì)染色體DNA適當(dāng)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序而被識(shí)別。在本發(fā)明另一種實(shí)施方式中，代謝進(jìn)化過程中發(fā)生的突變通過測(cè)定可疑酶(suspect enzyme)的活性而被識(shí)別。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在合理設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過一種或多種突變使一種或多種基因失活，所述的基因編碼已知在發(fā)酵路徑中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，除了使編碼直接參與到發(fā)酵路徑的蛋白質(zhì)的基因失活之外，還使與編碼在發(fā)酵路徑中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)的基因功能相似的基因失活。在本發(fā)明一種實(shí)施方式中，對(duì)在三羧酸(TCA)循環(huán)中起作用的基因進(jìn)行基因操作，以增加碳向琥珀酸生產(chǎn)的流動(dòng)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過TCA循環(huán)的還原臂(reductive arm)的碳流增加。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，對(duì)通過TCA循環(huán)的氧化臂(oxidative arm)的碳流進(jìn)行基因操作。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過對(duì)與TCA循環(huán)緊密相連的乙醛酸支路路徑進(jìn)行基因操縱，增加流向琥珀酸的碳流。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，在細(xì)胞內(nèi)從TCA流向其他代謝路徑的碳流被阻斷，以使細(xì)胞內(nèi)的碳池漏向琥珀酸生產(chǎn)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)一種或更多種羧化酶(carboxylating enzymes)的基因操作使得進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流增加。在本發(fā)明的一個(gè)方面，一種或更多種羧化酶的表達(dá)通過對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的基因操作或解除對(duì)基因表達(dá)的阻遏而得以實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，細(xì)胞內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸池，通過改變那些參與到需要磷酸烯醇式丙酮酸的碳攝取路徑的基因而得到保存。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用于碳攝取的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)失活，目的是保存TCA循環(huán)運(yùn)行可獲得的磷酸烯醇式丙酮酸。本發(fā)明列舉了一些可進(jìn)行基因操作以增加琥珀酸生產(chǎn)的目標(biāo)物。本發(fā)明所描述的所有這些各種各樣的目標(biāo)物可以進(jìn)行基因操作以改進(jìn)琥珀酸生產(chǎn)。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方式中，最小數(shù)量的目標(biāo)物被選擇進(jìn)行基因操縱，以實(shí)現(xiàn)所希望的琥珀酸生產(chǎn)速度。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，能夠高效價(jià)、產(chǎn)率和體積生產(chǎn)量地生產(chǎn)琥珀酸的生物催化劑被選出。在本發(fā)明最優(yōu)選的方面，優(yōu)選的生物催化劑能夠每消耗Imol碳源至少生產(chǎn)I. Omol琥珀酸。在本發(fā)明另一種最優(yōu)選實(shí)施方式中，生物催化劑在代謝進(jìn)化過程中被選出，它能夠在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中每消耗Imol碳源至少生產(chǎn)I. Omol琥珀酸，且將琥珀酸生產(chǎn)與微生物生長(zhǎng)結(jié)合。在本發(fā)明另一種實(shí)施方式中，生物催化劑能夠使用甘油作為原料生產(chǎn)琥珀酸。
本發(fā)明的其他優(yōu)勢(shì)，將在接下來的詳細(xì)描述和提供的實(shí)施例中變得顯而易見。


圖1A-1B :葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸鹽。圖IA顯示大腸桿菌中葡萄糖發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)路徑。所述路徑根據(jù)Unden和Kleefeld(2004)重新繪制。粗體箭頭代表主要的發(fā)酵路徑。叉代表基因刪除，所述基因刪除在本研究中用以設(shè)計(jì)KJ012(ldhA，adhE, ackA)?；蚝兔窱dhA,乳酸脫氫酶；pflB,丙酮酸甲酸裂解酶；focA,甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pta,磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脫氫酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；gltA,朽1檬酸合成酶；mdh,蘋果酸脫氫酶；fumA、fumB和fumC,延胡索酸酶同工酶；frdAB⑶,延胡索酸還原酶；fdh,甲酸脫氫酶；icd,異朽1檬酸脫氫酶；acs,乙酰輔酶A合成酶；mgsA，丙酮醛合成酶；poxB，丙酮酸氧化酶；aldA，乙醛脫氫酶；以及aldB，乙醛脫氫酶。圖IB顯示了大腸桿菌的工程菌株中ATP生產(chǎn)和生長(zhǎng)與琥珀酸生產(chǎn)的結(jié)合，其用于葡萄糖發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)路徑。實(shí)線箭頭連接NADH池。點(diǎn)線箭頭連接NAD+池。在厭氧條件下的糖酵解過程中，生長(zhǎng)有必要與ATP生產(chǎn)和NADH的氧化結(jié)合。圖2A-2D :大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸的潛在羧化路徑。編碼關(guān)鍵羧化酶的基因用粗體顯示。圖2A顯示磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶(PPC)催化的反應(yīng)。PPC酶催化的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的羧化反應(yīng)不產(chǎn)生ATP。這被認(rèn)為是葡萄糖發(fā)酵過程中大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸鹽的主要路線。圖2B顯示了 NADH依賴性蘋果酸酶。能量在丙酮酸激酶(pykA或pykF)作用下在由ADP和PEP生成ATP的過程中被儲(chǔ)存。蘋果酸酶(sfcA)催化與NADH關(guān)聯(lián)的還原羧化反應(yīng)以生產(chǎn)蘋果酸。圖2C顯示NADPH依賴性蘋果酸酶。能量在丙酮酸激酶(pykA或pykF)作用下在由ADP和PEP生成ATP的過程中被儲(chǔ)存。蘋果酸酶(maeB)催化與NADPH關(guān)聯(lián)的還原羧化反應(yīng)以生產(chǎn)蘋果酸。圖2D顯示被PEP羧激酶(PCK)催化的反應(yīng)。能量通過生成ATP而被儲(chǔ)存，所述ATP的生成發(fā)生在PEP羧化生產(chǎn)草酰乙酸的過程中。圖3A-3C :KJ012代謝進(jìn)化生產(chǎn)KJ017，KJ032，和KJ060過程中的生長(zhǎng)。菌株KJ012在NBS培養(yǎng)基上被連續(xù)轉(zhuǎn)接，所述NBS培養(yǎng)基包含5% (w/v)(圖3A)和10% (w/v)(圖3B)葡萄糖，分別生產(chǎn)KJ017。在刪除focA和pflB后，合成的菌株(KJ032)首先在添加有乙酸鹽的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)(圖3C)。在進(jìn)一步轉(zhuǎn)接生產(chǎn)KJ060的過程中，乙酸鹽水平下降，隨后去除。間斷線作為對(duì)照，代表KJ017在不加乙酸鹽條件下的發(fā)酵情況。符號(hào)籲=OD55tol光密度。圖4A-4F :在產(chǎn)琥珀酸菌株的代謝進(jìn)化過程中，發(fā)酵產(chǎn)品的總結(jié)。培養(yǎng)物如文中所述添加乙酸鈉。黑箭頭代表如文中所述的發(fā)酵條件的轉(zhuǎn)換。KJ032代謝進(jìn)化過程沒有檢測(cè)到甲酸，僅檢測(cè)到少量乳酸。KJ070和KJ072代謝進(jìn)化過程沒有檢測(cè)到甲酸和乳酸。KJ012到KJ017的代謝進(jìn)化，分別在含5% w/v葡萄糖的培養(yǎng)基(圖4A)和含10% w/v葡萄糖的培養(yǎng)基(圖4B)中進(jìn)行。KJ032到KJ060的代謝進(jìn)化，分別在含5% w/v葡萄糖的培養(yǎng)基(圖4C)和含10% w/v葡萄糖的培養(yǎng)基(圖4D)中進(jìn)行。KJ070到KJ071的代謝進(jìn)化在含10%w/v葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行(圖4E)。KJ072到KJ073的代謝進(jìn)化在含10% w/v葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行(圖4F)。圖4A-4F符號(hào)■，琥珀酸；□，甲酸；Λ，乙酸；▲，蘋果酸； ，乳酸；和▼,丙酮酸。圖5 E. coli C的基因操作和代謝進(jìn)化步驟總結(jié)示意圖，所述的E. coli C作為生物催化劑用于生產(chǎn)琥珀酸鹽。所述過程代表261步連續(xù)的轉(zhuǎn)接，提供了超過2000代基于生 長(zhǎng)的選擇?？寺拿糠N培養(yǎng)方法的終培養(yǎng)物中被分離，并被指定菌株名字，見表4。圖6 :6_磷酸-葡萄糖發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)路徑及其關(guān)聯(lián)路徑，顯示了經(jīng)設(shè)計(jì)用于琥珀酸生產(chǎn)的構(gòu)建物中已經(jīng)被慎重刪除的基因。實(shí)線箭頭代表主要的發(fā)酵路徑。虛線箭頭代表丙酮酸氧化生成乙酸的微好氧路徑。點(diǎn)線箭頭顯示包含乙醛酸支路的路徑，所述路徑通常在有氧代謝中起作用。加框的叉表示三種起始基因的刪除(ldhA，adhE，ackA)，這些基因用于構(gòu)建KJ012和KJ017。普通的叉標(biāo)記其他基因，這些基因在KJ017派生物的構(gòu)建過程中被刪除，所述 KJ017 派生物為KJ032 (ldhA, adhE, ackA, focA, pflB)，和 KJ070 (ldhA, adhE, ackA,focA, pflB’mgsA)，及 KJ072 (ldhA, adhE, ackA, focA, pflB,mgsA, poxB)。基因和酶ldhA,乳酸脫氫酶；focA,甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pflB,丙酮酸甲酸裂解酶；pta,磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；ackA,乙酸激酶；adhE，乙醇脫氫酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；gltA，朽1檬酸合成酶；mdh,蘋果酸脫氫酶；fumA, fumB, and fumC,延胡索酸酶同工酶；frdABCD,延胡索酸還原酶；fdh,甲酸脫氫酶；mgsA,丙酮醒合成酶；gloAB,乙二醒酶I和II ;poxB,丙酮酸氧化酶；aceA,異朽1檬酸裂解酶；aceB,蘋果酸合成酶；acnAB,順烏頭酸酶；和acs,乙酰輔酶A合成酶。圖7A-7C :由E. coli C派生物在含有10%葡萄糖(w/v)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸和蘋果酸。圖7A顯示在AMl培養(yǎng)基中由KJ060生產(chǎn)琥珀酸。圖7B顯示在AMl培養(yǎng)基中由KJ073生產(chǎn)琥珀酸。圖7C顯示在NBS培養(yǎng)基中由KJ071生產(chǎn)蘋果酸。發(fā)酵接種量以細(xì)胞干重(DCW)計(jì)為33mg Γ1。圖7A-7C符號(hào)O，葡萄糖；籲，琥珀酸；■，蘋果酸；Λ，細(xì)胞量。圖8 :構(gòu)建質(zhì)粒pL0I4162涉及的步驟。與pEL04和pL0I4152相關(guān)的短實(shí)線箭頭代表引物，所述引物用于DNA擴(kuò)增。圖9 :在KJ073中由6_磷酸-葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸。用于編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以反向型顯示，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在本研究中是參與琥珀酸生產(chǎn)的主要羧化酶。實(shí)線箭頭表示預(yù)期會(huì)在葡萄糖厭氧發(fā)酵過程中起作用的反應(yīng)。加框的叉代表用于構(gòu)建產(chǎn)琥珀酸的初始菌株KJ017(ldhA，adhE，ackA)的關(guān)鍵刪除。虛線代表丙酮酸利用PoxB氧化為乙酸，這是一個(gè)典型的僅在微好氧條件下起作用的過程。點(diǎn)線表示主要與有氧代謝有關(guān)的反應(yīng)?；蚝兔竘dhA，乳酸脫氫酶；fflB，丙酮酸甲酸裂解酶；focA，甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；pta，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脫氫酶；pck，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；pdh,丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；gltA,朽1檬酸合成酶；mdh,蘋果酸脫氫酶；fumA, fumB, andfumC，延胡索酸同工酶A，B, C ;frdAB⑶，延胡索酸還原酶AB⑶；fdh，甲酸脫氫酶；icd，異檸檬酸脫氫酶；acs,乙酰輔酶A合成酶；mgsA,丙酮醒合成酶；poxB,丙酮酸氧化酶；aldA,乙醛脫氫酶A ;和aldB，乙醛脫氫酶B。tdcE基因(丙酮酸甲酸裂解酶，與pflB同源)和tcdD基因(丙酸激酶，與ackA同源)顯示在括號(hào)中，且通常在蘇氨酸降解過程中被表達(dá)。圖10 :代謝的展開部分，說明其他基因的路徑，這些基因已被刪除(實(shí)線叉)。KJ073發(fā)酵的主要產(chǎn)物(加框的)是琥珀酸和乙酸。基因和酶CitDEF，檸檬酸裂解酶；gltA,朽1檬酸合成酶；aspC,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；pck,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；sfcA,NAD+-蘋果酸酶；fumA & fumB,延胡索酸酶；frdABO),延胡索酸還原酶；pykA & pykF,丙酮酸激酶；tdcE,丙酮酸甲酸裂解酶(pflB的同源基因);pta,磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；tcdD,乙酸激酶(ackA的同源基因)·圖11 :在經(jīng)設(shè)計(jì)用于琥珀酸生產(chǎn)的大腸桿菌菌株中的葡萄糖發(fā)酵。5個(gè)實(shí)心五角星表示已經(jīng)被阻斷的代謝步驟，所述的阻斷是通過構(gòu)建基因刪除實(shí)現(xiàn)的。2個(gè)空心五角星表 示已經(jīng)被阻斷的代謝步驟，所述的阻斷是通過代謝進(jìn)化過程中獲得的突變而實(shí)現(xiàn)的。點(diǎn)線箭頭表示生產(chǎn)琥珀酸的突變體(KJ060和KJ073)沒有功能活性或者只有微弱的功能活性。垂直方向的粗體箭頭表示KJ060和KJ073中生產(chǎn)琥珀酸鹽的主要路徑。所述路徑功能上相當(dāng)于生產(chǎn)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌的路徑。galP和pck兩種基因在菌株培育過程中通過轉(zhuǎn)錄激活。在基于生長(zhǎng)的選擇過程中，獲得PtsI中的一個(gè)缺失(空心五角星)，使得用于攝取和磷酸化的天然葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)失活。GalP隨后被發(fā)現(xiàn)充當(dāng)葡萄糖的主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，隨之進(jìn)行葡萄糖激酶(glk)作用下的ATP依賴性磷酸化作用。圖12A-12C :多種產(chǎn)琥珀酸工程菌株的轉(zhuǎn)錄豐度比較。圖12A顯示大腸桿菌ATCC8739，KJ012，KJ017，KJ060，KJ071 和 KJ073 菌株中基因 pck，ppc，sfcA 和 maeB 的轉(zhuǎn)錄相對(duì)豐度。圖12B顯示大腸桿菌的ATCC8739，KJO12，KJO17，KJ060, KJ071和KJ073菌株中與葡萄糖利用相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄相對(duì)豐度，所述的與葡萄糖利用相關(guān)的基因名為cyaA，crp,ptsG，galP 和 glk。圖 12C 顯示大腸桿菌 ATCC8739，KJ012, KJ017, KJ060, KJ071 和 KJ073菌株中ptsl和err基因的轉(zhuǎn)錄相對(duì)豐度。圖13 :使用混合酸發(fā)酵路徑的大腸桿菌厭氧代謝路徑(Bock & Sawers, 1996)。天然混合酸路徑用黑箭頭顯示。另外的用于葡萄糖攝取、羧化和乙酰輔酶A合成的反應(yīng)如點(diǎn)線箭頭所示。粗體點(diǎn)線箭頭表示用于在大腸桿菌突變體中生產(chǎn)琥珀酸的新的代謝步驟。通過基因刪除或點(diǎn)突變而阻斷的反應(yīng)用一個(gè)X標(biāo)記。pck*表示一種新的突變，所述突變解除了對(duì)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的阻遏，增強(qiáng)了活性并且允許所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶充當(dāng)草酰乙酸生產(chǎn)的主要路線。在本圖中丙酮酸(加框的)出現(xiàn)在兩個(gè)位置，但作為單一的細(xì)胞內(nèi)的池體存在。圖14.:在野生型大腸桿菌中，普遍公認(rèn)的甘油代謝路徑與混合酸發(fā)酵(厭氧)結(jié)合。這些路徑是以EcoSal中的最新進(jìn)展、Ecocyc中可獲得的數(shù)據(jù)和主要文獻(xiàn)的回顧的結(jié)合為基礎(chǔ)(Bachler 等人，2005 ；Berman 和 Lin, 1971 ；Bock 和 Sawers, 1996 ；Erni 等人，2006 ；Gutknecht 等人，2001 ； Jin 等人，1983 ；Keseler 等人，2005 ；Lin, 1996 ；Tang 等人，1982)。粗體箭頭表示通常被認(rèn)為在甘油代謝和混合酸發(fā)酵中占優(yōu)勢(shì)的路徑。細(xì)線箭頭顯示一條被認(rèn)為在野生型大腸桿菌中是隱秘的和非功能性的路徑(Jin等人，1983 ；Tang等人，1982)，所述路徑涉及二羥基丙酮作為中間體。這條路徑被認(rèn)為僅在突變體中起作用，所述突變體中g(shù)lpK是失活的(Jin等人，1983 ；Tang等人，1982)。細(xì)線箭頭還顯示glpD,所述脫氫酶被認(rèn)為在有氧代謝過程中起作用，作為glpABC(厭氧代謝)的一種替代?？s略詞DHA，二羥基丙酮；DHAP，3-磷酸-二羥基丙酮；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸鹽；G3P，3-磷酸-甘油；GA3P，3_磷酸-甘油醛。PEP被加框，表示一種共用池。圖15 :新的大腸桿菌路徑，用于在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中由甘油厭氧生產(chǎn)琥珀酸。粗體箭頭表示在含有三個(gè)核心突變的菌株(例如XZ721)中甘油厭氧代謝生產(chǎn)琥珀酸的主要路徑。點(diǎn)線箭頭顯示被PflB和ptsl中的突變阻斷的路徑。在這條路徑中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的突變活化(pck*)允許所述酶充當(dāng)生產(chǎn)草酰乙酸的主要羧化步驟。不同于另一種可供選擇的羧化酶一磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)，PCK儲(chǔ)存能量以生產(chǎn)額外的ATP用于生物合成。
具體實(shí)施方式

本發(fā)明使用的術(shù)語“效價(jià)(titer)”是指發(fā)酵液中特定化合物的體積摩爾濃度。因此，本發(fā)明琥珀酸生產(chǎn)的發(fā)酵過程中，琥珀酸效價(jià)IOOmM是指測(cè)量時(shí)每升發(fā)酵液中含有100毫摩爾琥珀酸。本發(fā)明使用的術(shù)語“產(chǎn)率”是指發(fā)酵過程中，每消耗Imol原料生產(chǎn)的特定化合物的摩爾量。因此，在以葡萄糖作為原料生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵過程中，術(shù)語產(chǎn)率是指每消耗Imol葡萄糖生成的琥珀酸的摩爾量。本發(fā)明使用的術(shù)語“體積產(chǎn)量”是指單位時(shí)間單位體積生產(chǎn)的特定化合物的克數(shù)。因此，琥珀酸體積產(chǎn)量為O. 9gL-lh-l，表示在I升發(fā)酵液中在I小時(shí)生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)累積得到O. 9g琥珀酸。本發(fā)明使用的術(shù)語“效價(jià)”、“產(chǎn)率”和“體積產(chǎn)量”還包括“標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)”、“標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)率”和“標(biāo)準(zhǔn)體積產(chǎn)量”。在標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)、標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)率和標(biāo)準(zhǔn)體積產(chǎn)量的測(cè)定中，中和試劑的體積也需加以考慮，所述中和試劑被加入發(fā)酵容器中以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值。此處所用的術(shù)語“基因工程”或“基因修飾”是指通過操作微生物的染色體DNA改變微生物中一種或多種酶的表達(dá)的實(shí)踐。本發(fā)明提供了一種利用基因修飾細(xì)菌菌株(GMBS)由碳化合物生產(chǎn)商業(yè)上有效量的琥珀酸的方法。本發(fā)明公開了適合于通過發(fā)酵過程生產(chǎn)琥珀酸的微生物。本發(fā)明使用的術(shù)語“基因”包括基因的開放閱讀框以及上游和下游調(diào)控序列。上游調(diào)控區(qū)域也被稱為基因的啟動(dòng)子區(qū)域。下游調(diào)控區(qū)域也被稱為終止子序列區(qū)域。本發(fā)明使用的術(shù)語“突變”是指對(duì)基因進(jìn)行基因修飾，所述基因包括開放閱讀框、上游調(diào)控區(qū)域和下游調(diào)控區(qū)域。基因突變的結(jié)果為基因開放閱讀框轉(zhuǎn)錄的上調(diào)或下調(diào)或完全抑制?；蛲蛔兺ㄟ^下列方法實(shí)現(xiàn)刪除基因的整個(gè)編碼區(qū)域或部分編碼核苷酸序列，或者引入移碼突變、錯(cuò)義突變和插入點(diǎn)，或者引入終止密碼子，或者上述方式的組合。本發(fā)明使用的術(shù)語“外源”是指來自細(xì)胞外部的分子或活性被引入宿主微生物有機(jī)體。就被引入微生物細(xì)胞的外源核酸分子而言，引入的核酸可以以獨(dú)立的質(zhì)粒或以整合到宿主染色體DNA中的形式存在。編碼蛋白的外源核酸可以攜帶其自身的調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子和終止子序列)以一種可被表達(dá)的形式被引入微生物細(xì)胞。另一種方法是，所述外源核酸分子可以整合到宿主染色體DNA中，且可以受宿主調(diào)控序列的控制。術(shù)語“內(nèi)源”是指存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的分子和活性。當(dāng)被視為一種生物合成活性使用時(shí)，術(shù)語“內(nèi)源”是指一種被引入宿主涉及有機(jī)體(host reference organism)的活性。來源可以是，例如同源或異源編碼核酸，所述的同源或異源編碼核酸在引入宿主微生物有機(jī)體后表達(dá)相關(guān)的活性。如果編碼蛋白的核酸是從同種微生物有機(jī)體獲得，那么就被稱為同源DNA。如果核酸來自不同的微生物物種，那么稱為異源DNA。不考慮DNA的本質(zhì)，不管是同源還是異源，當(dāng)DNA被引入宿主細(xì)胞時(shí)，所述DNA以及來自于該DNA的活性被視為外源。因此，本發(fā)明編碼核酸的外源表達(dá)可以利用異源和同源編碼核酸中的一種或兩種。本發(fā)明提供GMBS，當(dāng)所述GMBS在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中在發(fā)酵條件下生長(zhǎng)以生產(chǎn)琥珀酸時(shí)，獲得了令人印象深刻的效價(jià)、高產(chǎn)率和顯著的體積產(chǎn)量，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基含有在發(fā)酵過程中作為底物的碳源。本發(fā)明的微生物能夠用于單一步驟的生產(chǎn)過程，所述生產(chǎn)過程使用各種糖，例如己糖、戊糖、二糖和其他碳化合物，例如甘油。
在本發(fā)明中，獨(dú)特而有利的基因突變的組合被用于引導(dǎo)碳流向琥珀酸生產(chǎn)。另外，琥珀酸生產(chǎn)與微生物的生長(zhǎng)相結(jié)合，所述微生物生長(zhǎng)轉(zhuǎn)而與細(xì)胞的ATP水平和氧化還原平衡相聯(lián)系。術(shù)語“氧化還原平衡”是指細(xì)胞維持合適的NADH與NAD+的比例的能力。也就是說，細(xì)胞能夠使NADH氧化，使得在厭氧發(fā)酵生長(zhǎng)過程中有足夠的NAD+來使糖類底物氧化。在厭氧生長(zhǎng)過程中，NAD+池能夠通過NADH的氧化磷酸化再生。然而，在厭氧生長(zhǎng)條件下，NAD+池的再生只有依靠操作碳流通過細(xì)胞內(nèi)各種能夠使NADH氧化的代謝路徑而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，基因修飾僅涉及微生物天然基因組內(nèi)的基因操作。在所述的實(shí)施方式中，用作琥珀酸生產(chǎn)的生物催化劑的細(xì)菌菌株中沒有引入外源基因材料，例如帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒，或任何其它編碼某些酶蛋白的外源核酸序列。適合本發(fā)明的重組微生物來源于一些細(xì)菌家族，優(yōu)選來源于腸桿菌科家族。合適的微生物選自埃希氏桿菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅維斯登菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。特別優(yōu)選埃希氏桿菌屬。在埃希氏桿菌屬中，特別優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)種。大腸桿菌種中的任意一類菌株均適用于本發(fā)明，如 E. coli B, E. coli C，E. coli W 或諸如此類。大腸桿菌菌株能夠生產(chǎn)有效量的有機(jī)酸為本領(lǐng)域公知。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)US2009/0148914提供了大腸桿菌菌株，其作為生物催化劑用于生產(chǎn)化學(xué)純乙酸和/或丙酮酸。美國(guó)專利申請(qǐng)US2007/0037265和美國(guó)專利US7，629, 162提供了 E. coli KOll菌株的派生物，用于生產(chǎn)乳酸。PCT申請(qǐng)WO 2008/115958提供了工程化微生物，該工程化微生物用于在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸和蘋果酸，所述的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基中含有葡萄糖作為PH控制的分批發(fā)酵的碳源。本發(fā)明的一些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明可以進(jìn)行修飾的細(xì)菌包括，但不限于氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans),淺井氏葡糖桿菌(Gluconobacter asaii),帶馬瓦無色桿菌(Achromobacter delmarvae),粘液無色桿菌(Achromobacter viscosus),乳無色桿菌(Achromobacter Iacticum),根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens),放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter),幾產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes faecalis),梓樣節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)，腫脹節(jié)桿菌(Arthrobacter tumescens)，石錯(cuò)節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus)，裂徑谷氨酸節(jié)桿菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus)，氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)，天牛短小桿菌(Aureobacterium saperdae)，印度固氮菌(Azotobacter indicus)，產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)，叉分短桿菌(divaricatum)，乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，球形短桿菌(Brevibacterium globosum)，暗褐短桿菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短桿菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，創(chuàng)傷短桿菌(Brevibacterium helcolum)，極小短桿菌(Brevibacterium pusillum)，磚紅色短桿菌(Brevibacterium testaceum)，玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)，(Brevibacterium immariophilium)，擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)，(Brevibacterium protopharmiae)，嗜乙酉先棒桿菌(Corynebacterium acetophilum)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，帚石南棒桿菌(Corynebacterium calIunae)，嗜乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)，解淀粉桿菌(Erwinia amylovora)，胡蘿卜軟腐桿菌(Erwiniacarotovora)，草生假單胞菌(Erwinia herbicola)，菊果膠桿菌(Erwinia chrysanthemi),奇異黃桿菌(Flavobacterium peregrinum)，(Flavobacterium fucatum)，禮黃色黃桿菌(Flavobacterium aurantinum)，萊茵黃桿菌(Flavobacterium rhenanum)，塞沃尼黃桿菌(Flavobacterium sewanense)，短黃桿菌(Flavobacterium breve)，腦膜炎黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)，微球菌 CCM825 (Micrococcus sp. CCM825)，摩氏摩根菌(Morganellamorganii)，灰暗諾卡氏菌(Nocardiaopaca)，粗糖諾卡氏菌(Nocardiarugosa)，(Planococcus eucinatus)，雷特洛變形桿菌(Proteus rettgeri)，謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)，產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)，產(chǎn)氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans)，焚光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)，卵狀假單胞菌(Pseudomonas ovalis)，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovolans)，霉味假單胞菌(Pseudomonas mucidolens)，睪丸酮假單胞菌(Pseudomonas testosteroni)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)，紅球菌ATCC 15592 (Rhodococcus sp. ATCC 15592)，紅球菌 ATCC 19070 (Rhodococcus sp. ATCC19070)，服芽抱八疊球菌(Sporosarcina ureae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)，干酪弧菌(Vibrio tyrogenes)，馬杜拉放線菌(Actinomaduramadurae)，圖列茨鏈霉菌(Actinomyces violaceochromogenes)，丘疫性北里抱菌(Kitasatosporia parulosa)，天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces coelicolor),淡黃色鏈霉菌(Streptomyces f Iavelus)，淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)，變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)，撤攬色鏈霉菌(Streptomyces olivaceus)，田無鏈霉菌(Streptomyces tanashiensis)，弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)，抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)，可可鏈霉菌(Streptomyces cacaoi)，淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces Iavendulae)，產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，殺鮭氣單抱菌(Aeromonas salmonicida)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)，角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliqyefaciens),凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans),溶硫胺芽抱桿菌(Bacillus thiaminolyticus),弗羅思特桿菌(Escherichia freundii),嗜氨微桿桿菌(Microbacterium ammoniaphilum),粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens),鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium),乙型副傷寒桿菌(Salmonella schottmulleri)，柑桔黃單抱菌(Xanthomonas citri)，等等。適于本發(fā)明實(shí)施的微生物可以有氧生長(zhǎng)(氧氣存在條件下)，或厭氧生長(zhǎng)(完全缺乏氧氣條件下)，或微好氧生長(zhǎng)(僅提供極小量氧氣)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，被選擇用于生產(chǎn)琥珀酸的微生物在厭氧條件下生長(zhǎng)?？晒┻x擇地，適于本發(fā)明的微生物能夠在雙相生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)，即微生物先在有氧生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)至達(dá)到一定的細(xì)胞生長(zhǎng)水平，然后轉(zhuǎn)移到厭氧生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)以獲得商業(yè)上有效量的琥珀酸。本發(fā)明微生物在生產(chǎn)琥珀酸的雙相生長(zhǎng)過程中，琥珀酸的生產(chǎn)和累積發(fā)生在厭氧發(fā)酵生長(zhǎng)階段。本發(fā)明結(jié)合特異性的基因操作技術(shù)和代謝進(jìn)化過程以獲得菌株，所述菌株在厭氧條件下于含糖類底物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸，顯示出高產(chǎn)率、效價(jià)和體積產(chǎn)量。 通過基因操作獲得的微生物菌株具有生產(chǎn)琥珀酸所期望的基因型。然而，所述微生物菌株在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率或它們達(dá)到琥珀酸生產(chǎn)所要求的產(chǎn)率、效價(jià)和體積產(chǎn)量的能力，可能不允許我們使用這些基因修飾微生物作為生物催化劑通過大規(guī)模發(fā)酵過程來商業(yè)生產(chǎn)琥珀酸。因此，通過基因修飾獲得的基因修飾微生物，隨后在含糖類源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代，以篩選具有非常高的琥珀酸產(chǎn)率的克隆。具有最優(yōu)選表型的克隆基于生長(zhǎng)的篩選過程被稱為代謝進(jìn)化。在代謝進(jìn)化過程中，基因修飾菌株被重復(fù)轉(zhuǎn)接至新鮮的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間以獲得克隆，其中，代謝進(jìn)化過程中發(fā)生的自發(fā)突變導(dǎo)致獲得一種克隆，所述克隆表現(xiàn)出快速的細(xì)胞生長(zhǎng)能力、對(duì)于不同的碳源的快速消耗能力、同時(shí)使用多種糖的能力、耐受碳源中的有毒化學(xué)物質(zhì)的能力、以及獲得高產(chǎn)率和產(chǎn)量的所期望的有機(jī)酸加上低產(chǎn)量和低產(chǎn)率的其他有機(jī)酸的能力。在代謝進(jìn)化過程中，注意力放在篩選具有所期望表型的克隆。一種通過代謝進(jìn)化獲得的、在添加有碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中顯示出非常好的生長(zhǎng)速率、但是在所期望的有機(jī)酸的產(chǎn)率上沒有改進(jìn)的克隆，并非一種令人滿意的克隆。在使用一定的選擇壓力來促使有機(jī)體獲得某一所希望的表型的代謝進(jìn)化過程中，兩種改變可能會(huì)發(fā)生。所述有機(jī)體可能簡(jiǎn)單地使自身適應(yīng)于選擇壓力，并表現(xiàn)出一種改變的表型。或者，有機(jī)體可能在選擇壓力下經(jīng)受一些基因改變，并永久地表現(xiàn)改變的表型。當(dāng)僅僅是一種適應(yīng)而沒有基因改變時(shí)，一旦選擇壓力被解除，那么有機(jī)體回歸其原來的表型。這些有機(jī)體被稱為“適應(yīng)的”有機(jī)體。這些“適應(yīng)的”微生物在選擇壓力解除后，將回歸其原來的表型。所述“適應(yīng)的”微生物必須在選擇壓力下經(jīng)受另外新一輪的代謝進(jìn)化循環(huán)，以表現(xiàn)出改變的表型。另一方面，當(dāng)伴隨基因改變時(shí)，即使沒有選擇壓力，改變的表型也將繼續(xù)存在。伴隨一定的基因改變的代謝進(jìn)化是希望獲得的。在代謝進(jìn)化過程中獲得穩(wěn)定基因改變的微生物能夠很容易地通過下列方法識(shí)別將微生物在沒有任何選擇壓力的條件下置于原生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后將其轉(zhuǎn)接到存在選擇壓力的新鮮培養(yǎng)基中。如果這些有機(jī)體能夠表現(xiàn)出沒有任何停滯期的良好生長(zhǎng)和所期望的表型，那么該有機(jī)體被認(rèn)為在代謝進(jìn)化過程中獲得了改變的表型。
代謝進(jìn)化過程獲得的基因改變的基礎(chǔ)可以通過對(duì)有機(jī)體染色體DNA的適當(dāng)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序并將序列數(shù)據(jù)與親本菌株進(jìn)行比對(duì)而確定。DNA序列數(shù)據(jù)可以利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)獲得。例如，代謝進(jìn)化的菌株的染色體DNA的適當(dāng)區(qū)域能夠通過聚合酶鏈反應(yīng)獲得，且聚合酶鏈反應(yīng)獲得的產(chǎn)品能夠通過使用適當(dāng)?shù)臏y(cè)序引物的方式而被測(cè)序。從培養(yǎng)物保藏中心(例如ATCC，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))獲得的大腸桿菌野生型菌株能夠進(jìn)行基因工程設(shè)計(jì)，隨后代謝進(jìn)化以獲得一種菌株，所述菌株具有增強(qiáng)的生產(chǎn)商業(yè)有效量的琥珀酸的能力。基因操作能夠在幾個(gè)不同階段完成，在基因操作階段之間伴隨有代謝進(jìn)化?；虿僮靼ǜ淖儍?nèi)源DNA序列或從基因組DNA中完全消除特異性DNA序列?；虿僮鬟€包括將外來DNA序列插入微生物的基因組DNA序列。本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，基因操作通過從微生物基因組DNA中消除特異性DNA序列且不引入任何外來DNA而完成。為使編碼某一特定蛋白產(chǎn)物的基因的表達(dá)失效，需要進(jìn)行某些基因操作，這些基因操作要求將一外來DNA序列插入微生物的基因組以篩選一種具有所期望的基因修飾的克隆。例如，外源抗生素標(biāo) 記基因能夠被用來通過插入使內(nèi)源基因失活，并篩選具有所期望的基因型的克隆。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，引入的外源DNA序列最終從微生物基因組DNA中被消除，使得微生物在基因操作過程的最后在其原始基因組DNA中沒有外源DNA。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的目的所必需的各種基因工程技術(shù)已經(jīng)在兩種不同的科學(xué)出版物上有詳細(xì)描述(Jantama等人，2008a Jantama 等人，2008b)。美國(guó)專利申請(qǐng) US2007/0037265 和 US 2009/0148914 及PCT申請(qǐng)W02008/115958中也描述了對(duì)本發(fā)明各種實(shí)施方式的實(shí)施有用的基因工程技術(shù)。這些科學(xué)出版物和專利文獻(xiàn)在此處以引文的方式并入本發(fā)明，以提供對(duì)本發(fā)明有用的基因工程技術(shù)的詳細(xì)資料。為了制備能生產(chǎn)有效量琥珀酸的微生物，參與一些微生物代謝路徑(包括糖酵解路徑、三羧酸循環(huán)(也被稱為檸檬酸循環(huán)或TCA循環(huán))和乙醛酸支路)的各種酶可以使用各種基因工程技術(shù)進(jìn)行操作，所述基因工程技術(shù)描述在上段以引文方式引用和并入的科學(xué)和專利文獻(xiàn)中。關(guān)于各種微生物代謝路徑的詳細(xì)資料能夠在標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)教科書(例如Lehninger 的 Principles ofBiochemistry 和 Lubert Stryer 的 Biochemistry)中找至丨J0可從美國(guó)密蘇里州圣路易斯的Sigma Chemical Company獲得的G. Michael的生物化學(xué)路徑圖也提供了細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的各種生物化學(xué)路徑的詳細(xì)說明。在有氧生長(zhǎng)過程中，微生物碳代謝涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。減少的酶輔助因子(例如NADPH和NADH)通過氧化磷酸化的運(yùn)行再生，所述氧化磷酸化伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)所需的ATP生產(chǎn)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在厭氧條件下生產(chǎn)琥珀酸，減少的輔助因子NADPH和NADH的再生通過引導(dǎo)碳流流入三羧酸循環(huán)及消除所有再生NADP+和NAD+的發(fā)酵路徑來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)優(yōu)選的有機(jī)酸的類型，代謝路徑進(jìn)行特異性的設(shè)計(jì)，以使微生物生產(chǎn)我們選擇的特定有機(jī)酸。微生物能夠合成多種有機(jī)酸，包括乳酸、乙酸、蘋果酸、丙酮酸和琥珀酸。因此在培育一種用于琥珀酸生產(chǎn)的生物催化劑過程中，用于生產(chǎn)乙酸、乳酸、丙酮酸和甲酸的路徑就被阻斷，并且通過操作參與到細(xì)胞內(nèi)碳代謝的一種或多種酶促進(jìn)碳流流向琥珀酸生產(chǎn)。在微生物發(fā)酵路徑中有活性的、且能夠使用已知的基因工程技術(shù)進(jìn)行操作的酶的列表包括，但不限于異檸檬酸合成酶(aceA)，蘋果酸合成酶(aceB)，乙醛酸支路操縱子(aceBAK),乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(ackA-pta),順烏頭酸水合酶I和2 (acnA和acnB),乙酰輔酶A合成酶(acs)，檸檬酸裂解酶(CitDEF)，乙醇脫氫酶(adhE)，檸檬酸合成酶(CitZ)，延胡索酸還原酶(frd)，乳酸脫氫酶(Idh)，蘋果酸脫氫酶(mdh)，乙醛酸循環(huán)操縱子抑制劑(iclR)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P印C)，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl);丙酮酸氧化酶(poxB);丙酮酸羧激酶(pck);和丙酮酸羧化酶(pyc)(圖1,6,和9)。碳源的糖酵解導(dǎo)致生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。PEP通過混合酸路徑被進(jìn)一步代謝。本發(fā)明所用的術(shù)語“混合酸路徑”是指碳流從PEP流經(jīng)三羧酸循環(huán)和各種在厭氧條件下可使用的發(fā)酵路徑。厭氧條件下，至少有4種不同的用于丙酮酸代謝的發(fā)酵路徑可被識(shí)別。丙酮酸可以利用NADH還原成乳酸，并由此產(chǎn)生NAD+以維持碳源連續(xù)代謝所需的細(xì)胞的氧化還原平衡。來源于丙酮酸的乙酰輔酶A還可以被還原生成乙醇，同時(shí)伴隨NADH氧化生成NAD+。丙酮酸還可以轉(zhuǎn)化為甲酸或乙酸，如圖IA所示。TCA循環(huán)中，兩條不同的臂已被識(shí)別。TCA循環(huán)的一條臂被稱為氧化臂，所述氧化臂包括碳流從從草酰乙酸經(jīng)過異檸檬酸流向琥珀酸，利用NADP+使異檸檬酸氧化，同時(shí)生 成NADPH。TCA循環(huán)的另一條臂被稱為TCA循環(huán)的還原臂，所述還原臂包括碳流從草酰乙 酸經(jīng)過蘋果酸和延胡索酸流向琥珀酸，NADH被氧化生成NAD+，從而幫助細(xì)胞維持氧化還原平衡。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，從PEP通過發(fā)酵路徑的碳流被阻止，所述的阻止是通過使編碼參與到發(fā)酵路徑的酶的基因失活而實(shí)現(xiàn)。適合于阻斷碳流通過發(fā)酵路徑的酶包括ldhA, pflB, adhE, pta, ackA,和poxB。所述基因中的一種或多種的消除預(yù)期可以減少?gòu)腜EP通過發(fā)酵路徑的碳流。所有6種基因的失活預(yù)期可以完全阻斷通過發(fā)酵路徑的碳流。本發(fā)明的另一個(gè)方面，除了使參與到發(fā)酵路徑的其余六個(gè)基因失活之外，還使編碼丙酮醛合成酶(mgsA)的mgsA基因失活，所述丙酮醛合成酶負(fù)責(zé)丙酮醛到乳酸的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，除了使眾所周知參與到一個(gè)或其他發(fā)酵路徑的基因失活之外，還使與參與到發(fā)酵路徑的基因功能相似的基因失活。含有乙酸激酶活性的丙酸激酶由tdcD基因編碼，所述丙酸激酶僅用于蘇氨酸的降解。然而，在含10% (w/v)葡萄糖的厭氧生長(zhǎng)條件下，tdcD的表達(dá)能從功能上取代ackA。此外，相同操縱子中鄰近的tdcE基因類似于pflB,并編碼含有丙酮酸甲酸裂解酶活性的α-酮丁酸甲酸裂解酶(a-ketobutryateformate lyase)。本發(fā)明的一個(gè)方面，使tdcDE基因失活以阻止碳進(jìn)入發(fā)酵路徑，并確保碳流入TCA循環(huán)。本發(fā)明另一種實(shí)施方式中，除了阻斷碳流通過發(fā)酵路徑外，還改變碳流在TCA循環(huán)中的流動(dòng)，以使碳流直接流向琥珀酸生產(chǎn)。本發(fā)明的一個(gè)方面，TCA循環(huán)中碳流的操作是通過上調(diào)一種或多種基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面，可以使在TCA循環(huán)中起作用的一種或多種基因失活，以增加流向琥珀酸的碳流。本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方面，編碼蘋果酸脫氫酶的基因mdh被上調(diào)，以提高蘋果酸到延胡索酸和琥珀酸的轉(zhuǎn)化。碳流從草酰乙酸經(jīng)過蘋果酸和延胡索酸到琥珀酸的流動(dòng)被稱為TCA循環(huán)的還原臂。碳通過所述TCA循環(huán)的還原臂從草酰乙酸到琥珀酸的流動(dòng)，每產(chǎn)生Imol琥珀酸將消耗2mol NADH,從而幫助維持細(xì)胞在厭氧條件下的氧化還原平衡。換句話說，mdh的上調(diào)有助于NAD+的再生，所述NAD+是維持細(xì)胞氧化還原平衡所必需的。mdh基因表達(dá)的上調(diào)能夠通過下列方法實(shí)現(xiàn)用其他強(qiáng)啟動(dòng)子序列替換mdh基因的天然啟動(dòng)子，或者使mdh基因的啟動(dòng)子區(qū)域突變，以使mdh基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。另外，額外的mdh基因的拷貝也能被加入菌株中。本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，mdh基因表達(dá)的上調(diào)是通過對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行基因操作實(shí)現(xiàn)的。在TCA循環(huán)的通常操作中，通過TCA循環(huán)的氧化臂的運(yùn)行生產(chǎn)琥珀酸。所述氧化臂是指碳流從草酰乙酸經(jīng)過檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸、-酮戊二酸和琥珀酰輔酶A到琥珀酸的流動(dòng)。琥珀酸還能通過乙醛酸支路的運(yùn)行生產(chǎn)。在乙醛酸支路運(yùn)行過程中，在異檸檬酸裂解酶作用下，由異檸檬酸生成琥珀酸和乙醛酸。通過TCA循環(huán)氧化臂的運(yùn)行或乙醛酸支路的運(yùn)行而生產(chǎn)得到的琥珀酸，能夠在琥珀酸脫氫酶(sdh)的作用下，生成延胡索酸，然后生成蘋果酸。因此，本發(fā)明另一種實(shí)施方式中，使用基因失活的方法以防止琥珀酸的脫氫作用，達(dá)到增加細(xì)胞內(nèi)琥珀酸生產(chǎn)的目的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，可以對(duì)通過乙醛酸支路的碳流進(jìn)行操作，以增加琥珀酸生產(chǎn)。異朽1檬酸裂解酶催化異朽1檬酸裂解生成乙醒酸和琥拍酸。異朽1檬酸裂解酶由aceBAK操縱子編碼。異檸檬酸裂解酶活性被iclR基因抑制。換句話說，iclR基因的表達(dá)阻礙了乙醛酸支路的運(yùn)行。本發(fā)明的一個(gè)方面，除了使參與到發(fā)酵代謝的基因失活外，還使iclR基因失活。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，除了通過基因操作阻止發(fā)酵路徑的運(yùn)作和增加TCA循環(huán)內(nèi)流向琥珀酸生產(chǎn)的碳流外，還可以通過基因方法阻斷碳流從TCA循環(huán)向外流向其他代謝路徑，以增加琥珀酸生產(chǎn)。例如，可以阻斷碳流從TCA循環(huán)進(jìn)入氨基酸代謝，以增加流向琥珀酸的碳流。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC)在天冬氨酸的合成中，從谷氨酸轉(zhuǎn)移氨基至草酰乙酸，由此促進(jìn)碳從TCA循環(huán)向外流動(dòng)。本發(fā)明的一個(gè)方面，接著使aspC基因失活以阻斷碳從TCA循環(huán)向外流動(dòng)，目的是增加從草酰乙酸經(jīng)過TCA循環(huán)的氧化或還原臂流向琥珀酸生產(chǎn)的碳流。另一種碳從TCA循環(huán)向外的流動(dòng)發(fā)生于蘋果酸。蘋果酸酶(sfcA)作用下的蘋果酸的脫羧反應(yīng)導(dǎo)致生成丙酮酸。本發(fā)明的一個(gè)方面，使編碼蘋果酸酶的sfcA基因失活以減少碳從TCA循環(huán)向外流動(dòng)。本發(fā)明另一個(gè)方面，使aspC和sfcA基因兩者都失活，以阻止碳從TCA循環(huán)向外流動(dòng)，從而提高琥珀酸累積。本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過使檸檬酸裂解酶基因(CitDEF)失活而阻止碳從TCA循環(huán)向外流動(dòng)，所述檸檬酸裂解酶負(fù)責(zé)使檸檬酸裂解為草酰乙酸和乙酸。除了發(fā)現(xiàn)使參與到發(fā)酵路徑的基因和與它們功能上相似的基因失活，阻止碳從TCA循環(huán)外流以及調(diào)控TCA循環(huán)內(nèi)碳流向琥珀酸能夠提高微生物發(fā)酵中琥珀酸產(chǎn)率外，本發(fā)明還意外地發(fā)現(xiàn)通過對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)的羧化酶的基因操作可以進(jìn)一步提高琥珀酸產(chǎn)率。代謝進(jìn)化過程中發(fā)生的改變通過基因和酶分析進(jìn)行表征，本發(fā)明的發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的羧化酶可以成為另外一個(gè)基因操作的目標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)琥珀酸產(chǎn)率的提高。糖酵解中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸能被羧化，以增加流進(jìn)TCA循環(huán)的碳流。正常條件下，碳進(jìn)入TCA循環(huán)是在檸檬酸合成酶作用下完成的，所述檸檬酸合成酶連接乙酰輔酶A (來自丙酮酸)和草酰乙酸(TCA循環(huán)的一個(gè)中間產(chǎn)物)生成檸檬酸。通過提高存在于細(xì)胞內(nèi)的一種或多種羧化酶的效率，羧化磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸生成草酰乙酸是可能的，所述草酰乙酸是TCA循環(huán)的一個(gè)中間產(chǎn)物(圖2)。通過羧化反應(yīng)生成的草酰乙酸能進(jìn)一步通過TCA循環(huán)的還原臂被還原生成琥拍酸。
本發(fā)明提供了一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)羧化酶進(jìn)行操作以在厭氧發(fā)酵生長(zhǎng)過程中提高琥珀酸產(chǎn)率的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，通過從外源引入丙酮酸羧化酶(pyc)，丙酮酸可以羧化生成草酰乙酸。非常適于基因操作的微生物菌株(如大腸桿菌)不含pyc基因。來源于其他細(xì)菌種類(如菜豆根瘤菌(Rhizopium elti)和雙歧乳酸桿菌(Lactobacillus Iacti))的pyc基因能夠被引入基因修飾的大腸桿菌菌株，以促進(jìn)琥珀酸生產(chǎn)。已知大腸桿菌內(nèi)有4種不同的內(nèi)源羧化酶。所述羧化酶中的兩種負(fù)責(zé)羧化磷酸烯醇式丙酮酸，另外兩種酶負(fù)責(zé)羧化丙酮酸，所述丙酮酸是在丙酮酸激酶的作用下由磷酸烯醇式丙酮酸生成。所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸，所述的草酰乙酸能進(jìn)入TCA循環(huán)的還原臂以生產(chǎn)琥珀酸。第二種羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PPk)也能使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸，但它通常催化逆反應(yīng)，因所述酶在葡萄糖存在時(shí)不表達(dá)。另外兩種羧化酶被命名為NADH-蘋果酸酶(maeB)和NADPH-蘋果酸酶(maeA/sfcA),所述兩種酶能夠使丙酮酸羧化生成蘋果酸。所述maeB和sfcA酶羧化丙酮酸，所述丙酮酸是在丙酮酸激酶作用下由磷酸烯醇式丙酮酸生成。存在于細(xì)胞內(nèi)的四種羧化酶中的任意一種都能進(jìn)行基因修飾以增加酶活，從而增 加從糖酵解循環(huán)中間體流入TCA循環(huán)的碳流。大腸桿菌中存在的四種天然羧化酶中，PPC催化的反應(yīng)有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。在這個(gè)反應(yīng)中，PEP隨著無機(jī)磷酸鹽的釋放失去所含的能量。另外3種名為pck, maeA和sfcA(maeB)的羧化酶,不被期望在以葡萄糖為底物的發(fā)酵生長(zhǎng)過程中起作用，因?yàn)檫@三種羧化酶被葡萄糖抑制。所述三種羧化酶被認(rèn)為在逆反應(yīng)中在糖異生過程中起作用，那時(shí)細(xì)胞中發(fā)生有機(jī)酸的氧化代謝。本發(fā)明中，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)糖異生的PEP羧激酶(PCK)能進(jìn)行基因修飾，以增加碳流入TCA循環(huán)。使用pck作為大腸桿菌中琥珀酸生產(chǎn)的主要路徑是出人意料的，并與目前對(duì)于pck的功能的理解相反。先前的研究已經(jīng)表明增強(qiáng)大腸桿菌和產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus. succinogenes)的pck的表達(dá)對(duì)琥拍酸生產(chǎn)沒有影響(Kim等人,2004 ；Millard等人，1996)。一個(gè)近期的研究已經(jīng)證明大腸桿菌pck的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)于在基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)是不利的，會(huì)降低生長(zhǎng)速率、葡萄糖代謝速率和琥珀酸產(chǎn)率(Kwon等人，2008)。增強(qiáng)pck活性的優(yōu)勢(shì)在于，這種酶在使磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酰乙酸的同時(shí)，每生成Imol草酰乙酸就會(huì)產(chǎn)生ImolATP。ATP產(chǎn)率的提高將會(huì)提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在本發(fā)明構(gòu)建的許多大腸桿菌菌株中的活性的對(duì)比分析已經(jīng)揭示，代謝進(jìn)化過程中PCK酶活性的增強(qiáng)是源于PCk基因轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。在那些顯示與細(xì)胞生長(zhǎng)相結(jié)合的琥珀酸生產(chǎn)增加的菌株中，pck的轉(zhuǎn)錄豐度提高。事實(shí)上，本發(fā)明的結(jié)果已經(jīng)在pck轉(zhuǎn)錄水平的提高與PCK酶活性和與生長(zhǎng)相結(jié)合的琥珀酸生產(chǎn)的提高之間建立了正相關(guān)關(guān)系。天然糖異生的pck在琥拍酸發(fā)酵生產(chǎn)中的使用可以通過任意對(duì)于pck基因的轉(zhuǎn)錄具有積極作用的突變實(shí)現(xiàn)。PCK活性水平的提高可以通過在多拷貝質(zhì)粒中表達(dá)pck基因而實(shí)現(xiàn)，所述多拷貝質(zhì)粒含有天然啟動(dòng)子或已知能夠提高基因表達(dá)的任意其他啟動(dòng)子序列。提高細(xì)胞內(nèi)Pck基因表達(dá)的另一種方法是利用轉(zhuǎn)座子整合pck基因的額外多個(gè)拷貝。本發(fā)明另一種實(shí)施方式中，Pck基因天然啟動(dòng)子可以被其他一些已知能夠增強(qiáng)活性水平的啟動(dòng)子元素替換。增強(qiáng)pck基因的表達(dá)還能通過基因的啟動(dòng)子區(qū)域的突變或?qū)φ{(diào)控元素進(jìn)行基因操作來實(shí)現(xiàn)，所述調(diào)控元素已知能與pck基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用。編碼pck基因的調(diào)控蛋白的基因能以某種方式被突變或刪除或過量表達(dá)，以增強(qiáng)pck基因的表達(dá)。本發(fā)明結(jié)果已經(jīng)表明，單點(diǎn)突變(相對(duì)于pck基因的ATG啟動(dòng)密碼子-64位點(diǎn)處G被A置換)能夠增加pck基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶酶活的相應(yīng)增強(qiáng)。類似的pck基因表達(dá)的增強(qiáng)還能通過對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行基因操作而實(shí)現(xiàn)，所述蛋白質(zhì)為已知能調(diào)控pck基因的表達(dá)的蛋白質(zhì)。例如，Cra蛋白已經(jīng)顯示能活化pck基因在大腸桿菌中的表達(dá)(Saier 和 Ramseier, 196)。類似地，csrA 體系(包含 csrA, csrB, csrC, csrD, uvrY 或barA)也被報(bào)道通過改變mRNA穩(wěn)定性可用于調(diào)控pck以及參與到葡萄糖代謝的其他基因的水平(Babitzke 和 Romeo, 2007 ；Pernestig 等人，2003 ；Suzuki K 等人，2002)。本發(fā)明另一種用于增加厭氧發(fā)酵過程中與生長(zhǎng)相結(jié)合的琥珀酸生產(chǎn)的基因方法，與通過生物催化劑進(jìn)行的糖攝取中消耗的能量的儲(chǔ)存有關(guān)。微生物通過位于細(xì)胞質(zhì)膜上的一組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取糖(Jojima等人,2010)。微生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為三個(gè)主要類別。細(xì)菌內(nèi)最大的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類別是ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。顧名思義，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白每轉(zhuǎn)運(yùn)I摩爾糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞就需要消耗I摩爾ATP。XylFGH是一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，用于轉(zhuǎn)運(yùn)木糖(一種戊糖)到細(xì)胞內(nèi)。AraFGH是一種ABC轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白，用于轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖，即另外一種戊糖。細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的第二種類型被歸類在主要易化子超家族(MFS)下面。MFS糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，兩種不同類別的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已得到確認(rèn)。MFS包括H+-同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(H+-Iinked symporters), Na+-同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-Iinkedsymporters-antiporters)和單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(uniporters)。單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類簡(jiǎn)單的糖轉(zhuǎn)運(yùn)的輔助者，它們每轉(zhuǎn)運(yùn)I摩爾糖進(jìn)入細(xì)胞，需要I摩爾ATP。大腸桿菌內(nèi)的跨膜蛋白Glf是單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)例子。H+-同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白每轉(zhuǎn)運(yùn)I摩爾糖進(jìn)入細(xì)胞，需要I個(gè)質(zhì)子和I摩爾ATP。大腸桿菌內(nèi)的GalP蛋白是一種同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，用于轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖(一種己糖)進(jìn)入細(xì)胞。GalP含12個(gè)跨膜螺旋，是一種非常好的特征性同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。據(jù)報(bào)道，GalP還能夠轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖穿過細(xì)胞膜。AraE是一種H+-同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，用于轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖穿過細(xì)胞膜。類似地，XylE蛋白是一種用于轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的H+-同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第三類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要負(fù)責(zé)己糖(如葡萄糖)的攝取，所述第三類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被稱為磷酸烯醇式丙酮酸糖類磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)。PTS催化下磷酸烯醇式丙酮酸的磷酰基的轉(zhuǎn)移，促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)6-磷酸-葡萄糖和丙酮酸的形成。在有氧培養(yǎng)條件下，PTS生產(chǎn)的丙酮酸明顯不能再生為PEP，在該情況下葡萄糖是唯一的碳源。相反，丙酮酸經(jīng)三羧酸循環(huán)被氧化生成二氧化碳。因此，每轉(zhuǎn)運(yùn)I分子的葡萄糖，要消耗I分子的PEP。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)生物能量學(xué)，憑借PTS進(jìn)行的糖轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)能量密集過程。因此，在厭氧生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)，在需要保存細(xì)胞內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸含量用于生產(chǎn)工業(yè)上有用的化學(xué)品的情況下，期望能夠用其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白替代PTS，所述的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白每轉(zhuǎn)運(yùn)I摩爾糖至細(xì)胞內(nèi)，不需要消耗I摩爾PEP。除了這些直接參與到微生物代謝路徑的糖酵解、三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的基因夕卜，還可以對(duì)參與到碳化合物的攝取的基因進(jìn)行基因操作以增加碳攝取或提高有機(jī)酸生產(chǎn)中的能量利用效率，所述的碳化合物作為一種琥珀酸合成的能量來源是有用的。例如，消除通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)完成的葡萄糖攝取，有助于減少微生物細(xì)胞攝取葡萄糖的能量消耗。通過對(duì)PTS進(jìn)行操作節(jié)約的能量能被引導(dǎo)用于提高有機(jī)酸生產(chǎn)效率。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因PtsH和ptsG可進(jìn)行操作以節(jié)約葡萄糖攝取的能量，從而提高微生物生產(chǎn)琥珀酸的效率。因此，通過挖掘微生物代謝路徑領(lǐng)域可獲得的數(shù)據(jù)，可以刪除一組基因以阻斷大部分代謝路徑，并引導(dǎo)碳流向琥珀酸生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)琥珀酸。PTS是由兩種名為El和HPr的細(xì)胞質(zhì)成分和一種膜結(jié)合成分EII組成。大腸桿菌至少包含15種不同的EII復(fù)合物。每種EII成分都對(duì)應(yīng)特定的一種被轉(zhuǎn)運(yùn)的糖類型，所述EII成分包含兩個(gè)疏水性整合膜區(qū)域(C和D)和兩個(gè)親水性區(qū)域(A和B)。所述四個(gè)區(qū)域一起負(fù)責(zé)糖分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化。EI蛋白將磷酸基團(tuán)從PEP轉(zhuǎn)移到HPr蛋白。EII蛋白將磷酸基團(tuán)從磷酸化的HPr蛋白轉(zhuǎn)移到糖分子。EI由ptsl基因編碼。HPr由ptsH基因編碼。腸道細(xì)菌的葡萄糖特異性EII復(fù)合物包含兩種不同的蛋白，即基因err編碼的EIIAele和基因ptsG編碼的膜相關(guān)蛋白EIICBe'PTS介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過刪除其中一個(gè)編碼與PTS相關(guān)的蛋白的基因而得到抑制。PTS 的功能性替換是實(shí)現(xiàn)由葡萄糖生成的產(chǎn)物產(chǎn)率和幾類代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的顯著提高的基因方法之一，所述PTS的功能性替換是代之以不依賴于磷酸烯醇式丙酮酸的攝取和磷酸化活動(dòng)。隨著PTS介導(dǎo)的葡萄糖攝取被抑制，其他葡萄糖攝取系統(tǒng)可以被活化以確保細(xì)胞內(nèi)可以持續(xù)獲得葡萄糖用于生產(chǎn)工業(yè)上有用的化學(xué)品。例如，編碼葡萄糖透性酶(一種葡萄糖單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的gif基因，已被用于代替PTS介導(dǎo)的葡萄糖攝取的損失。類似地，galP和glk的過量表達(dá)被報(bào)道用于提高大腸桿菌的pts_菌株內(nèi)的葡萄糖攝取和磷酸化。GalP是一種用于半乳糖(一種己糖)攝取的同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。據(jù)報(bào)道，GalP在pts_菌株內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。GalP介導(dǎo)的葡萄糖攝取的重要性已被下列事實(shí)所證明pts_突變體內(nèi)的galP基因的失活被發(fā)現(xiàn)是致死的(Yi等人，2003)。在葡萄糖能夠進(jìn)入糖酵解之前，需要Glk完成葡萄糖分子的磷酸化。GalP蛋白在pis—菌株中的表達(dá)，能通過在組成型啟動(dòng)子作用下表達(dá)一種外源基因或通過解除對(duì)galP基因表達(dá)的阻遏作用來實(shí)現(xiàn)，所述的解除對(duì)galP基因表達(dá)的阻遏作用是通過編碼galP基因的阻遏蛋白(例如galS和galR)的基因的突變實(shí)現(xiàn)的。如上所述，使用生物催化劑的琥珀酸生產(chǎn)，依靠伴隨著代謝進(jìn)化的基因操作來實(shí)現(xiàn)。發(fā)生在代謝進(jìn)化過程的基因改變可通過生物化學(xué)和基因分析識(shí)別。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，存在于細(xì)胞內(nèi)的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和羧化酶的基因發(fā)生的突變可以積極地促成琥珀酸生產(chǎn)的增加。這些新發(fā)現(xiàn)的基因操作的目標(biāo)能夠與糖酵解、三羧酸和發(fā)酵路徑的其他目標(biāo)以不同的方式結(jié)合，以生成能高效率生產(chǎn)琥珀酸的生物催化劑。令人高度期待的是識(shí)別一組最小數(shù)目的目標(biāo)基因用于基因操作，從而獲得生產(chǎn)琥珀酸的最優(yōu)菌株。本發(fā)明還提供了提高甘油在琥珀酸生產(chǎn)中的利用的基因方法。甘油攝取是由glpF基因編碼的蛋白介導(dǎo)的。一旦進(jìn)入細(xì)胞，甘油被gldA基因編碼的蛋白氧化生成二羥基丙酮(DHA)。DHA被由dhaKLM操縱子編碼的蛋白磷酸化生成二羥基丙酮磷酸(DHAP)。DHA在dhaKLM編碼的蛋白作用下磷酸化生成DHAP的反應(yīng)依賴于磷酸烯醇式丙酮酸池的可利用性。由于DHA的磷酸化需要PEP，因此它耗盡了可用于PCK的PEP，所述PCK引導(dǎo)碳從PEP流入TCA循環(huán)以確保實(shí)現(xiàn)琥珀酸高產(chǎn)率所需的適當(dāng)?shù)难趸€原平衡。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，阻止甘油流經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的gldA和dhaKLM路徑可以提高以甘油作為碳源的琥珀酸的產(chǎn)率，所述細(xì)菌細(xì)胞具有增強(qiáng)的PCK酶活。本發(fā)明還意外地發(fā)現(xiàn)，通過阻止碳流經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的發(fā)酵路徑可以進(jìn)一步提高以甘油作為碳源的琥珀酸的產(chǎn)率，所述的細(xì)菌細(xì)胞具有增強(qiáng)的PCK酶活并刪除了 gldA基因和dhaKLM操縱子。下列實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明。這些實(shí)施例并非用來限制本發(fā)明的范圍。工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明的精神的基礎(chǔ)上，有能力采用一些不同的實(shí)施方式來實(shí)施本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)部分基因標(biāo)記菌株，培養(yǎng)基及生長(zhǎng)條件E0Coli C(ATCC 8739)新的派生物利用獨(dú)特的基因缺失組合及以生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的篩選進(jìn)行培育用于琥珀酸生產(chǎn)。本發(fā)明培育的大腸桿菌各種菌株已被美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(ARS Culture Collection)保藏，保藏編號(hào)如表2所示。 本發(fā)明的微生物有機(jī)體能在許多不同的微生物領(lǐng)域熟知的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。例如，大腸桿菌的野生型和突變菌株能在Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述LB培養(yǎng)基含有1% (w/v)胰蛋白胨、O. 5% (w/v)酵母提取物和O. 5% (w/v)NaCl。利用發(fā)酵過程以基因修飾微生物作為生物催化劑商業(yè)化生產(chǎn)有機(jī)酸，優(yōu)選使用添加有碳源的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基。使用基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基，相比于豐富培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基,降低了商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)有機(jī)酸的成本。適于本發(fā)明的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括新生牛血清(NBS)培養(yǎng)基(Causey等人，2007)和AMI培養(yǎng)基(Martinez等人，2007)。所述NBS培養(yǎng)基包含ImM甜菜堿，25. 72mMKH2PO4, 28. 71mM K2HPO4, 26. 50mM (NH4)2HPO4, ImM MgSO4 · 7Η20，0· ImM CaCl2 · 2Η20，0· 15mM硫胺素 HCl，5. 92MFeCl36H20，0. 84M COCl2 · 6Η20，0· 59M CuCl2 · 2H20,1. 47M ZnCl2,0. 83MNa2MoO4 2H20，和 0. 81M H3B03。所述 AMl 培養(yǎng)基包含 ImM 甜菜堿，19. 92mM (NH4)2HPO4, 7. 56mMNH4H2PO4,1. 5mM MgSO4 ·7Η20，I. OmM甜菜堿-KC1，8. 88M FeCl36H20,1，26M COCl2 ·6Η20，0· 88MCuCl2 ·2Η20，2· 20M ZnCl2,1. 24M Na2Mo042H20,1. 21M H3BO3 和 2，50M MnCl24H20。微量元素配制成 1000X貯存液，包含下列組分1. 6g/L FeCl3,0. 2g/L CoCl2 ·6Η20，0· lg/L CuCl2,0. 2g/L ZnCl2 · 4Η20，0· 2g/LNaMo04,0 . 05g/L H3BO3,和 0. 33g/L MnCl2 · 4H20。用于微生物生產(chǎn)有機(jī)酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加有碳源。在本發(fā)明中有用的碳源包括但不限于戊糖(如木糖)，己糖(如葡萄糖，果糖和半乳糖)及甘油。所述的碳源還可以是不同糖的組合，例如葡萄糖和木糖的組合。所述的碳源還能由淀粉或木質(zhì)纖維素水解得到。復(fù)合糖類(如淀粉和木質(zhì)纖維素)的水解可以通過本領(lǐng)域公知的熱化學(xué)轉(zhuǎn)化過程或酶催化方法實(shí)現(xiàn)。用于利用微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)有機(jī)酸的碳源優(yōu)選來自農(nóng)業(yè)或林業(yè)廢料水解得到的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物可以被進(jìn)一步分解生成富集己糖的部分和富集戊糖的部分，這些部分可作為利用微生物發(fā)酵過程工業(yè)化生產(chǎn)有機(jī)酸的碳源。所述的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物可以進(jìn)一步進(jìn)行解毒，以除去某些化合物(例如糠醛)，這些化合物被發(fā)現(xiàn)當(dāng)其達(dá)到一定濃度以上時(shí)會(huì)使多種微生物有機(jī)體中毒。本發(fā)明使用的細(xì)菌菌株，質(zhì)粒和引物列在表3，7，9，14和15，并在以下說明書適當(dāng)?shù)奈恢糜性敿?xì)說明。在菌株構(gòu)建過程中，培養(yǎng)物在30，37或39°C下，于LB培養(yǎng)基(10g -Γ1Difco胰蛋白胨，5g · Γ1 Difco酵母提取物和5g · F1NaCl)中有氧生長(zhǎng)，所述LB培養(yǎng)基含有2% (w/v)葡萄糖或5% (w/v)阿拉伯糖。為琥珀酸生產(chǎn)培育的最終菌株中不存在編碼抗生素抗性的基因，質(zhì)?；蛲庠椿颉Ｈ欢?，在構(gòu)建不同菌株的初期，使用各種抗生素抗性標(biāo)記。抗生素篩選過程需要添加抗生素，例如氨芐青霉素(SOmg^r1)，卡那霉素(SOmg^r1)，或氯霉素(40mg · Γ1) ο發(fā)酵種子培養(yǎng)和發(fā)酵在37°C，IOOrpm條件下，在NBS或AMl無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基包含葡萄糖，IOOmM腿0)3和ImM甜菜堿HC1。在一些實(shí)施方式中，使用了玉米漿。所述玉米漿是玉米濕磨工業(yè)的副產(chǎn)物。與酵母提取物和蛋白胨相比，玉米漿是維生素和微量元素的廉價(jià)原料。用于發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的菌株在37°C、無抗生素條件下于NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Causey等人，2004)，所述NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加有10% (w/v)葡萄糖和IOOmM碳酸氫鉀，另有規(guī)定的除外。通過轉(zhuǎn)接新鮮克隆至250ml燒瓶(100ml NBS培養(yǎng)基，2%葡萄糖)培養(yǎng)用于發(fā)酵的預(yù)接種物(Pre-inocula)。16h(37°C, 120rpm)后，所述培養(yǎng)物被稀釋到一個(gè)含有300mlNBS培養(yǎng)基(10%葡萄糖，IOOmM碳酸氫鉀)的小發(fā)酵容器中，以提供細(xì)胞濃度(以 細(xì)胞干重計(jì))為O. 033g · Γ1的接種物。由于有機(jī)酸在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的累積會(huì)降低培養(yǎng)基pH，因此有必要根據(jù)需要添加合適的中和試劑到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)容器內(nèi)的PH可以使用pH探針連續(xù)監(jiān)控，并添加適當(dāng)?shù)膲A以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH大約在中性pH。適于維持微生物培養(yǎng)基pH的堿包括,但不限于NaOH, KOH, NH4SO4, Na2CO3, NaHCO3,和NH4C03。適于所述目的的堿可以單獨(dú)使用或組合使用。在某些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵通過添加包含額外的CO2的堿(I. 2M氫氧化鉀中含2. 4M碳酸鉀)自動(dòng)維持pH 7. O0隨后，通過添加3M KfO3和6N KOH I I的混合物維持pH。發(fā)酵容器被密封，除了用于樣品取出的16號(hào)針孔。在生長(zhǎng)過程中，通過添加碳酸氫鹽確保CO2氣氛以快速實(shí)現(xiàn)厭氧環(huán)境?；蚍椒股乜剐曰虻娜旧w刪除、整合和消除(removal)的方法，先前已有文獻(xiàn)描述(Datsenko 和 Wanner, 2000 ；Grabar 等人，2006 ；Posfai 等人，1997 ；Zhou 等人，2006)。在本發(fā)明使用的細(xì)菌菌株的構(gòu)建中，如先前所述(Jantama等人，2008a，2008b ;Zhang等人，2007)，染色體基因被無縫刪除，沒有留下外源DNA片段。Red重組酶技術(shù)(GeneBridges GmbH,德累斯頓,德國(guó))被用于促進(jìn)染色體整合。構(gòu)建過程中使用的質(zhì)粒和引物列在表 3，7，9，14，和 15。用于菌株 KJ012，KJ017, KJ032, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072,KJ073，和SZ204構(gòu)建的質(zhì)粒和引物的總結(jié)見表3。正義引物(sense primers)含有與每個(gè)目標(biāo)基因的N-端相一致的序列(粗體字形)，所述序列后跟隨著與FRT-kan-FRT基因盒(cassette)相一致的20bp (下劃線)。反義引物(Anti-senseprimers)包含與每個(gè)目標(biāo)基因的C-端相一致的序列(粗體字形)，所述序列后跟隨著與基因盒相一致的20bp (下劃線)。擴(kuò)增DNA片段通過電穿孔進(jìn)入攜帶Red重組酶(pKD46)的大腸桿菌菌株。在生成的重組體中，F(xiàn)RT-kan-FRT基因盒通過同源重組(同源雙交換事件)替換目標(biāo)基因的刪除區(qū)域。隨后利用質(zhì)粒pFT-A，從含F(xiàn)LP重組酶的染色體中切除抗性基因(FRT-kan-FRT)，留下含F(xiàn)RT位點(diǎn)的序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(scar)。染色體刪除和整合通過測(cè)定抗生素標(biāo)記，PCR分析及發(fā)酵產(chǎn)物分析進(jìn)行證實(shí)。Pl噬菌體介導(dǎo)的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，1992)被用于將Δ focA-pflB: : FRT-kan-FRT突變從SZ204菌株轉(zhuǎn)移至KJO17菌株以生產(chǎn)KJ032。
adhE, ldhA,和 focA_pfIB 區(qū)域中 FRT 標(biāo)記的刪除從adhE，IdhA和focA-pflB位點(diǎn)刪除序列基因及消除FRT標(biāo)記的策略在先前已有描述(Datsenko 和 Wanner, 2000 ；Grabar 等人，2006 ； Jantama 等人，2008b ；Zhang 等人，2007)。質(zhì)粒pL0I4151被用作cat-sacB基因盒的來源，而Red重組酶(pKD46)被用于促進(jìn)雙交換、同源重組等事件。氯霉素抗性被用于對(duì)整合的篩選。在蔗糖存在下的生長(zhǎng)被用于對(duì)sacB的損失進(jìn)行篩選。使用這種方法，構(gòu)建連續(xù)缺失以生產(chǎn)消除了全部FRT位點(diǎn)的KJ079的派生物。從adhE，IdhA和focA-pflB位點(diǎn)消除FRT標(biāo)記所用的引物和質(zhì)粒列在表3。為了消除Λ adhE區(qū)域的FRT位點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)Λ adhE:: FRT目標(biāo)區(qū)域的混合弓I物(hybrid primers) (WMadhEA/C)，所述混合引物包含與AadhE: :FRT位點(diǎn)的5’和3’區(qū)域同 源的大約50bp,以及與來自于pL0I4151的cat-sacB基因盒相一致的20bp。所述引物被用于以pL0I4151作為模板的cat-sacB基因盒的PCR擴(kuò)增。生成的PCR產(chǎn)物通過一個(gè)雙交換、同源重組事件結(jié)合對(duì)氯霉素抗性的篩選用cat-sacB基因盒替換AadhE區(qū)域中的FRT位點(diǎn)，從而獲得TG200。利用上/下游adhE引物，從E. coli C擴(kuò)增出adhE基因和周圍序列。包含ychE，-adhE-ychG’ (3. 44kb)的 PCR 產(chǎn)物被克隆至 pCR2. I-TOPO,生成 pL0I4413。以PL0I4413作為模板，另一組引物(ΙΟ-adhE上/下游)及Pfu聚合酶被用于擴(kuò)增反向(inside-out)產(chǎn)物，以得到一種平端(blunt-ended)產(chǎn)物，所述平端產(chǎn)物中adhE序列的2.6kb內(nèi)部片段被刪除。反向PCR產(chǎn)物經(jīng)過激酶處理和自連接(self-ligated)生成PL0I4419。pL0I4419擴(kuò)增(上/下游adhE引物)得到的PCR產(chǎn)物，通過另一個(gè)雙交換、同源重組事件結(jié)合對(duì)sacB損失的蔗糖篩選，以所希望的染色體序列替換TG200中的cat-sacB基因盒。生成的菌株命名為TG201 (KJ079中的FRT被從Λ adhE區(qū)域消除)。消除Λ IdhA和Λ (focA-pflB)區(qū)域中的FRT位點(diǎn)的方法類似于刪除adhE: :FRT 位點(diǎn)的方法。另外的用于消除Λ IdhA中的FRT位點(diǎn)的引物組(ldhAA/C和IO-IdhA上/下游)，連同相應(yīng)的質(zhì)粒(PL0I4430和pL0I4432)列在表7。TG202菌株是通過用pL0I4151(麗ldhAA/C引物)的PCR產(chǎn)物替換TG201中的AldhA區(qū)域而獲得。TG202中的cat-sacB基因盒被pL0I4432的PCR產(chǎn)物(ldhAA/C引物)所替換，結(jié)合對(duì)于sacB損失的蔗糖篩選來生產(chǎn)TG203。用來消除Λ (focA-pflB)中的FRT位點(diǎn)的引物組(上游focA/MidpflA和I0-yca0up/I0-midpflA 下游)和相應(yīng)的質(zhì)粒(pL0I4415 和 pL0I4421)列在表 7。菌株 TG204是通過用PL0I4151的PCR產(chǎn)物(WMpflBA/C引物)替換TG203中的Δ (focA-pflB)區(qū)域而獲得。TG204中的cat-sacB基因盒被pL0I4421的PCR產(chǎn)物(上游focA/Midpf IA引物)替換，結(jié)合對(duì)于sacB損失的蔗糖篩選而獲得KJ091。KJ091是KJ073的派生物，KJ091中的所有FRT位點(diǎn)被從染色體的AadhE，Λ IdhA和Λ focA-pflB區(qū)域消除。ackA區(qū)域中FRT位點(diǎn)的消除及citF, sfcA,和pta_ackA基因缺失的構(gòu)建為了消除KJ073的ackA區(qū)域中的FRT位點(diǎn)，按照下述方法構(gòu)建質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒含有發(fā)生了所希望的突變的序列。E. coli C基因組DNA作為模板被用于ackA的PCR擴(kuò)增，所述的PCR擴(kuò)增以JMackAFl/Rl為引物，所述的JMackAFl/Rl弓丨物與ackA基因的上游和下游的大約200bp結(jié)合。線性產(chǎn)物被克隆至pCR2. 1-T0P0(Invitrogen, Carlsbad, CA),生成PL0I4158。隨后，質(zhì)粒pL0I4158作為模板與JMackA上游I/下游I引物及Pfu聚合酶一起被用于反向PCR以生產(chǎn)平端產(chǎn)物，所述平端產(chǎn)物缺少一個(gè)808-bp的ackA內(nèi)部片段。然后，側(cè)翼為 PacI 的(Pacl-f lanked) cat-sacB 基因盒(來自 pL0I4162 的 Smal/Sfol 片段)被連入平端PCR產(chǎn)物以獲得pL0I4159。質(zhì)粒pL0I4159被用作PCR擴(kuò)增(JMackAFl/Rl引物)的模板。所述PCR產(chǎn)物通過雙交換同源重組結(jié)合對(duì)氯霉素抗性的篩選被用于替換KJ073的ackA區(qū)域中FRT位點(diǎn)?？寺‘a(chǎn)物被命名為KJ076。質(zhì)粒pL0I4159也用PacI進(jìn)行酶切以消除cat-sacB基因盒，并自連接以獲得PL0I4160，保留了 18-bp的翻譯終止序列。質(zhì)粒pL0I4160被用作PCR模板(JMackAFl/Rl引物)。所述擴(kuò)增片段通過雙交換同源重組結(jié)合對(duì)sacB損失的篩選，被用于替換KJ076中的cat-sacB基因盒。通過高溫生長(zhǎng)消除pKD46后，獲得的菌株被命名為KJ079。在KJ079菌株中，缺失區(qū)域已被18-bp的翻譯終止序列替換。上述用于從ackA區(qū)域區(qū)域消除FRT位點(diǎn)的策略被用于構(gòu)建citF, sfcA和pta-ackA的序列缺失，以及用18_bp的翻譯終止序列替換缺失區(qū)域。另外的用于構(gòu)建citF缺失的引物組(citF上游/下游和citF2/3)連同相應(yīng)的質(zhì)粒(pL0I4629，pL0I4630，和PL0I4631)列在表7。生成的菌株被命名為KJ104。 從菌株KJ104和KJllO中刪除sfcA基因，分別獲得命名為KJ119和KJ122的菌株。另外的用于構(gòu)建sfcA缺失的引物組(sfcA上游/下游和sfcAl/2)連同相應(yīng)的質(zhì)粒(PL0I4283，pL0I4284，和 d pL0I4285)列在表 7。KJl22中的ackA-pta操縱子(包含合成翻譯終止序列)被刪除，獲得菌株KJl34。另外的用于構(gòu)建ackA-pta操縱子缺失的引物組(ackA上游/pta下游和ackA2/pta2)連同相應(yīng)的質(zhì)粒(PL0I4710，pL0I4711，和pL0I4712)列在表7。菌株KJ134不包含任何FRT位點(diǎn)或外源基因。含有一個(gè)用于無標(biāo)記基因缺失的cat-sacB基因盒的pL0I4162的構(gòu)建為便于染色體DNA的序列刪除，構(gòu)建了質(zhì)粒pL0I4162(圖8)，所述質(zhì)粒包含一個(gè)可消除的cat-sacB基因盒，并且非必需地包含一個(gè)18_bp的合成DNA片段，所述合成DNA片段在所有閱讀框內(nèi)含有終止密碼子。所述質(zhì)粒由合成序列以及質(zhì)粒pL0I2228 (Martinez-Morales 等人，1999)、pL0I2511 (Underwood 等人，2002)和 pEL04 (Lee等人，2001 ;Thomason等人，2005)的幾部分組成。利用pEL04作為模板，用JMpEL04Fl/Rl引物進(jìn)行反向PCR，以消除cat和sacB基因之間不需要的SmaI和BamHI位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BglII剪切(在兩種引物內(nèi))，并自連接以獲得PL0I4152。質(zhì)粒pL0I4131是通過將來自pL0I2228 的 FRT-cat-FRT 片段(經(jīng)過 Klenow 處理的(Klenow-treated)Banl, ClaI)連入pL0I2511的兼容位點(diǎn)(經(jīng)過Klenow處理的(Klenow-treated)Nhel, ClaI)而構(gòu)建的。質(zhì)粒pL0I4131隨后經(jīng)EcoRI剪切，并自連接以消除FRT-cat-FRT片段獲得pL0I4145，保留了單一的KasI和XmaI位點(diǎn)。多聚接頭片段(SfPBXPS)通過互補(bǔ)寡核苷酸(SfPBXPSsense和SfPBXPScomp)的退火作用制備。在經(jīng)KasI和XmaI雙酶切后，這個(gè)片段被連入pL0I4145的相應(yīng)位點(diǎn)以獲得PL0I4153。在pL0I4152中利用JMcatsacB上游3/下游3引物組通過PCR擴(kuò)增出修飾的cat-sacB基因盒。在經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，這個(gè)基因盒被連入pL0I4153的相應(yīng)位點(diǎn)以獲得PL0I4146。為了創(chuàng)建一個(gè)在所有6個(gè)閱讀框內(nèi)含有終止密碼子的18_bp區(qū)域(5，GCCTAATTAATTAATCCC3，) (SEQ ID NO 1)，pL0I4146 經(jīng) PacI 酶切和自連接獲得pL0I4154 (未顯示)，消除了 cat-sacB基因盒。利用誘變引物(JM4161sense/comp)和線性質(zhì)粒擴(kuò)增，將兩個(gè)額外的堿基(T和A)插入到PL0I4154的SfoI和PacI位點(diǎn)之間，獲得PL0I4161。最終，含有cat-sacB基因盒的pL0I4146的PacI酶切片段被連入pL0I4161的PacI-酶切位點(diǎn)，以獲得pL0I4162 (基因庫(kù)號(hào)EU531506)。mgsA和poxB基因的刪除一種修飾方法被開發(fā)用于刪除E. coli染色體基因，所述修飾方法使用兩步同源重組過程(Thomason等人，2005)。使用這種方法，在基因刪除后，沒有抗性基因或序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(scar)序列留在染色體上。第一步重組中，部分目標(biāo)基因被包含一個(gè)氯霉素抗性基因(cat)和一個(gè)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的DNA盒替換。第二步重組中，cat-sacB基因盒被遺漏了刪除區(qū)域的天然序列替換。含sacB基因的細(xì)胞在蔗糖存在下的培養(yǎng)過程中會(huì)累積果聚糖，并被殺死。存活的重組體中cat-sacB基因盒的缺失被高度強(qiáng)化。一種基因盒被構(gòu)建用以便于基因刪除。利用JMcatsacB引物組(表3)通過PCR從pEL04擴(kuò)增出cat-sacB區(qū)域(Lee等人,2001 ;Thomason等人，2005),經(jīng)NheI酶切，并連入 PL0I3421的相應(yīng)位點(diǎn)，以獲得pL0I4151。利用pL0I4151 (模板)和cat-上游2/sacB-下游2引物組(EcoRV位點(diǎn)包含在每個(gè)引物中)，通過PCR擴(kuò)增出cat-sacB基因盒，經(jīng)EcoRV酶切，并用于后續(xù)的連接。利用引物組mgsA-上游/下游擴(kuò)增出mgsA基因和鄰近的500bp區(qū)域(yccT，-mgsA-helD’，1435bp),并將其克隆至 pCR2. I-TOPO 載體(Invitrogen)以獲得質(zhì)粒PL0I4228。這種質(zhì)粒的1000倍稀釋制劑被用作反向擴(kuò)增的模板，所述反向擴(kuò)增使用mgsA-1/2引物組(兩種引物都包含mgsA基因并朝向外面)。合成的包含復(fù)制子的4958bp片段被連到從PL0I4151擴(kuò)增、經(jīng)EcoRV酶切切割的cat-sacB基因盒，以獲得pL0I4229。所述4958bp片段還被用于構(gòu)建另一種質(zhì)粒，PL0I4230 (磷酸化和自連接)。pL0I4230中，mgsA的中心區(qū)域是缺失的(yccT’ -mgsA’ -mgsA”_hel)。pL0I4229和pL0I4230經(jīng)XmnI酶切(在載體內(nèi))后，各自用作擴(kuò)增模板，利用mgsA-上游/下游引物組生產(chǎn)線性DNA片段，所述線性DNA片段分別用于整合步驟I (yccT’-mgsA，-cat-sacB_mgsA”-helD’)和步驟 II (yccT，-mgsA，-mgsA”_helD，)。步驟 I 片段通過電穿孔進(jìn)入含有pKD46(Red重組酶)的KJ060后，在30°C培養(yǎng)2h以允許表達(dá)和分離，然后在平板上(30°C，18h)應(yīng)用氯霉素(40mg Γ1)和氨芐青霉素QOmgr1)抗性篩選重組體。三種克隆被選擇，在含氨芐青霉素和5% w/v阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并為電穿孔做準(zhǔn)備。在步驟II片段通過電穿孔進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞在37°C培養(yǎng)4h，然后轉(zhuǎn)移至含有IOOml改良的LB培養(yǎng)基(加入IOOmM MOPS緩沖液，并省略NaCl)的250ml容器中，所述改良的LB培養(yǎng)基含10%蔗糖。過夜培養(yǎng)(37°C )后，克隆在改良的LB平板上(不含NaCl ;加入IOOmMMOPS)進(jìn)行篩選(39°C，16h)，所述改良的LB平板中含6%蔗糖。合成的克隆用氨芐青霉素和氯霉素抗性的缺失進(jìn)行測(cè)試。所述構(gòu)建經(jīng)PCR分析得到進(jìn)一步證實(shí)。一種缺少mgsA基因的克隆被選擇，并命名為KJ070。從KJ071中刪除poxB基因的方法類似于刪除mgsA基因所用的方法。另外的用于構(gòu)建poxB缺失的引物組(poxB-上游/下游和poxB-1/2)連同相應(yīng)的質(zhì)粒(pL0I4274,PL0I4275，和pL0I4276)列在表3。合成的菌株被命名為KJ072。tdcDE，和aspC中基因缺失的構(gòu)建利用tdcDE上/下引物擴(kuò)增出tdcDE基因及鄰近的IOOObp區(qū)域(tdcG，-tdcFED-tdcC’，5325bp)，并將其克隆至 pCR2. I-TOPO 載體，以生產(chǎn)質(zhì)粒 pL0I4515。所述質(zhì)粒DNA的1000倍稀釋制劑被用作模板，利用tdcDEF7/R7引物(兩種引物都包含tdcDE并朝向外面)進(jìn)行反向擴(kuò)增。合成的包含復(fù)制子的6861bp片段被連入從pL0I4162擴(kuò)增的(JMcatsacB上游3/下游3引物)、經(jīng)Smal/Sfol酶切的cat-sacB基因盒，以生產(chǎn)PL0I4516。6861bp片段還被用于構(gòu)建另一種質(zhì)粒pL0I4517(經(jīng)激酶處理，自連接)，所述PL0I4517包含tcdD和tdcE的缺失。從pL0I4516和pL0I4517擴(kuò)增(tdcDE上游/下游引物)得到的PCR片段被用于替換KJ091中的tdcDE區(qū)域。合成的克隆用氨芐青霉素和氯霉素抗性的缺失進(jìn)行測(cè)試。從KJ104中刪除aspC基因的方法類似于刪除tdcDE基因所用的方法。另外的用于構(gòu)建aspC缺失的引物組(aspC上游/下游和aspCl/2)連同相應(yīng)的質(zhì)粒(pL0I4280，PL0I4281，和pL0I4282)列在表7。合成的菌株被命名為KJ110。不管是KJ098還是KJllO在各自的缺失區(qū)域(tdcDE和aspC)均不包含任何間插序列。gldA和dhaKLM中基因缺失的構(gòu)建 利用上述基因方法，從大腸桿菌菌株XZ632獲得大腸桿菌菌株XZ464，XZ465，和XZ466。大腸桿菌菌株XZ464，XZ465, XZ466和XZ632的相關(guān)特征見表15。實(shí)時(shí)RT-PCR分析先前，實(shí)時(shí)PT-PCR已被用于測(cè)量信使RNA水平(Jarboe等人，2008)。細(xì)胞在含5%或10%葡萄糖的NBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期通過在干冰/乙醇浴中渦旋收集，然后離心分離并在_80°C下于RNALater (Qiagen, Valencia CA)中儲(chǔ)存直至純化。RNA利用RNeasy Mini塔器(Qiagen)進(jìn)行純化,然后經(jīng)DNaseI (Invitrogen)酶切。使用50ng總RNA為模板,利用反轉(zhuǎn)錄酶Superscript II (Invitrogen, Carlsbad CA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用 SYBR Green RT-PCR mix (Bio-Rad, Hercules CA)在 Bio-Rad iCycler 中進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。在反轉(zhuǎn)錄缺失的情況下，通過運(yùn)行RT-PCR檢測(cè)RNA的基因組DNA污染。使用基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估轉(zhuǎn)錄豐度，且表達(dá)水平通過birA基因標(biāo)準(zhǔn)化，所述birA基因是一種轉(zhuǎn)錄抑制劑(Jarboe等人,2008)。用于pck和birA的RT-PCR引物列在表3。pck區(qū)域的測(cè)序?yàn)榱肆私釱J073的pck基因中是否存在任何突變，通過PfuUltra High FidelityDNA Polymerase (Stratagene ；ffilmington, DE)擴(kuò)增出 KJ012 和 KJ073 中的 pck 基因的編碼區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域(在編碼區(qū)域前大約800bp)。使用引物組pck-F/R擴(kuò)增出經(jīng)過轉(zhuǎn)錄終止子的所述的編碼區(qū)域(表9)。使用引物組pck-2/3擴(kuò)增出所述的啟動(dòng)子區(qū)域。DNA測(cè)序由佛羅里達(dá)大學(xué) Interdisciplinary Center for Biotechnology Research 提供(使用Applied Biosystems autosequencers)。代謝進(jìn)化來自pH控制的發(fā)酵的細(xì)胞，在24h被連續(xù)轉(zhuǎn)接，通過基于生長(zhǎng)的篩選以促進(jìn)代謝進(jìn)化。將大約為新培養(yǎng)基體積1/100的接種物直接加入預(yù)溫的、新鮮培養(yǎng)基中以達(dá)到初始( 55(|為O. 05。具有改良的發(fā)酵特征的克隆被分離。代謝進(jìn)化策略被應(yīng)用于提高琥珀酸生產(chǎn)的產(chǎn)率。分析細(xì)胞生長(zhǎng)用Bausch & Lomb Spectronic 70分光光度計(jì)測(cè)定550nm處的光密度值(OD I. O =細(xì)胞干重333mg · Γ1)來估算細(xì)胞量。利用基因工程微生物生產(chǎn)有機(jī)酸的方法可以通過使用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)技術(shù)鑒定并量化。例如，HPLC技術(shù)能被用于測(cè)量由所篩選的克隆生產(chǎn)的有機(jī)酸的數(shù)量。HPLC技術(shù)還有助于檢測(cè)由所篩選克隆生產(chǎn)的有機(jī)酸純度。有機(jī)酸和糖通過使用高效液相色譜法鑒定(Grabar 等人，2006 ；Zhang 等人，2007)。存在于發(fā)酵液中的琥珀酸和其他有機(jī)酸，用裝有BioRad Aminex HPX-87H色譜柱的安捷倫1200HPLC儀器進(jìn)行分析。BioRad Microguard Cation H+被用作保護(hù)柱。HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)樣是在O. 008N硫酸中配制。HPLC的柱溫維持在50°C。O. 008N濃度的硫酸作為流動(dòng)相，流動(dòng)速率O. 6ml/min。各種組分的定量通過測(cè)定它們?cè)?10nm的吸收實(shí)現(xiàn)。酶活測(cè)定細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期通過離心分離(8，000xg，5min，4°C )收集，用冷的IOOmMTris-HCKpH 7.0)緩沖液洗滌，并再次懸浮在同樣的緩沖液(Iml)中。在使用Fast Prep-24(MP Biomedicals, Solon, OH)進(jìn)行細(xì)胞裂解后，制品經(jīng)離心分離(13, OOOxg for15min)變得澄清。蛋白質(zhì)利用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)BCA方法(Pierce, Rockford, IL)測(cè)定。PEP羧化酶活性根據(jù)Canovas和Kornberg(1969)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)混合物包含 IOOmMTris-HCl 緩沖液(pH8. O)，IOmM MgCl2, ImM DTT,25mM NaHCO3,0. 2mM NADH,20U蘋果酸脫氫酶和粗提物。測(cè)定混合物在37°C培養(yǎng)15min使酶活化，然后添加IOmM PEP使反應(yīng)開始。PEP羧化酶活性根據(jù)Van der Werf等人，(1997)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)混合物包括 IOOmM MES 緩沖液(pH6. 6)，IOmM MgCl2, 75mM NaHCO3, 5mM MnCl2, 50mM ADP, ImMDTT,0. 2mM NADH，20U蘋果酸脫氫酶和粗提物。添加IOmM PEP使反應(yīng)開始。蘋果酸酶活性(羧化方向)根據(jù)Stols和Donnelly (1997)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)混合物包括 IOOmM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 5)，25mM NaHCO3, ImM MnCl2, ImM DTT,0. 2mM NADH和粗提物。通過添加25mM丙酮酸開始反應(yīng)。由于乳酸脫氫酶的存在，所述測(cè)定方法不適于野生型大腸桿菌中SfcA活性的測(cè)定。β -半乳糖苷酶活性根據(jù)Miller (1992)所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。在所有的測(cè)定中，一單位活力代表每分鐘氧化或還原Inmol底物所需要的酶量。實(shí)施例I用于琥珀酸生產(chǎn)的KJ073菌株的構(gòu)建在構(gòu)建用于在含5%葡萄糖的基本培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸的菌株的過程中，要遵循合理的設(shè)計(jì)方法和代謝進(jìn)化。通過考察圖I所闡明的普遍接受的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵路徑，對(duì)產(chǎn)琥珀酸菌株進(jìn)行合理的代謝工程設(shè)計(jì)，其中在編碼所有替代產(chǎn)物的終止步驟的基因中制造插入失活，所述的替代產(chǎn)物是乳酸(IdhA)，乙醇(adhE)和乙酸(ackA)。所述的經(jīng)合理設(shè)計(jì)的代謝工程產(chǎn)生的結(jié)果是完全出乎意料的。由ldhA，adhE和ack基因的插入失活獲得的KJ012(AldhA: :FRT AadhE: :FRT Λ ackA: :FRT)菌株在厭氧條件下在含5%葡萄糖(278mM)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)非常不好，并生成乙酸而非琥珀酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。與合理設(shè)計(jì)的期望相反，琥珀酸成為副產(chǎn)物。這些突變的結(jié)果是，基于代謝葡萄糖的琥珀酸的摩爾產(chǎn)量沒有改變。親本和KJ012菌株在含5%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵過程中，每摩爾葡萄糖均產(chǎn)生O. 2mol琥珀酸。我們確認(rèn)NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基包含KJ012在有氧條件下培養(yǎng)(有氧搖瓶培養(yǎng)；5%葡萄糖)時(shí)生長(zhǎng)所需的所有無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)素。有氧搖瓶培養(yǎng)中，KJ012細(xì)胞產(chǎn)率是厭氧生長(zhǎng)過程的5倍，是厭氧生長(zhǎng)過程E. coli C(親本)的75%。所述結(jié)果也證實(shí)了 KJ012中所有的主要生物合成路徑都起作用。當(dāng)天然營(yíng)養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基)存在時(shí)，KJ012發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸相比于KJ012在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中增加19倍，且琥珀酸摩爾產(chǎn)率增加2. 5倍。顯然，在主要路徑基礎(chǔ)上的合理設(shè)計(jì)更適于學(xué)術(shù)證明或設(shè)計(jì)計(jì)劃使用天然營(yíng)養(yǎng)物的過程。KJ012在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中在厭氧代謝過程中生長(zhǎng)不好，琥珀酸生產(chǎn)不好，及乙酸生產(chǎn)增加的根據(jù)是未知的。這些是使用在標(biāo)準(zhǔn)路徑圖基礎(chǔ)上的合理設(shè)計(jì)的代謝工程產(chǎn)生的出乎意料的結(jié)果。在基本培養(yǎng)基中，對(duì)代謝工程的合理設(shè)計(jì)顯然是不可預(yù)測(cè)的。合成的菌株KJ012，生長(zhǎng)劣于親本，琥珀酸生產(chǎn)與親本基本一樣。與親本E.coli C相比，KJ012( AldhA: :FRT AadhE: :FRT Λ ackA: :FRT)生長(zhǎng)不好，表現(xiàn)出更低速的琥珀酸生產(chǎn)，且沒有提供更好的摩爾產(chǎn)率(表4)。
不管這些結(jié)果，這個(gè)菌株的連續(xù)轉(zhuǎn)接嘗試作為一種基于下列基本原理的對(duì)于生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)改進(jìn)的共同篩選方法。葡萄糖發(fā)酵生成琥珀酸的主要路徑(圖IA和2A)被普遍認(rèn)為是使用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)進(jìn)行所述羧化步驟(Unden和Kleefeld,2004 ；Fraenkel 1996 ;Keseler 等人，2005 ；Millard et al. , 1996 ；Gottschalk, 1985 ；Karp等人，2007)。羧化酶不能保存磷酸烯醇式丙酮酸中的高能磷酸，并減少可用于生長(zhǎng)的凈ATP。另外可供選擇的琥珀酸生產(chǎn)路徑能展望的是利用已知的能提高ATP產(chǎn)率從而增加琥珀酸生產(chǎn)的大腸桿菌基因譜型(圖1A;圖2B，2C和2D)。然而，這些可供選擇路徑中沒有一條已經(jīng)顯示出在大腸桿菌的天然菌株發(fā)酵期間對(duì)于生產(chǎn)琥珀酸起作用。這些可供選擇路徑中關(guān)鍵酶被葡萄糖阻遏并且在糖異生過程具有正?；钚?。典型地，這些糖異生酶的水平的變化趨勢(shì)與葡萄糖和其他代謝物的可利用性是相反的(Goldie和Sanwal, 1980a ；ffright和Sanwal, 1969 ；Sanwal和Smando, 1969a),且在相反方向(去羧基)起作用(Keseler等人，2005 ；0h 等人，2002 ；Kao 等人，2005 ；Stols 和 Donnelly, 1997 ；SamueIov 等人，1991 ；Sanwal,1970a ；Delbaere 等人，2004 ；Goldie 和 Sanwal,1980b ；Sanwal 和 Smando,1969b ；Sanwal 1970b)。作為其中一條可供選擇路徑的關(guān)鍵酶，NADH-蘋果酸酶(sfcA)(圖2B)，已被證實(shí)能夠增加大腸桿菌中琥珀酸生產(chǎn)，但是需要從一種質(zhì)粒過量表達(dá)才能實(shí)現(xiàn)(Stols和Donnelly, 1997)。然而，這些可供選擇的途徑中沒有一條可被指望在大腸桿菌的天然菌株或KJ012的厭氧生長(zhǎng)過程中在高水平的葡萄糖存在下是起作用的。伴隨著生長(zhǎng)改進(jìn)篩選的KJ012的連續(xù)轉(zhuǎn)接，提供了一個(gè)機(jī)會(huì)對(duì)用于琥珀酸生產(chǎn)的可選擇路徑的突變激活進(jìn)行篩選(圖1B)，所述的突變激活能保持氧化還原平衡并增加ATP產(chǎn)率。KJ012的代謝進(jìn)化的實(shí)施是通過各種機(jī)制下使用小的、pH控制的發(fā)酵罐，連續(xù)接種以改進(jìn)生長(zhǎng)。KJO12在發(fā)酵條件下被連續(xù)轉(zhuǎn)接到NBS葡萄糖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接速度在生長(zhǎng)的條件下盡可能快(圖3A;圖4A;圖5)。在前9次轉(zhuǎn)接之間，生長(zhǎng)較慢，需要培養(yǎng)4-5天，然后生長(zhǎng)戲劇性地提高，使得轉(zhuǎn)接間隔為24h。與之伴隨的是乙酸生產(chǎn)的增加(圖4A)，而琥珀酸生產(chǎn)幾乎沒有改進(jìn)。在27次轉(zhuǎn)接后(60天)，用I : I的3M K2CO3和6N KOH混合物替換KOH以提供額外的二氧化碳(IOOmM最初加入所有NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中)。繼續(xù)的轉(zhuǎn)接導(dǎo)致琥珀酸生產(chǎn)的增加。在5%葡萄糖(227mM)中轉(zhuǎn)接40次，然后在10%葡萄糖(555mM)另外轉(zhuǎn)接40次。在10%葡萄糖轉(zhuǎn)接過程中，每摩爾葡萄糖代謝生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)率保持在大約O. 7mol，同時(shí)乳酸、乙酸和甲酸為共同產(chǎn)物(表4)。這個(gè)產(chǎn)率比E.coli C和KJ012菌株高2倍。一種克隆被分離并命名為KJ017。對(duì)于KJ012到KJ017的生長(zhǎng)改進(jìn)的篩選同時(shí)也是對(duì)琥珀酸生產(chǎn)(產(chǎn)率，效價(jià)和摩爾產(chǎn)量)的改進(jìn)的共篩選。大腸桿菌利用通常被認(rèn)為天然發(fā)酵路徑的基于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)的路徑生產(chǎn)琥珀酸，磷酸烯醇式丙酮酸的能量經(jīng)由生成無機(jī)磷酸鹽而被浪費(fèi)。通過所述路徑，每生產(chǎn)I分子琥珀酸損失I分子ATP(圖1，圖6)。利用另外的可供選擇的酶系統(tǒng)將這些能量?jī)?chǔ)存在ATP中，代表了一個(gè)機(jī)會(huì)以改進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及同時(shí)增加琥珀酸生產(chǎn)。基于大腸桿菌中的已知基因，三種其他的用于琥珀酸生產(chǎn)的酶路線設(shè)想將能儲(chǔ)存ATP從而改進(jìn)生長(zhǎng)(圖1，圖6)。然而，這些可供選擇路線中的所有羧化步驟被認(rèn)為在反方向起作用(去羧基)，主要是在生長(zhǎng)過程中基于底物(例如有機(jī)酸)的糖異生中起作用(Keseler等人，2005 ；0h 等人，2002 ；Kao 等人，2005 ；Stols 和 Donnelly, 1997 ；SamueIov 等人，1991 ；Sanwal,1970a ；Delbaere 等人，2004 ；Goldie 和 Sanwal,1980b ；Sanwal 和 Smando,1969b ；Sanwal, 1970b).。為了證明為培育KJ017而進(jìn)行的基于生長(zhǎng)的篩選確實(shí)已經(jīng)活化了一條或 多條可供選擇的路徑的假設(shè)，對(duì)野生型菌株ATCC 8739、KJ012 (在主要代謝路徑中被刪除)和代謝進(jìn)化的KJ0174(表5)中的4種羧化酶的活性進(jìn)行比較。PEP羧化酶活性總體上差不多低，20到30U(mg蛋白Γ1。NADH-蘋果酸酶活力(SfcA ;羧化方向)也低，且NADPH-蘋果酸酶活力(MaeB ;羧化方向)無法測(cè)量。相比之下，KJO17中PEP羧激酶活性與KJ012相比增加了 3倍，與假設(shè)一致，基于生長(zhǎng)改進(jìn)的篩選通過提高ATP產(chǎn)率增加了琥珀酸生產(chǎn)，這是增強(qiáng)琥珀酸生產(chǎn)的能量?jī)?chǔ)存路線的表達(dá)的結(jié)果。進(jìn)一步的基于生長(zhǎng)的篩選和另外的基因缺失被用于構(gòu)建許多其他菌株，所述菌株在生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)方面具有進(jìn)一步的改進(jìn)(圖3和圖4)。在10 % (w/v)葡萄糖生長(zhǎng)期間，多余的聯(lián)產(chǎn)物(乙酸、甲酸和乳酸)在KJ017( AldhA: :FRT AadhE: :FRTA ackA: :FRT)發(fā)酵中被富集，盡管刪除了編碼主要的乳酸脫氫酶(IdhA)和乙酸激酶(ackA)活性的基因(表4)。乳酸和乙酸的生產(chǎn)還能導(dǎo)致更高的ATP產(chǎn)率，ATP產(chǎn)率是基于生長(zhǎng)的篩選的基礎(chǔ)(圖1A)。從KJ017中刪除編碼丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的基因，以消除還原劑如甲酸的損失和過量的乙酰輔酶A，所述的乙酰輔酶A是乙酸的一個(gè)潛在來源。在這個(gè)操縱子中的上游甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(focA)也被刪除。正如預(yù)期的，經(jīng)過刪除的菌株(KJ032)在缺乏乙酸情況下不能生長(zhǎng)，這證明這是KJ017中產(chǎn)乙酰輔酶A的主要路線(圖3C)。眾所周知，pflB的缺失會(huì)引起厭氧條件下的乙酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Sawers和Bock, 1988)。通過添加20mM乙酸可以修復(fù)KJ032的生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)(圖3C，圖4C，和圖5)。作為pflB (和focA)缺失的結(jié)果，甲酸和乙酸生產(chǎn)大大減少。盡管這種菌株生長(zhǎng)需要乙酸，但是發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生額外的乙酸。在構(gòu)建用于丙酮酸生產(chǎn)的E. coli K-12生物催化劑中，pflB-缺失的菌株的同樣現(xiàn)象先前已被報(bào)道(Causey等，2004)。KJ032中乳酸水平也降低(表4 ;圖4C)。隨后的轉(zhuǎn)接伴隨著生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)的改進(jìn)。隨后的轉(zhuǎn)接中，乙酸添加減少，接種物尺寸減小，葡萄糖濃度加倍(10% w/v)(圖3D和4D)。在進(jìn)一步轉(zhuǎn)接后，省略乙酸，培育出不再是乙酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，大概歸因于其他基因表達(dá)的增強(qiáng)。然而，由于添加乙酸的去除，琥珀酸產(chǎn)率降低，同時(shí)蘋果酸和乙酸水平增加。從最后轉(zhuǎn)接物中分離的克隆被命名為KJ060(A ldhA: :FRT AadhE: :FRT Λ ackA: :FRT Δ focA-pflB: :FRT)。所述菌株在含 10%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每代謝Imol葡萄糖產(chǎn)生Imol琥珀酸。存在于各種菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中的少量乳酸據(jù)推測(cè)是來源于丙酮醛合成酶路徑(圖6 ；Grabar等，2006)。盡管這僅代表產(chǎn)率的很少量損失，但通過這條路徑乳酸的生產(chǎn)表示丙酮醒的累積，而丙酮醒是糖酵解和生長(zhǎng)兩者的抑制劑(Egyud和Szent-Gyorgyi, 1966 ；Grabar等，2006 ;Hopper和Cooper, 1971)。通過刪除KJ060中的mgsA基因(丙酮醒合成酶)消除丙酮醛和乳酸的生產(chǎn)，以獲得KJ070(AldhA: :FRT Λ adhE: :FRT Λ ackA: :FRTΔ focA-pflB: :FRT AmgsA)。菌株KJ070先在5% (w/v)葡萄糖中傳代培養(yǎng)(圖3E，圖4E，和圖5)。據(jù)推測(cè)mgsA的刪除提高了糖酵解速率，其通過培養(yǎng)基中丙酮酸的累積得到證實(shí)(表4)。糖酵解速率的提高還可能是因?yàn)椴蒗Ｒ宜嵘a(chǎn)的增加而導(dǎo)致琥珀酸/蘋果酸比率的下降，所述草酰乙酸是延胡索酸還原酶的變構(gòu)抑制劑(Iverson等,2002 ;Sanwal, 1970c)。在第21次轉(zhuǎn)接，葡萄糖加倍至10% (w/v)，并繼續(xù)轉(zhuǎn)接。葡萄糖水平提高和隨后的轉(zhuǎn)接產(chǎn)生新菌株，所述菌株從最后的傳代培養(yǎng)基分離并被命名為KJ071( AldhA: :FRT Δ adhE: : FRT Δ ackA: : FRT Λ focA-pflB: : FRT Δ mgsA)。所述菌株可能對(duì)蘋果酸生產(chǎn)有用。盡管葡萄糖到乙酸的轉(zhuǎn)化是氧化還原中性的，碳分給乙酸還是降低了琥珀酸和蘋果酸產(chǎn)率。在微好氧條件下的培養(yǎng)過程中，丙酮酸氧化酶(PoxB)是乙酸和CO2的潛在來源(Causey等,2004)。盡管poxB在厭氧條件下不應(yīng)該對(duì)氧化丙酮酸起作用，但其還是基因刪除的目標(biāo)(圖6)。正如預(yù)期的，刪除poxB獲得KJ072(AldhA::FRT AadhE::FRTΔ ackA: :FRT Δ focA-pflB: :FRT AmgsAApoxB)沒有減少乙酸生產(chǎn)，這表明在乙酸生產(chǎn)中涉及了另外可供選擇的路徑。然而，消除PoxB導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中意料外的改變，包括琥珀酸增加(表4;圖4F)。這種琥珀酸生產(chǎn)改進(jìn)的機(jī)制不清楚，但可能與丙酮酸氧化酶的其他活性有關(guān)，如丁酮生產(chǎn)、脫羧和聚醒(Ajl和Werkman, 1948 ；Chang和Cronan, 2000)。菌株KJ072在AMl培養(yǎng)基經(jīng)受進(jìn)一步的40輪代謝進(jìn)化，所述培養(yǎng)基為低鹽培養(yǎng)基，含10% (w/v)葡萄糖(表4 ;圖3F，圖4F，和圖5)。在這些轉(zhuǎn)接中，生長(zhǎng)、細(xì)胞產(chǎn)率和琥珀酸生產(chǎn)的改進(jìn)是可以觀察到的。蘋果酸，丙酮酸和乙酸水平也得到提高。從最后的轉(zhuǎn)接物中分離出克隆，并被命名為 KJ073(A ldhA: :FRT AadhE: :FRT Λ ackA: :FRT ApflB: :FRTΔmgsA ΔpoxB)。KJ073菌株保留了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的羧化路線(表5)。所述菌株的體外活性是KJ012的45倍，是KJ017的10倍，這為能量?jī)?chǔ)存與琥珀酸生產(chǎn)和生長(zhǎng)之間的緊密關(guān)聯(lián)提供了進(jìn)一步證據(jù)，并進(jìn)一步建立了用于篩選的基礎(chǔ)。PEP羧激酶活性的大幅增強(qiáng)與細(xì)胞產(chǎn)率和琥珀酸生產(chǎn)的改進(jìn)密切關(guān)聯(lián)(表5)。從KJO12到KJ017 (代謝進(jìn)化)，PEP羧激酶活性增加3. 3倍，細(xì)胞產(chǎn)率增加4. 7倍，且琥珀酸生產(chǎn)增加7. 8倍。從KJ017到KJ060 (刪除pflB，跟著進(jìn)行代謝進(jìn)化)，PEP羧激酶活性增加11倍，細(xì)胞產(chǎn)率增加O. 3倍，且琥珀酸生產(chǎn)增加I. 6倍。從KJ060到KJ071 (刪除mgsA,跟著進(jìn)行代謝進(jìn)化)，PEP羧激酶活性降低92 %，細(xì)胞產(chǎn)率降低45 %，琥珀酸生產(chǎn)減少63 %。從KJ071到KJ073 (刪除poxB，跟著進(jìn)行代謝進(jìn)化)，PEP羧激酶活性、細(xì)胞產(chǎn)率和琥珀酸生產(chǎn)保持與KJ060等同的水平。從KJ012和KJ073克隆pck和周圍區(qū)域，并測(cè)序。沒有在編碼區(qū)域發(fā)現(xiàn)變化。不存在翻譯后修飾，酶的催化性能應(yīng)該無變化。在pck啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)單一突變，在相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn)_64bp位點(diǎn)處G變?yōu)锳。所述突變是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后面,所述的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是在相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn)_139bp位點(diǎn)處。先前的研究者已經(jīng)注意到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可能對(duì)羧化作用和琥珀酸生產(chǎn)有重要影響(Millard等，1996 ;Kim等，2004)。大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)對(duì)碳酸氫鹽的Km為
O.15mM (Morikawa等，1980)，是憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck) (13mM)的1/9倍(Krebs和Bridger, 1980)。盡管利用多拷貝質(zhì)粒使E. coli的pck過量表達(dá),這使磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性增加了 49倍，但是根據(jù)報(bào)道這對(duì)琥珀酸生產(chǎn)沒有影響(Millard等，1996)。當(dāng)來自產(chǎn)玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)的憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶在E.coli K12中被過量表達(dá)，琥珀酸生產(chǎn)也沒有增加(Kim等，2004)。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶對(duì)碳酸氫鹽也有高Km(30mM) (Laivenieks等，1997)。然而，當(dāng)產(chǎn)琥拍酸厭氧螺菌pck在E. coli K12的ppc突變中被過量表達(dá)，琥珀酸生產(chǎn)增加5. 5倍(Kim等， 2004)。在KJ017及其序列派生物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶明顯是占優(yōu)勢(shì)的羧化活性，即使是在功能性天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在下。E.coli C的酶測(cè)量結(jié)果相當(dāng)令人驚訝。通常被認(rèn)作在天然大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸中占優(yōu)勢(shì)的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；ppc)在生長(zhǎng)過程中(Unden和Kleefeld, 2004 ；Fraenkel, 1996 ；Keseler 等，2005 ；Millard 等，1996 ；Gottschalk, 1985 ；Karp 等，2007)不是E.coli C活體內(nèi)最活躍的酶。因此，普遍接受的作為代謝工程的合理設(shè)計(jì)和代謝通量的估計(jì)的基礎(chǔ)的大腸桿菌代謝路徑(Unden和Kleefeld, 2004 ；Fraenkel, 1996 ；Sanchez等，2006 ；Cox 等，2006 ；Vemuri 等，2002a ；ffang 等，2006 ； Sanchez 等，2005ab ；Gokarn 等，2000 ；Karp等，2007)可能不能準(zhǔn)確反映所有菌株的新陳代謝。在活體內(nèi)底物飽和情況下，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性是最活躍的。E.coli K12中，據(jù)報(bào)道磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶兩者的活性在活體內(nèi)相等(140nm細(xì)胞蛋白；Van der Werf等，1997)，前者作為琥珀酸生產(chǎn)的主要路線。先前的研究顯示，大腸桿菌中天然ppc基因的過量表達(dá)導(dǎo)致更高的特異性琥珀酸生產(chǎn)(Millard等，2000)，更高的特異性生長(zhǎng)率，和更低的特異性乙酸生產(chǎn)，歸因于更多的PEP的羧化補(bǔ)充了 TCA循環(huán)中間產(chǎn)物(Farmer和Liao，1997)。然而，由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)需要PEP，與同基因控制相比，ppc的過量表達(dá)使得葡萄糖攝取率降低15-40%，琥珀酸產(chǎn)率(每摩爾葡萄糖)也沒有顯著增加(Chao和Liao, 1993 ;Gokarn等,2000)。天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在增加琥珀酸產(chǎn)率上的失敗將大部分的研究注意力轉(zhuǎn)移到一種新的代謝設(shè)計(jì)上，即使來自乳酸菌桿菌(Lactobacillus lactis)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PYC (丙酮酸羧化酶)過量表達(dá)作為羧化步驟(Vemuri等，2002ab ;Gokarn等,2000 ;Lin等，2005a, 2005b, 2005c)，而不是繼續(xù)從事對(duì)于大腸桿菌基因的天然譜型的進(jìn)一步的研究。瘤胃細(xì)菌如產(chǎn)琥拍酸放線菌(Actinobacillus succinogenes)在葡萄糖發(fā)酵過程中生產(chǎn)琥珀酸作為主要產(chǎn)物，所述葡萄糖發(fā)酵利用儲(chǔ)存能量的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶進(jìn)行羧化(Kim 等.,2004 ;McKinlay 等，2005 ;McKinlay 和 Vieille，2008)。據(jù)報(bào)道，這種有機(jī)體的活性是KJ017的5倍，是KJ073經(jīng)連續(xù)的基于生長(zhǎng)的篩選(代謝進(jìn)化)獲得的有機(jī)體的一半。因此，通過利用代謝工程(ldhA adhE ackA)和代謝進(jìn)化(基于生長(zhǎng)的篩選用于增加ATP生產(chǎn)效率)的結(jié)合，此處報(bào)道的研究證實(shí)了僅使用大腸桿菌基因的天然譜型的產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌菌株的培育，所述菌株類似于瘤胃有機(jī)體，例如產(chǎn)琥珀酸放線菌(A. succinogenes)。盡管先前報(bào)道了 E. coli的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)的過量表達(dá)對(duì)于不存在磷酸烯醇式丙酮酸合成酶突變情況下的琥珀酸生產(chǎn)是沒用的(Chao和Liao，1993 ;Kim等,2004 ;Gokarn等,2000 ;Millard等，1996),但KJ017和派生物已通過代謝進(jìn)化利用磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶作為琥珀酸和蘋果酸生產(chǎn)的主要路線。圖7顯示了 KJ060和KJ073的分批發(fā)酵，KJ060和KJ073是作為琥珀酸生產(chǎn)的兩種最優(yōu)生物催化劑。盡管在培養(yǎng)的最初48h內(nèi)生長(zhǎng)完成，但琥珀酸生產(chǎn)要繼續(xù)培養(yǎng)96h。三分之一的琥珀酸發(fā)生在不存在細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下。這些菌株生成的琥珀酸，效價(jià)668-733mM，基于代謝葡萄糖的摩爾產(chǎn)率為I. 2-1. 6。在AMl培養(yǎng)基上的產(chǎn)率明顯高于NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基。乙酸、蘋果酸和丙酮酸累積成為不被期望的聯(lián)產(chǎn)物并減損琥珀酸的潛在產(chǎn)率(表4)。葡萄糖和CO2 (過量)生產(chǎn)琥珀酸的最大理論產(chǎn)率是基于下列方程式的每摩爾葡萄糖生產(chǎn)
I.7ImoI琥珀酸C6H1206+6C02 — 12C4H604+6H20。然而，大腸桿菌中不存在直接的琥珀酸路徑能達(dá)到這個(gè)產(chǎn)率(圖6)。 本研究主要集中于葡萄糖到琥珀酸的轉(zhuǎn)化。眾所周知，大腸桿菌具有天然的代謝所有己糖和戍糖的能力，所述己糖和戍糖是植物細(xì)胞壁成分(Asghari等，1996 ；Underwood等,2004)。大腸桿菌的一些菌株還能代謝鹿糖(Moniruzzaman等，1997)。在血清管中測(cè)試菌株KJ073對(duì)己糖和戊糖(2%糖)的利用。在所有情況下，這些糖類主要被轉(zhuǎn)化為琥珀酸。菌株KJ073還代謝甘油生成琥珀酸。在2%甘油存在下的培養(yǎng)過程中，143mM甘油被代謝生成127mM琥珀酸，摩爾產(chǎn)率為O. 89，或者是利用甘油作為碳源的細(xì)菌生長(zhǎng)生產(chǎn)琥珀酸的最大理論產(chǎn)率的89%。大腸桿菌的發(fā)酵代謝已顯示出顯著的適應(yīng)性。派生物經(jīng)基因工程和代謝進(jìn)化避免了許多與天然發(fā)酵路徑相關(guān)的基因的缺失并提高了流經(jīng)剩余酶的通量以維持氧化還原平衡、增加ATP生產(chǎn)的效率及改善生長(zhǎng)。雖然面臨更多的挑戰(zhàn)，但細(xì)胞能在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中平衡碳分割的同時(shí)產(chǎn)生適應(yīng)性改變，以供給所有生物合成需要。在消除NADH氧化(乳酸脫氫酶，乙醇脫氫酶)和乙酸生產(chǎn)(乙酸激酶)的主要路徑后，生長(zhǎng)和ATP生產(chǎn)仍然與NADH氧化和蘋果酸或琥珀酸的生產(chǎn)相聯(lián)系以維持氧化還原平衡(圖1B)?；趨捬跎L(zhǎng)的篩選確保了氧化還原平衡以及對(duì)于效率提高和ATP生產(chǎn)速率提高的篩選，它們是生產(chǎn)改善的基礎(chǔ)。這種對(duì)于氧化還原平衡和ATP生產(chǎn)的篩選在蘋果酸作為終產(chǎn)物和琥珀酸作為終產(chǎn)物之間不能很容易地區(qū)分，因?yàn)閮烧叩那绑w均是作為電子受體。pflB的刪除導(dǎo)致了對(duì)于乙酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型需求，所述pflB是厭氧生長(zhǎng)過程中乙酰輔酶A的主要來源(Sawers和Bock，1988)。這種需求通過代謝進(jìn)化得以消除，據(jù)推測(cè)是因?yàn)橥ㄟ^其他路線(例如丙酮酸脫氫酶)生產(chǎn)乙酰輔酶A的增加(de Graef et等人，1999)。能取代這種營(yíng)養(yǎng)缺陷型需求的乙酸或乙酰輔酶A的代謝源是未知的。poxB刪除后，琥珀酸生產(chǎn)的增加也是出人意料的。據(jù)觀察，乙酸水平幾乎沒有改變，這表明這種酶是乙酸的次要來源或者它被乙酸生產(chǎn)的其他功能性路線取代了。PoxB刪除后，琥珀酸仍然被作為主要的二元羧酸生成。伴隨著PoxB刪除的代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變是出乎意料的。即使是使用琥珀酸生產(chǎn)的最優(yōu)菌株KJ060和KJ073，蘋果酸和乙酸仍然是大量的聯(lián)產(chǎn)物(表4 ;圖4D和4F)。這些聯(lián)產(chǎn)物的消除代表著一個(gè)進(jìn)一步提高產(chǎn)率的機(jī)會(huì)。
所有先前為琥珀酸生產(chǎn)培育的的工程大腸桿菌，使用天然培養(yǎng)基和抗性質(zhì)粒來保持。在簡(jiǎn)單分批發(fā)酵中，大部分僅僅獲得了低效價(jià)的琥珀酸，需要更多的復(fù)雜過程以獲得高效價(jià)(表I)。其他研究者還使用了異源基因和復(fù)雜過程，所述的復(fù)雜過程包括氣體(co2，H2,02或空氣)鼓泡以及好氧和厭氧兩步過程。許多基因方法被報(bào)道增加了琥珀酸生產(chǎn)，所述的琥珀酸生產(chǎn)是通過重組大腸桿菌在天然培養(yǎng)基中以葡萄糖為原料進(jìn)行的?？梢灶A(yù)期，過程和營(yíng)養(yǎng)物的復(fù)雜性會(huì)增加構(gòu)建、材料、純化及廢物處理的成本。包含維生素、氨基酸和其他前體大分子的天然培養(yǎng)基可能會(huì)掩蓋代謝和生物合成中潛在的調(diào)控問題，這些調(diào)控問題是由代謝工程帶來的。在我們最初的構(gòu)建中，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和糖代謝都很弱，但在天然培養(yǎng)基(LB)中很強(qiáng)。相比之下，菌株KJ060和KJ073使用無機(jī)鹽培養(yǎng)基在簡(jiǎn)單分批發(fā)酵(10%糖)中產(chǎn)生高效價(jià)的琥珀酸^00-700mM)，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基不含任何天然營(yíng)養(yǎng)物或外源基因。實(shí)施例2用于琥珀酸生產(chǎn)的KJ134菌株的構(gòu)建
如實(shí)施例I所描述，E. coli C野生型中的主要的厭氧發(fā)酵基因通過Datsenko &Wanner (2000)的策略被連續(xù)刪除，所述策略為借助PCR產(chǎn)物和可消除的抗性標(biāo)記(利用FRT識(shí)別位點(diǎn)和FLP重組酶)。這些構(gòu)建與代謝進(jìn)化(為提高ATP生產(chǎn)效率而進(jìn)行的基于生長(zhǎng)的篩選)相結(jié)合被用于篩選一種突變菌株，所述突變菌株利用能儲(chǔ)存能量的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)來促進(jìn)生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)(圖9)。生成的菌株KJ073，每mol代謝葡萄糖能產(chǎn)生I. 2mol琥珀酸(Jantama等，2008a)，且使用的琥珀酸路徑非常類似于瘤胃細(xì)菌，如產(chǎn)琥拍酸放線桿菌(van der Werf等，1997)和產(chǎn)琥拍酸厭氧螺菌(Song等,2007)。然而，用于構(gòu)建這些基因缺失的方法，在每個(gè)被刪除基因的區(qū)域(ackA，ldhA, adhE, ackA,focA-pflB)留下單一的82-85核酸長(zhǎng)度的序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(scar)或FRT位點(diǎn)。所述FRT位點(diǎn)在抗性基因的消除過程中作為FLP重組酶的識(shí)別位點(diǎn)(Storici等，1999)。KJ073中所有外源序列使用先前所描述的方法(Grabar等,2006 ;Zhang等.2007 Jantama等，2008b)被連續(xù)消除，并用只含有所希望的基因缺失的天然DNA替換。生成的菌株KJ091，包含ackA, ldhA, adhE, focA-pflB, ackA, mgsA,和poxB的特異性缺失，且缺乏所有存在于KJ073菌株中的FRT位點(diǎn)。KJ091菌株缺乏所有外源的和合成的DNA，除了 ackA內(nèi)的一個(gè)18-bp翻譯終止序列。由菌株KJ091生產(chǎn)的琥珀酸與KJ073菌株相當(dāng)(表8)。KJ091菌株被作為親本用于琥珀酸生產(chǎn)的進(jìn)一步改進(jìn)。KJ091菌株的進(jìn)一步改進(jìn)的第一步,注意力放在減少乙酸生產(chǎn)上。在E.coli的葡萄糖厭氧發(fā)酵過程中，丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)被用作乙酰輔酶A的主要來源，乙酰輔酶A是乙酰磷酸(acetyl P)的前體，乙酸激酶(ackA)作為從acetyl P生產(chǎn)乙酸的主要路線(Karp 等，2007 ；Kessler & Knappe，1996)。菌株 KJ073 和 KJ091 中大量乙酸作為一種發(fā)酵產(chǎn)物是出乎意料的，因?yàn)檫@些菌株包含了 ackA和pflB兩者的缺失(圖9)。在發(fā)酵的最后殘留的乙酸表示一種潛在的進(jìn)一步改變新陳代謝的方向以提高琥珀酸產(chǎn)率的機(jī)會(huì)?！N具有乙酸激酶(和丙酸乙酯激酶)活性的相關(guān)的酶由tdcD編碼，但是所述酶僅為蘇氨酸的降解而被典型地生產(chǎn)(Hesslinger等，1998 ;Reed等,2003)。如圖10所示，在篩選過程中發(fā)生的突變可能已經(jīng)增強(qiáng)了 tdcD的表達(dá)。在含10% (w/v)葡萄糖的厭氧生長(zhǎng)期間，tdcD的表達(dá)將功能性替換ackA,增加從acetyl P到乙酸的生產(chǎn)。相同操縱子中的鄰近的tdcE基因與pflB相似，并編碼丙酮酸(和α-酮戊二酸)甲酸裂解酶活性，所述丙酮酸(和α-酮戊二酸)甲酸裂解酶活性在蘇氨酸降解中被共表達(dá)(Hesslinger等，1998)。所述基因在含10% (w/v)葡萄糖的厭氧生長(zhǎng)期間的表達(dá)增強(qiáng)可能會(huì)增加乙酰輔酶A (acetyl P的直接前體)的生產(chǎn)，并浪費(fèi)還原劑如甲酸(圖10)。從KJ091中同時(shí)刪除tdcD和tdcE (鄰近的)以生產(chǎn)KJ098。與KJ091相比，KJ098中這兩種基因的刪除使乙酸生產(chǎn)減半，琥珀酸產(chǎn)率增加10%，證實(shí)了這種意料之外的路徑在使碳流轉(zhuǎn)向遠(yuǎn)離琥珀酸中的重要性。KJ098生產(chǎn)的丙酮酸的水平也降低了 40%，而丙酮酸這種中間體當(dāng)兩種可供選擇的丙酮酸代謝的路線(丙酮酸甲酸裂解酶(tdcD)和乙酸激酶(tdcE)活性)被消除時(shí)總是被預(yù)期其水平會(huì)提高。丙酮酸生產(chǎn)的顯著減少是tdcD/tdcE基因缺失的意外結(jié)果。由tdcD和tdcE的同時(shí)缺失導(dǎo)致的丙酮酸減少和琥珀酸增加的機(jī)制尚不清楚。盡管KJ098代表了超越KJ091的顯著改進(jìn)，但是丙酮酸水平的進(jìn)一步降低和琥珀酸產(chǎn)率的進(jìn)一步提高是可能的。在厭氧條件下，草酰乙酸被分解成還原產(chǎn)物(蘋果酸)和氧化中間體(檸檬酸)(圖9)。檸檬酸通過檸檬酸裂解酶(citDEF)能被重新轉(zhuǎn)化為草酰乙酸和乙酸，以使細(xì)胞內(nèi)草酰乙酸(OAA)池(圖10)循環(huán)用于其他代謝功能(Nilekani等， 1983)。大量朽1檬酸裂解酶的表達(dá)與基于朽1檬酸的生長(zhǎng)有關(guān)(Lutgens和Gottschalk, 1980 ；Kulla和Gottschalk，1977)。檸檬酸裂解酶是由三種不同的多肽鏈組成的多酶復(fù)合物。α或大亞單位是一種檸檬酸-ACP(酸性磷酸酶)轉(zhuǎn)移酶，催化第一步。β或中間亞單位是檸檬酸-ACP裂解酶，催化第二步。Y或小亞單位作為?；?載體蛋白起作用，且能運(yùn)載輔基組分。所有3種亞單位對(duì)于要發(fā)生的反應(yīng)是必需的(Quentmeier等，1987)。編碼這些亞單位的一種或多種的基因的缺失，將消除檸檬酸裂解酶活性，并在琥珀酸生產(chǎn)過程中可能會(huì)進(jìn)一步降低乙酸水平。從KJ098中刪除citF基因以生產(chǎn)KJ104。然而，這種刪除對(duì)乙酸產(chǎn)物或其它琥珀酸產(chǎn)率沒有影響(表8)。由于citF的刪除沒有引起乙酸的任何減少，因此可以推測(cè)該中間體可以通過其他路徑產(chǎn)生。由于未知原因，與KJ098相比，citF的刪除對(duì)KJ104的生長(zhǎng)有不利影響(細(xì)胞產(chǎn)率減少22% )，并且在發(fā)酵最后丙酮酸水平增加大約50%。然而，KJ104的琥珀酸產(chǎn)、效價(jià)、平均生產(chǎn)力和乙酸水平可與KJ098相比(表8)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspC)是一種多功能酶，通過轉(zhuǎn)氨作用催化天冬氨酸、苯丙氨酸和其它化合物的合成。在反應(yīng)中，L-天冬氨酸由L-谷氨酸和草酰乙酸通過轉(zhuǎn)氨作用合成，所述的草酰乙酸是一種來自PEP羧化的中間體。除作為蛋白成分外，天冬氨酸參與一些其它的生物合成路徑。據(jù)估計(jì)，大約27%細(xì)胞內(nèi)的氮,通過天冬氨酸流動(dòng)(Reitzer,2004)。天冬氨酸生物合成和琥珀酸生產(chǎn)共享一個(gè)共同的草酰乙酸的細(xì)胞內(nèi)池。aspC的刪除將導(dǎo)致琥珀酸生產(chǎn)的增加，但是還可能產(chǎn)生一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型需求，所述需求會(huì)阻止基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基(如AMl培養(yǎng)基)中的厭氧生長(zhǎng)。從KJ104中刪除天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC)以生產(chǎn)KJ110。出乎意料的，與KJ104相比，aspC的刪除對(duì)KJllO的琥珀酸產(chǎn)率或細(xì)胞產(chǎn)率沒有影響(表8)。因此，在所述菌株中，天冬氨酸似乎沒有使顯著水平的草酰乙酸轉(zhuǎn)移遠(yuǎn)離琥珀酸生產(chǎn)?？晒┻x擇的酶看來好像是可以獲得的，以取代先前的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的生物合成需求。在KJ104和其他經(jīng)過基因改造的用于琥珀酸生產(chǎn)的大腸桿菌菌株的發(fā)酵的最后存在大量丙酮酸(表8)。所述丙酮酸是一種不需要的產(chǎn)物，它代表著一個(gè)進(jìn)一步提高琥珀酸產(chǎn)率的機(jī)會(huì)。如圖10所示，所述發(fā)酵液中的高水平的丙酮酸是由蘋果酸在蘋果酸酶(sfcA)作用下脫羧而生成。所述蘋果酸酶被認(rèn)為主要在糖異生過程中起作用(Unden和Kleefeld, 2004 ;Stols和Donnelly，1997 ;0h等，2002)，而非在葡萄糖的有氧分解代謝過程中。盡管丙酮酸還原羧化形成蘋果酸是熱力學(xué)優(yōu)選的，但是所述酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)優(yōu)選生理學(xué)條件下的脫氫作用和脫羧作用(Stols和Donnelly，1997)。這種使丙酮酸羧化的酶的過量表達(dá)先前已被用來作為構(gòu)建產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌菌株的基礎(chǔ)(Stols和Donnellyl997)。如果蘋果酸酶(sfcA)在KJ104(和相關(guān)菌株)中進(jìn)行羧化作用并有助于琥珀酸生產(chǎn)，那么該基因的刪除將有望降低琥珀酸產(chǎn)率并增加其他產(chǎn)物(如丙酮酸)的水平。可供選擇地，如果蘋果酸酶(sfcA)在KJ104中進(jìn)行脫羧作用并將蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，那么編碼該酶的基因的刪除將有望增加琥珀酸產(chǎn)率并降低丙酮酸水平。出乎意料的，與KJ104相t匕，從KJ104中刪除sfcA基因生成KJ119對(duì)琥珀酸生產(chǎn)、生長(zhǎng)、丙酮酸水平等等(表8)沒有產(chǎn)生可測(cè)量的影響。這些結(jié)果清楚地證明蘋果酸酶(sfcA)對(duì)KJ104和相關(guān)菌株的琥珀酸生產(chǎn)是不重要的。這個(gè)結(jié)果與Stols和Donnelly (1997)培育的產(chǎn)琥珀酸菌株形成鮮明的對(duì)比，在Stols和Donnelly (1997)培育的產(chǎn)琥珀酸菌株中，增加蘋果酸酶的生產(chǎn)是作為琥珀酸生產(chǎn)的主要路線。盡管在KJ104中沒有觀察到因sfcA的刪除或aspC的刪除而帶來顯著的優(yōu)勢(shì)，但是為了測(cè)試將兩種基因聯(lián)合刪除的效果進(jìn)行了許多研究。通過刪除KJllO的SfcA基因來生產(chǎn)KJ122，根據(jù)預(yù)期將看不到任何優(yōu)勢(shì)。然而，與親本菌株KJllO和相關(guān)菌株(KJ104和KJl 19)相比，sfcA和aspC(菌株KJ122)的聯(lián)合刪除導(dǎo)致了琥珀酸產(chǎn)率和效價(jià)的出人意料的增長(zhǎng)并且乙酸少量減少(表8)。與KJ104相比，KJ122中的聯(lián)合刪除(aspC和sfcA)導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)率增加18%，琥珀酸效價(jià)增加24%，平均生產(chǎn)力增加24%。盡管機(jī)制尚不明確，但可能的解釋是，單一突變所以無效是因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^增加流經(jīng)剩余的酶(蘋果酸酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)的流量部分地進(jìn)行補(bǔ)償(圖10)，抑制了任何潛在的優(yōu)勢(shì)。琥珀酸產(chǎn)率和效價(jià)的提高據(jù)推測(cè)是因?yàn)椴蒗Ｒ宜岬目衫眯缘脑黾?，這就允許更大部分進(jìn)行反應(yīng)生成琥珀 酸。蘋果酸水平也保持在極其低的水平。菌株KJ122(表8)每消耗Imol葡萄糖產(chǎn)生I. 5mol琥珀酸，是最大理論產(chǎn)率的88%(I. 71mol每mol葡萄糖)。為了生產(chǎn)所述高水平的琥珀酸且充分減少蘋果酸生產(chǎn)，需要額外的還原劑。盡管這種額外的還原劑的來源不清楚，但是這些結(jié)果與增加流經(jīng)丙酮酸脫氫酶的丙酮酸流量是一致的。這種酶被認(rèn)為是在有氧代謝期間起作用(Guest等，1989)，但也有報(bào)道認(rèn)為其在發(fā)酵期間起到的作用水平較低(de Graef等，1999)。KJ122獲得了極優(yōu)的琥珀酸產(chǎn)率(I. 5mol moF1葡萄糖)及更少量的乙酸和丙酮酸。琥珀酸的最大理論產(chǎn)率是I. 7ImoI mol—1葡萄糖，這些3-碳中間體代表著一個(gè)進(jìn)一步提高產(chǎn)率的機(jī)會(huì)。據(jù)推測(cè)，丙酮酸在糖酵解中累積形成代謝溢流，且可能與乙酸累積有關(guān)。乙酰輔酶A是多種酶的一種變構(gòu)調(diào)控蛋白。由于編碼乙酸激酶的兩種主要活性的基因(tdcD和ackA)已被刪除，乙酸和乙酸激酶活性的來源不清楚(圖9和圖10)。假定乙酸是由乙?；姿?acetyl P)生成的,所述的乙?；姿?acetyl P)是磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅漠a(chǎn)物，在KJ122中構(gòu)建進(jìn)一步的刪除使pta基因失活。生成的菌株KJ134生成接近理論水平的琥珀酸(表8)。所述菌株中，丙酮酸和乙酸的水平大大降低。體積產(chǎn)量也降低17%。不管發(fā)酵過程、培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件的復(fù)雜性，菌株KJ134獲得的琥珀酸產(chǎn)率與其他所有菌株相當(dāng)或者更好。
實(shí)施例3用于琥珀酸生產(chǎn)的糖異生PEP羧激酶(pck)的使用大腸桿菌具有四種天然羧化路徑的代謝潛力，所述羧化路徑被用于生產(chǎn)琥珀酸(圖2A-2D)。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)作用下羧化生成草酰乙酸(OAA)的羧化作用被認(rèn)為是E. coli中發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的主要路徑(圖2A)(Fraenkel DG 1996 ;Unden&Kleefeld, 2004 ;Karp 等，2007)。所述反應(yīng)本質(zhì)上是不可逆的，原因是無機(jī)磷酸鹽的釋放伴隨著能量損失。其他三種羧化反應(yīng)通常被培養(yǎng)基中高濃度葡萄糖阻遏，也有報(bào)道其在逆方向的糖異生中起作用(Samuelov等，1991 ;0h等，2002 ;Stols &Donnelly, 1997)。第二種和第三種羧化路徑(圖2B和2C)使用NADH-蘋果酸酶和NAPDH-蘋果酸酶(sfcA and和maeB)，分別催化由丙酮酸到蘋果酸的可逆的羧化作用。兩種路徑都允許在從PEP形成丙酮酸過程中，能量以ATP的形式儲(chǔ)存。第四種路徑使用PEP羧激酶(pck)催化由PEP到OAA的可逆的羧化反應(yīng)，其中能量以ATP的形式儲(chǔ)存(圖2D)。盡管PEP羧激酶(PCK)典型地僅在E. coli的糖異生過程中起作用，但在產(chǎn)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌中，一種類 似的PEP羧激酶以非常高的水平存在，其中它是作為主要的PEP羧化活性(Van der Werf等，1997)。大腸桿菌菌株KJ073通過兩種目標(biāo)基因的刪除和進(jìn)化進(jìn)行代謝改造以獲得高的生長(zhǎng)速率和琥拍酸生成(Jantama等,2008a)。編碼四種羧化酶(ppc, sfcA, maeB和pck)中的每一種的基因被分別刪除，以識(shí)別工程菌株KJ073中琥珀酸生產(chǎn)的主要路徑(表10)。天然E. coli(XZ320)中編碼主要羧化步驟的ppc基因的刪除不會(huì)改變琥珀酸生產(chǎn)。分別刪除編碼蘋果酸酶(sfcA和maeB)的基因以獲得XZ341和XZ396，對(duì)琥珀酸生產(chǎn)也沒有影響，這與它們?cè)谔钱惿械闹饕饔靡恢?。然而，刪除編碼PEP羧激酶的pck(XZ332)，戲劇性地減少了細(xì)胞生長(zhǎng)、糖代謝、琥珀酸生產(chǎn)和琥珀酸產(chǎn)率。菌株XZ332中缺失突變的互補(bǔ)物攜帶有來自菌株KJ073完整pck基因(質(zhì)粒pL0I4677)的，大大增加了琥珀酸生成，至接近KJ073(表 10)。同時(shí)，這些結(jié)果表明，糖異生的PEP羧激酶在代謝過程中被使用，作為KJ073中發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的主要羧化反應(yīng)。與PEP羧化酶不同(圖2A)，PEP羧激酶儲(chǔ)存能量供給額外的ATP (圖2D)。由于發(fā)酵生長(zhǎng)與ATP產(chǎn)生緊密關(guān)聯(lián)，PEP羧激酶作用下ATP產(chǎn)率的增加(圖2D)將在基于生長(zhǎng)的篩選中提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，所述基于生長(zhǎng)的篩選發(fā)生在生成菌株KJ073的代謝進(jìn)化步驟。PEP羧激酶活性增加與pck mRNA豐度的增加相關(guān)聯(lián)(表11 ;圖12A)。當(dāng)KJ073中的pck轉(zhuǎn)錄豐度相比于野生型有所增加時(shí)，其與增強(qiáng)的PEP羧激酶活性高度一致，而PPC，sfcA和maeB的轉(zhuǎn)錄水平基本沒有變化(表11)。對(duì)pck基因進(jìn)行的測(cè)序，顯示出與pck基因的編碼或終止子區(qū)域與KJ073沒有差另O。然而，在KJ073中的pck基因上游啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了單一位點(diǎn)突變(相對(duì)于ATG啟動(dòng)密碼子在-64位點(diǎn)G到A的置換)(表11)。所有六種菌株被測(cè)序以識(shí)別菌株改良過程中突變的由來。盡管在KJ017中PEP羧激酶活性比在KJ012中高3倍，但是不存在G到A的突變。KJ073菌株中pck基因啟動(dòng)子區(qū)域的點(diǎn)突變被稱為pck*突變(高PEP羧激酶活性)。所述pck*突變僅在表現(xiàn)出高PEP羧激酶活性的KJ060和KJ073菌株中存在，其在KJ071中不存在。KJ071中所述突變的缺失，伴隨著只相當(dāng)于KJ017相等水平的1/10的PEP羧激酶活性。KJ017和KJ071中引入pck*點(diǎn)突變(G到A)，PEP羧化酶活性增加了 8倍(表11)?；謴?fù)菌株KJ060和KJ073中的野生型pck基因(A到G)，分別得到菌株XZ622和XZ624。XZ622和XZ624均顯示PEP羧化酶活性降低至大約1/8 (表12)。結(jié)果表明，在KJ017生產(chǎn)KJ060的代謝進(jìn)化過程中發(fā)生的PCK活性增加，歸因于pck的單一核苷酸改變(相對(duì)于ATG起點(diǎn)-64位點(diǎn)的G變?yōu)锳)。KJ017中這種突變的缺失也暗示，在該菌株觀察到的PEP羧激酶活性起初增加到4倍，歸因于其它待定義的一種或多種變化。顯然，用于發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的天然糖異生的PCK的使用是由多種突變引起的，所述多種突變影響pck基因的轉(zhuǎn)錄。PEP羧激酶活力在由KJ012培育KJ017過程中增加了 3倍，這種增長(zhǎng)不是由pck基因突變引起的，可能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中的突變。Cra蛋白表現(xiàn)了對(duì)E. coli中pck表達(dá)的活化作用(Saier & Ramseier, 1996)。然而,在era基因或上游區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)突變。KJO17 (XZ626)和KJ060 (XZ627)中era的缺失不影響PEP羧激酶活性(表12)。
csrA系統(tǒng)也被報(bào)道可以通過改變mRNA穩(wěn)定性來調(diào)控pck和其他參與到葡萄糖代謝中的基因的水平(Pernestig等,2003)。然而,在所述調(diào)控系統(tǒng)(csrA, csrB, csrC, csrD,uvrY或barA)涉及的基因序列中沒有發(fā)現(xiàn)突變。大腸桿菌PEP羧激酶活性受到葡萄糖分解代謝物阻遏(Goldie 1984)。啟動(dòng)子中的兩個(gè)Crp-結(jié)合位點(diǎn)已被識(shí)別(Ramseier等人，1995)，所述位點(diǎn)距離KJ060和KJ073中的點(diǎn)突變非常遙遠(yuǎn)。與分解代謝物阻遏相關(guān)的基因(cyaA，crp)和與葡萄糖攝取相關(guān)的基因(ptsH, ptsl, err, ptsG)被測(cè)序(上游區(qū)域經(jīng)過終止子)，所述的葡萄糖攝取通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(ptsH，ptsl, err, ptsG)進(jìn)行。在菌株KJ060，KJ071，和KJ073中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變，即ptsl的C-端區(qū)域的移碼突變(在位點(diǎn)1，673的單堿基缺失)。由于KJ017不存在這種缺失，因此它不是所述菌株中PEP羧激酶活性起初增加3倍的原因(表12)。KJO17 (XZ613)和KJ060 (XZ615)中ptsl的缺失不影響PEP羧激酶活性。在含5%葡萄糖和不含5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 8739，KJ012，KJ017,和KJ060，進(jìn)一步研究pck的分解代謝物阻遏中的潛在變化(表3)。PEP羧激酶活性被報(bào)道在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期最大(Goldie，1984)，且已在我們的菌株中得到證實(shí)。在ATCC 8739和代謝進(jìn)化的起始菌株(KJ012)中，PEP羧激酶活性因葡萄糖的存在而受到嚴(yán)重阻遏(>70%)。葡萄糖介導(dǎo)的阻遏通過環(huán)腺苷酸(cyclic-AMP)的添加而解除。相比之下，KJ017中的PEP羧激酶活性是KJ012中的4倍且不受葡萄糖添加的影響，這表明分解代謝物阻遏的損失。KJ060中PEP羧激酶活性在葡萄糖不存在條件下的生長(zhǎng)期間甚至更高(是KJ017中的5倍)，當(dāng)加入葡萄糖時(shí)，酶活性進(jìn)一步增加。KJ060 (和KJ073)中，pck的葡萄糖分解代謝物阻遏已被葡萄糖活化取代(表13)。對(duì)所述菌株中的cyaA, crp, ptsG, ptsl和err的轉(zhuǎn)錄豐度進(jìn)行比較(圖12B和12C)。cyaA, crp，和ptsG在KJ017, KJ060, KJ071和KJ073中的轉(zhuǎn)錄普遍要比在KJO12和ATCC 8739中高。通過提高cyclic-AMP水平來提高這些蛋白的水平，使之能蓋住分解代謝物阻遏。這些突變體中分解代謝物阻遏的損失不會(huì)限制pck表達(dá)。ATCC 8739和KJ012在含葡萄糖的生長(zhǎng)期間，β_半乳糖苷酶活性減半(表13)。所述活性通常被葡萄糖阻遏，但在KJ017和KJ060中相對(duì)不受影響，這與Crp-介導(dǎo)的葡萄糖調(diào)控的整體損失一致。相對(duì)于葡萄糖抑制的親本ATCC 8739，KJ012和KJ017中的crp基因的缺失降低了生成的菌株(分別為XZ642和XZ643)中PEP羧激酶活性(表13)。在所述crp-缺失的菌株中，PEP羧激酶活力不受葡萄糖或cyclic AMP添加的影響。因此，Crp可能是KJ017及其派生物中觀察到的pck表達(dá)增加3倍的一種基本調(diào)節(jié)元素。Crp-介導(dǎo)的Pck表達(dá)增加3倍及與上游pck突變相關(guān)的表達(dá)增加10倍能夠解釋KJ060和KJ073培育過程中觀察到的PEP羧激酶活性水平的改變。與腺苷-3'，5'-環(huán)化一磷酸(cAMP-CRP)調(diào)控有關(guān)的其他基因也被測(cè)序(表13),如預(yù)測(cè)的腺苷酸環(huán)化酶ygiF, Crp sxy的轉(zhuǎn)錄輔激活因子,cAMP磷酸二酯酶cpdA糖代謝的全局性調(diào)控因子 mlc (Keseler 等,2005 ；Cameron & Redfield, 2006 ;Imamura 等，1996 ；Plumbridge, 2002)。然而，在這些與cAMP-CRP調(diào)控有關(guān)的基因的上游、編碼或終止子區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)任何突變?；騪tsl編碼PEP-蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶，所述PEP-蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶是磷酸烯醇式丙酮酸依賴性糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的基本(非糖特異性的)的組分。這種主要的糖主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)催化進(jìn)入的糖底物的磷酸化，同時(shí)伴隨著它們橫跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移。PEP-蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶從磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)移磷?；亮柞；d體蛋白(HPr)(參見，例如UniProtKB，序 列號(hào) P08839)。在ptsl中發(fā)現(xiàn)一個(gè)移碼突變(1673bp位置的單堿基對(duì)缺失)，該移碼突變發(fā)生在從KJ017到KJ060的代謝進(jìn)化過程中。為研究所述突變的意義，在KJ017和KJ060中刪除PtsI的C端175bp，分別生成XZ613和XZ615。正如預(yù)期的，KJ060(XZ615)中ptsl的缺失對(duì)生長(zhǎng)和PEP羧激酶活性沒有影響。刪除KJ017中ptsl的C端生成XZ613，導(dǎo)致了 XZ613不能在含葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這與葡萄糖主要攝取系統(tǒng)(PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng))的缺失一致。培養(yǎng)若干天后，XZ613的培養(yǎng)物開始生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)物被推測(cè)為具有活化的可供選擇的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的派生物(Karp等，2007)。KJ060,KJ071和KJ073中發(fā)現(xiàn)的ptsl突變有望使葡萄糖的PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)失活?？晒┻x擇的葡萄糖攝取系統(tǒng)(例如GalP)已經(jīng)顯示出在pts突變中能恢復(fù)葡萄糖攝取(Wang等，2006 ;Yi等，2003)。與KJ012和ATCC 8739相比，所述改良菌株(圖12B)中g(shù)alP的表達(dá)增加了 4-19倍，同時(shí)葡萄糖激酶(glk)少量增加。用一種功能性野生型基因(XZ616)替換KJ060中的突變ptsl基因是不利的，顯著地減少了 KJ060在NBS-葡萄糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。所述不利影響可能是由PEP的消耗引起的，所述的PEP是野生型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)所需要的底物。功能性的PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將與PEP羧激酶競(jìng)爭(zhēng)，減少了氧化還原平衡、ATP生產(chǎn)和琥珀酸生產(chǎn)可獲得的PEP池。因此，如果有現(xiàn)成可使用的可供選擇的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如GalP (和葡萄糖激酶)，那么葡萄糖的PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的缺失可被看作菌株培育過程中的有益事件。PEP結(jié)點(diǎn)中碳通量用于限制在葡萄糖厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的用于氧化還原平衡的琥珀酸的量(圖13)。此外，這些通量必須提供足夠的能量(ATP)用于生長(zhǎng)、維持及前體的生物合成。以琥珀酸作為主要產(chǎn)物的瘤胃細(xì)菌，使用能儲(chǔ)存能量的PEP羧激酶生產(chǎn)OAA產(chǎn)物(圖2D) (Van der Werf等，1997 ;Kim等，2004)。大腸桿菌的天然菌株生產(chǎn)琥珀酸作為副產(chǎn)物，并使用PEP羧化酶(ppc)(圖2A)。與PEP羧激酶不同，PEP羧化酶本質(zhì)上是不可逆的，原因是能量損失與無機(jī)磷酸鹽的釋放相關(guān)。先前的研究表明，大腸桿菌中天然PPC基因的過量表達(dá)導(dǎo)致更高的特異性琥珀酸生產(chǎn)(Millard等，1996)，和更高的特異性生長(zhǎng)速率，原因是PEP羧化生成草酰乙酸的增加(Farmer & Liao, 1997)。然而，由于天然葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)需要PEP，因此過量表達(dá)ppc也降低葡萄糖攝取速率，并沒有顯著增加琥珀酸產(chǎn)率(Chao& Liao, 1993 ;Gokarn等,2000)。天然磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在增加琥拍酸產(chǎn)率上的失敗將大部分的研究注意力轉(zhuǎn)移到新的代謝設(shè)計(jì)上，即使來自乳酸菌桿菌(Lactobacilluslactis)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶過量表達(dá)作為羧化步驟(Vemuri等，2002ab ；Gokarn 等，2000 ；Lin 等，2005a, 2005b, 2005c)，以及使來自 Actinobacillussuccinogenes的PEP羧激酶過量表達(dá)用于工業(yè)生物催化劑的開發(fā)(Kim等,2004),而不是繼續(xù)從事對(duì)于大腸桿菌基因的天然譜型的進(jìn)一步的研究。天然大腸桿菌有三種可供選擇的羧化路徑(圖2B-2D)，所述路徑典型地僅在反方向的糖異生中起作用(Samuelov 等，1991 ;Kao 等，2005 ;0h 等，2002 ;Stols & Donnelly,1997)。所有3種路徑都能以ATP的形式儲(chǔ)存來自PEP的能量。琥珀酸作為NADH氧化的獨(dú)有路線，基于生長(zhǎng)的選擇(代謝進(jìn)化)導(dǎo)致獲得菌株耵017，耵060，耵071，和耵073，這些菌株在生長(zhǎng)(細(xì)胞產(chǎn)率)和琥珀酸生產(chǎn)上都有改進(jìn)。在KJ017，KJ060, KJ071，和KJ073這些菌株中，糖異生的PEP羧激酶(pck)通過轉(zhuǎn)錄激活被用作主要的羧化活力。PEP羧激酶作 為E. coli生產(chǎn)琥珀酸的主要路徑的應(yīng)用是出人意料的。許多研究已經(jīng)顯示大腸桿菌pck的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)琥珀酸生產(chǎn)沒有影響(Gokarn，等，2001 ；Vemuri等，2002 ;Millard等，1996 ；Gokarn等,2000 ;Hong & Lee, 2001)。最近的研究證明大腸桿菌pck的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)是有害的，降低了生長(zhǎng)速率、葡萄糖代謝速率及琥珀酸產(chǎn)率(Kwon等，2008)。pck在大腸桿菌中表達(dá)的增強(qiáng)導(dǎo)致流入4-碳中間體OAA用于琥珀酸生產(chǎn)(氧化還原平衡)的碳流增加，琥珀酸生產(chǎn)增加，且用于生長(zhǎng)和維持的ATP凈產(chǎn)量增加。至少有3件事情歸功于Pck轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)l)Crp-介導(dǎo)的葡萄糖阻遏的缺失；2)葡萄糖激活的獲得；和3)pck上游區(qū)域單堿基改變。通過提高PEP羧激酶水平、增加碳進(jìn)入琥珀酸的流動(dòng)以及增加代謝能量ATP的儲(chǔ)存，上述3件事情中的任意一件都提供了通過代謝進(jìn)化選擇的基礎(chǔ)。所述基因事件的聯(lián)合作用，結(jié)果是在KJ060和KJ073中獲得了高水平的PEP羧激酶(> 7000U (mg蛋白Γ1)，所述水平與瘤胃細(xì)菌相當(dāng)，所述瘤胃細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化成把生產(chǎn)琥珀酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物(Vanderfferf 等，.1997)。菌株KJ060，KJ071，和KJ073中發(fā)現(xiàn)了其他的儲(chǔ)存能量的變化，所述變化可能有助于PEP羧激酶作為發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的主要路線的應(yīng)用。PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是大腸桿菌天然菌株中主要的葡萄糖攝取系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，葡萄糖產(chǎn)生的PEP的一半被用于攝取和磷酸化，限制用于氧化還原平衡和ATP生產(chǎn)的代謝選項(xiàng)。改良的菌株在ptsl中包含一個(gè)移碼突變，使得這種攝取系統(tǒng)失活。編碼質(zhì)子同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的galP的表達(dá)增強(qiáng)直至達(dá)到20倍，所述質(zhì)子同向共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。GalP的表達(dá)增強(qiáng)和天然葡糖激酶通過使用ATP而非PEP進(jìn)行磷酸化作用，可以功能性取代葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Wang等，2006 ；Yi等，2003 ；Flores等，2007)。這種交換涉及一種節(jié)能的提高PEP池大小的方法，所述PEP可用于羧化作用和使用琥珀酸的氧化還原平衡(圖11)。所有改良菌株引導(dǎo)超過一半的葡萄糖碳進(jìn)入4-碳產(chǎn)物(蘋果酸加琥珀酸)，并需要超過一半的PEP用于氧化還原平衡。丙酮酸在ATP作用下能夠轉(zhuǎn)化為PEP，同時(shí)形成PPi和AMP，但該過程浪費(fèi)能量。因此，PtsI突變和galP表達(dá)提高了葡萄糖代謝生成琥珀酸的能量效率，在代謝進(jìn)化過程中提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。
消除除琥珀酸外的其他NADH氧化路線，連同用于選擇生長(zhǎng)上的改進(jìn)的代謝進(jìn)化一起獲得了產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌菌株，所述菌株在功能上等同于產(chǎn)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌，如Actinobacillus succinogenes和Mannheimia succiniciproducens (VanderWerf 等，1997 ；Kim等，2007 ；Martin, 1994 ;McKinlay等，2008)。OAA是利用儲(chǔ)存能量的PEP羧激酶生產(chǎn)的。通過使用葡萄糖透性酶(和葡糖激酶)而非PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)攝取葡萄糖，PEP得以保存，從而消除了對(duì)于耗能再生(2-ATP當(dāng)量)的需求。值得注意的是，瘤胃細(xì)菌生產(chǎn)其他發(fā)酵產(chǎn)物中，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)廣泛被用于葡萄糖攝取(Martin，1994)。最有前景的生產(chǎn)琥珀酸的E. coli菌株，KJ060和KJ073，生成大約700mM的琥珀酸，產(chǎn)率為每摩爾葡萄糖產(chǎn)I. 2mol琥拍酸(Jantama等,2008a),與最好的天然產(chǎn)琥拍酸的瘤胃細(xì)菌ActinobaciIIussuccinogenes 相當(dāng)(Guettler 等，US5, 505, 004)。能改進(jìn)葡萄糖在大腸桿菌中的琥珀酸生產(chǎn)的能量?jī)?chǔ)存策略也能被應(yīng)用于解決菌株設(shè)計(jì)中的其他重要問題。由于全球性的生物柴油產(chǎn)品的增加，甘油正在成為一種廉價(jià)原料。與葡萄糖相比，甘油更加簡(jiǎn)化，每分子甘油能夠轉(zhuǎn)化為琥珀酸并維持氧化還原平衡。然而，在使用天然耗能羧化活性(即PEP羧化酶)的甘油代謝生成琥珀酸的過程中，不能生成凈ATP。該問題能夠通過使用節(jié)能的PEP羧激酶而得以解決，并允許每分子琥珀酸凈形 成I分子ATP。此外，羧化產(chǎn)物OAA是細(xì)胞代謝中的一種重要中間體，所述OAA是許多其他重要發(fā)酵產(chǎn)物的前體，如蘋果酸、延胡索酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸，蛋氨酸，除了別的之夕卜。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠領(lǐng)會(huì)此處解釋的能量保存策略能用于開發(fā)和改進(jìn)用于許多工業(yè)上的重要化學(xué)品生產(chǎn)的生物催化劑。實(shí)施例4重新設(shè)計(jì)大腸桿菌用于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸本研究所使用的菌株列于表16。各種菌株的構(gòu)建過程中所用的質(zhì)粒和引物列在表15，所述的菌株是在本發(fā)明過程中培育的。大腸桿菌中混合酸路徑的考察表明三條主要的NADH氧化路線生成琥珀酸，乳酸和乙醇(圖14)。刪除基因能消除這些競(jìng)爭(zhēng)性的NADH氧化路線，但這不足以引導(dǎo)碳流入琥珀酸(表16)。在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的發(fā)酵過程中，與親本菌株(ATCC 8739)相比，除了adhE刪除后琥珀酸有少量增長(zhǎng)外，這些基因的單個(gè)刪除降低了琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)率影響很小。兩種可選擇的NADH氧化路徑(IdhA和adhE或IdhA和pflB)的刪除，大大降低了在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)、琥珀酸產(chǎn)率和琥珀酸產(chǎn)量。在LB培養(yǎng)基上觀察到非常不同的結(jié)果(表16)。在包含IdhA(單獨(dú)或結(jié)合)刪除的所有菌株中，發(fā)現(xiàn)琥珀酸產(chǎn)率適度提高。此外，在雙突變或三突變體中，生長(zhǎng)減慢。這些刪除都不足以重新引導(dǎo)大量葡萄糖碳進(jìn)入琥珀酸，不管在無機(jī)鹽培養(yǎng)基還是在天然培養(yǎng)基中。在大腸桿菌中天然混合酸路徑的觀察分析的基礎(chǔ)上，為琥珀酸生產(chǎn)構(gòu)建的刪除菌株在天然培養(yǎng)基中比預(yù)期的少產(chǎn)，在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中是不成功。我們先前的研究(Jantama等,2008a ; Jantama等,2008b)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)啟動(dòng)子突變(相對(duì)于ATG起點(diǎn)-64處G到A ;表示為pck*)，所述突變?cè)黾恿肆姿嵯┐际奖狒燃っ?PCK)活性，并增加了在多種其他突變存在下由葡萄糖到琥珀酸的生產(chǎn)。這是令人意外的，因?yàn)閜ck典型地被葡萄糖阻遏(Goldie，1984)，并顯示出主要在有機(jī)酸有氧代謝過程中的糖異生中起作用(Kao 等，2005 ；Keseler 等，2005 ；0h 等· 2002 ；Unden &Kleefeld, 2004 ；Wu等，2007)。為了進(jìn)一步考察這種基因，擴(kuò)增得到pck基因(核糖體結(jié)合位點(diǎn)，編碼和終止子區(qū)域)并將其克隆至pCR2. I-TOPO以生產(chǎn)pLOI4677，在Iac啟動(dòng)子控制下表達(dá)pck。所述質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入ATCC 8739。另外，ATCC 8739中的天然pck基因被突變pck*基因替換以構(gòu)建XZ632。使用NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基在兩種菌株中檢測(cè)葡萄糖發(fā)酵。與包含天然pck基因的同基因菌株相比，引入pck*導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)率和產(chǎn)量的適度增加(表16)。發(fā)現(xiàn)在IPTG-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的作用下XZ632菌株和具有一個(gè)含有pck*基因的質(zhì)粒的親本菌株中的PCK活性均比在親本菌株中增加超過7倍。依靠染色體整合，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子作用下，單拷貝pck*與含pck*基因的多拷貝質(zhì)粒對(duì)PCK生產(chǎn)幾乎一樣有效。與親本ATCC 8739菌株相比，觀察到兩種含提高的PCK活性的菌株在琥珀酸產(chǎn)率和產(chǎn)量上都有適度改進(jìn)(表17)。然而，僅僅增加PCK活性不足以使葡萄糖碳轉(zhuǎn)向琥珀酸。對(duì)pck*突變與其他突變的結(jié)合進(jìn)行試驗(yàn)，可消除NADH氧化路徑(表18)。多個(gè)突變對(duì)于消除NADH氧化的競(jìng)爭(zhēng)路線和PCK活性的增加的聯(lián)合作用，仍然不足以本質(zhì)上使葡萄 糖碳轉(zhuǎn)向琥拍酸。磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是大腸桿菌中葡萄糖攝取的主要機(jī)制，及葡萄糖分解代謝物阻遏系統(tǒng)不可或缺的組成部分(Keseler等,2005 ；Postma等，1996)。如實(shí)施例3所描述，在代謝進(jìn)化獲得的琥珀酸生產(chǎn)菌株KJ060，KJ071和KJ073中發(fā)現(xiàn)ptsl的C端有一移碼突變(在1673bp位置的單一堿基對(duì)缺失)。所述突變有望能破壞磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的功能(Postma等，1996)。在所述突變體中，葡萄糖攝取被galP (半乳糖透性酶)和 glk(葡萄糖激酶)功能性取代(Hernandez-Montalvo 等,2003 ；Keseler 等,2005)。為了研究PtsI破壞作用對(duì)于琥珀酸生產(chǎn)的影響，刪除野生型E. coli ATCC 8739的ptsl的C端175bp以獲得菌株XZ650。令人意外地，由于這個(gè)突變，琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率相比于親本降低了(表18)。采用兩種方法研究將ptsl截短和高水平的PCK結(jié)合的效果，所述的兩種方法是使用pck*突變或從Iac啟動(dòng)子(質(zhì)粒pL0I4677)過量表達(dá)天然pck。在與ptsl截短的結(jié)合中，兩種方法都在琥珀酸生產(chǎn)上獲得了戲劇性增加(表18)。菌株XZ647(pck*，AptsI)在含5%葡萄糖的NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中產(chǎn)生216mmol琥珀酸，產(chǎn)率為每摩爾葡萄糖產(chǎn)O. 89mol琥珀酸，比野生型 Ε· coli ATCC 8739 高 3. 7 倍(表 18)。在 XZ647 和 XZ650 (pL0I4677)中，甲酸，乙醇和少量乳酸以副產(chǎn)物殘存。磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的失活和PCK活性水平的提高這兩種改變代表了在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中使葡萄糖代謝有效轉(zhuǎn)向琥珀酸生產(chǎn)所要求的核心改變，所述核心改變沒有對(duì)與發(fā)酵氧化還原平衡直接相關(guān)的任何基因進(jìn)行修飾。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在pck*背景下的多種突變可以增加琥珀酸。對(duì)葡萄糖的PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的任意步驟的破壞都能增加碳流入琥珀酸，增加效價(jià)和產(chǎn)率。PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)將磷酸從PEP運(yùn)送到PtsI，然后到PtsH，然后到PtsG，然后到葡萄糖形成6-磷酸-葡萄糖。表19顯示在含有能提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶水平的pck*突變的菌株中，在參與到這個(gè)磷酸傳遞系統(tǒng)的Pts基因(ptsl, ptsH或ptsG)中的任意一個(gè)基因中發(fā)生了另一種突變，所述的另一種突變導(dǎo)致了相似的戲劇性的轉(zhuǎn)移，即碳流流入琥珀酸作為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。就這點(diǎn)而言，整個(gè)PtsI基因的缺失或ptsl基因C端的截短都優(yōu)于PtsG和ptsH缺失。ptsl基因C端的截短產(chǎn)生最高產(chǎn)率和效價(jià)的琥珀酸，稍好于PtsI的完全缺失。其他能獲得不活潑基因產(chǎn)物的突變，如插入、刪除和移碼突變，都有望產(chǎn)生相似效果。盡管菌株XZ647 (pck* Δ ptsl)生產(chǎn)琥珀酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物，但是也生成顯著水平的不需要的聯(lián)產(chǎn)物(乳酸，乙醇，甲酸和乙酸)(表18)。adhE(XZ723)或pflB(XZ721)的缺失消除了乙醇的生產(chǎn)。乙酸和甲酸生產(chǎn)只有通過PflB缺失才能大大減少或消除。生成的菌株(XZ721)生產(chǎn)出高水平的琥珀酸，每摩爾葡萄糖生成超過I. 2mol的琥珀酸。琥珀酸典型代表大腸桿菌中葡萄糖發(fā)酵的副產(chǎn)物。利用可供選擇的NADH氧化路徑，大部分的葡萄糖碳被轉(zhuǎn)化為乙醇和乳酸，較少量轉(zhuǎn)化為甲酸和乙酸(圖14)。在超過10年的時(shí)間里，已經(jīng)構(gòu)建了許多大腸桿菌派生物以提高琥珀酸生產(chǎn)，獲得了不同程度的成功(Donnelly 等，U. S. Pat. No. 5, 770, 435 ；Gokarn 等，2000 ；Gokarn 等，U. S. Pat.No. 6，455，284 ；Millard 等，1996 ；San 等，U. S. Pat. No. 7，223，567 ；Sanchez 等，2005b ；Sanchez 等，2005a ;Stols & Donnelly, 1997 ;Vemuri 等，2002a ;Wu 等，2007)。用于構(gòu)建所述菌株的策略典型地集中在消除用于NADH氧化的競(jìng)爭(zhēng)性路徑(Donnelly等，U. S. Pat. No. 5，770，435 ；Gokarn 等，U. S. Pat. No. 6，455，284 ；San 等，U. S. Pat. No. 7，223，567 ；Sanchez 等，2005b ；Sanchez 等.2005a ；Vemuri 等.，2002a ；ffu 等，2007)。用于刪除的目標(biāo)基因的篩選主要是基于路徑的考察(圖14)。然而，所述策略的成功局限于天然培養(yǎng)基和兩步過程(有氧生長(zhǎng)階段和隨后的厭氧生產(chǎn)階段)(Donnelly等，U. S 5，770，435 ；Gokarn等，U. S6, 455，284 ；Millard 等，1996 ；San 等，U. S7, 223，567 ；Sanchez 等，2005b ；Sanchez 等，2005a ；Vemuri 等，2002a ；ffu 等，2007)。在天然培養(yǎng)基中(如LB培養(yǎng)基)，生長(zhǎng)需要的大部分生物合成的物質(zhì)由營(yíng)養(yǎng)物中(酵母提取物和胰蛋白胨)的中間體和砌塊分子提供。在所述培養(yǎng)基中，基于對(duì)發(fā)酵路徑的觀察的基因缺失本身通常能夠改進(jìn)琥珀酸生產(chǎn)(圖14和表16)。(IdhA)和包含IdhA的目標(biāo)基因的所有結(jié)合的缺失，導(dǎo)致在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵期間，每分子葡萄糖的琥珀酸產(chǎn)率和產(chǎn)量增加(表16)。然而，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基如NBS或AMl培養(yǎng)基中，混合酸發(fā)酵路徑中相同目標(biāo)基因的缺失是沒有幫助的。大部分的缺失對(duì)于琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率兩者都是有害的。在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，除了 adhE缺失后有少量增長(zhǎng)外，混合酸發(fā)酵路徑中單基因缺失和聯(lián)合基因缺失都降低了琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率(表17)。KJ012(ATCC 8739 Λ IdhA AadhE Δ ackA)是一種專利菌株的基因等價(jià)物，所述專利菌株用于在天然培養(yǎng)基中兩步(好氧生長(zhǎng)階段，隨后厭氧生產(chǎn)階段)生產(chǎn)琥珀酸(San 等，U. S7, 223，567)，KJO12 (ATCC 8739 Δ IdhA Δ adhE Δ ackA)相比于野生型親本菌株在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生成的琥珀酸較少。在這些結(jié)論的基礎(chǔ)上，我們總結(jié)出在路徑觀察基礎(chǔ)上做出的對(duì)缺失的目標(biāo)基因的合理選擇不能可靠地實(shí)現(xiàn)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中琥珀酸生產(chǎn)的改進(jìn)。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，碳必須在能量產(chǎn)生、發(fā)酵和細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的砌塊分子的生物合成之間精確地分配。上述結(jié)果表明本發(fā)明提供了一種構(gòu)建菌株的新策略，所述菌株用于在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸。不需要為了引導(dǎo)大量葡萄糖碳流入琥珀酸而在編碼大腸桿菌混合酸發(fā)酵路徑(圖14)的基因中發(fā)生突變。本發(fā)明中，次要路徑中兩種核心改變的結(jié)合導(dǎo)致琥珀酸產(chǎn)率增加4倍。所述琥珀酸生產(chǎn)所需要的兩種核心改變?yōu)?)表達(dá)增強(qiáng)的儲(chǔ)存能量的(糖異生的)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，取代天然發(fā)酵磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(耗能的)；和
2)可選擇的透性酶，如galP和ATP依賴性磷酸化作用(glk)，取代葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。同時(shí)，所述改變?cè)黾恿擞糜谏L(zhǎng)的凈ATP生產(chǎn)，增加了可用于羧化的磷酸烯醇式丙酮酸池，且增加了琥珀酸生產(chǎn)?；旌纤岚l(fā)酵路徑中基因的其他突變，如pflB的缺失和其它，代表進(jìn)一步適度增加琥珀酸產(chǎn)率和產(chǎn)量的機(jī)會(huì)。值得注意的是，所述乙酰輔酶A是生物合成的一種基本代謝物，它主要是由PflB在發(fā)酵生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生。據(jù)推測(cè)，所述功能在PflB突變體中被丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(aceEF，lpd)的天然表達(dá)所取代，所述丙酮酸脫氫酶復(fù)合物是一種在氧化代謝過程中典型地用于乙酰輔酶A生產(chǎn)的主要路線的酶(Kim等.，2007)。用于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸的最優(yōu)設(shè)計(jì)的大腸桿菌菌株中獲得的琥珀酸路徑(圖14)在功能上與產(chǎn)琥珀酸瘤胃細(xì)菌中進(jìn)化形成的天然路徑相似(Kim等,2004 ;Lee等,2002 ;Lee等,2006 ；SamueIov等.，1991 ；Vanderfferf 等，1997)。
實(shí)施例5甘油產(chǎn)琥珀酸盡管甘油和葡萄糖氧化還原性能和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同，但我們發(fā)現(xiàn)能夠在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中促使葡萄糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸的相同突變，也能被用于有效引導(dǎo)甘油代謝生成琥珀酸，達(dá)到甘油轉(zhuǎn)化為琥珀酸的最大效率為80% (消耗每摩爾甘油產(chǎn)O. Smol琥珀酸)。在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)先前被認(rèn)為隱秘的gldA和PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶路徑，包含一個(gè)重要的甘油分解代謝的功能性路線(圖15)。在所述兩種路線中，甘油通過便利的擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，部分甘油被立即磷酸化，然后氧化生成DHAP，該路徑被廣泛認(rèn)為是大腸桿菌中甘油代謝的標(biāo)準(zhǔn)路徑。我們發(fā)現(xiàn)至少1/3的甘油首先利用gldA還原成DHA，隨后被作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(ptsH，ptsl)磷酸化生成DHAP。所述DHAP用作攝取和活化系統(tǒng)的中心代謝的共同進(jìn)入點(diǎn)。表20清楚顯示了將核心突變組合用于無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NBS)中由甘油生產(chǎn)琥珀酸的有效性，所述的核心突變?cè)谟善咸烟巧a(chǎn)琥珀酸中被識(shí)別出，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基沒有添加天然營(yíng)養(yǎng)物。盡管PflB的單獨(dú)缺失會(huì)降低琥珀酸生產(chǎn)，使其低于野生型親本，但是PflB缺失和pck (pck* ;轉(zhuǎn)錄激活)中啟動(dòng)子突變的組合會(huì)使琥珀酸產(chǎn)率加倍，使其從O. 25mol/mol甘油增加到O. 5mol/mol甘油。隨后在ptsl中增加一個(gè)突變，會(huì)進(jìn)一步提高琥珀酸產(chǎn)率至O. 8mol琥珀酸/mol甘油，為最大理論產(chǎn)率的80%。其他關(guān)鍵基因(gldA，ptsH, ptsl,dhaKL，dhaM)的缺失也獲得了類似結(jié)果，所述關(guān)鍵基因破壞用于磷酸化的磷酸根中繼系統(tǒng)(phosphorelay system)的使用(表20)。這些結(jié)果是出乎意料的。甘油轉(zhuǎn)化的結(jié)果路徑如圖15所示。圖15顯示了野生型大腸桿菌中普遍接受的甘油分解代謝路徑(Lin，1996)與混合酸發(fā)酵路徑(Bock和Sawers，1996)的結(jié)合。在所述路徑中，如果琥珀酸作為生成的唯一產(chǎn)物，那么產(chǎn)生的所有ATP將被甘油磷酸化作用所消耗。沒有ATP是生長(zhǎng)可利用的。在圖15的基礎(chǔ)上，預(yù)期PflB的缺失通過增加還原劑和中間體的可用性而增加琥珀酸生產(chǎn)。與這種預(yù)期相對(duì)照，觀察到PflB的缺失降低了琥珀酸生產(chǎn)(表20)。在所述路徑基礎(chǔ)上，可以預(yù)期pck基因突變的活化能通過與丙酮酸激酶競(jìng)爭(zhēng)增加磷酸烯醇式丙酮酸流入琥珀酸，這種預(yù)期僅僅是基于本申請(qǐng)先前的觀察，即PCK表達(dá)增強(qiáng)有利于糖發(fā)酵生成琥珀酸，否則將不可預(yù)期，所述PCk基因通常僅在糖異生過程起作用。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCk)取代磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的使用具有額外的優(yōu)勢(shì)，即將來自磷酸烯醇式丙酮酸的能量以額外的ATP的形式儲(chǔ)存，所述ATP能用于生物合成。盡管ptsl中的突變有利于碳從葡萄糖轉(zhuǎn)移至琥珀酸，但是不可能預(yù)測(cè)這對(duì)于碳從甘油轉(zhuǎn)移至琥珀酸有任何好處，因?yàn)榻?jīng)確認(rèn)在野生型大腸桿菌中唯一起作用的甘油攝取系統(tǒng)(glpF)不涉及磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Keseler等,2005 ；Lin, 1996.)。僅知的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在甘油代謝中的參與是一個(gè)次要路徑，所述次要路徑被認(rèn)為在野生型大腸桿菌中是不運(yùn)行的(Jin等，1983 ；Lin, 1996 ；Tang等，1982)。所述次要路徑首先利用GldA還原細(xì)胞內(nèi)甘油生成二羥基丙酮(DHA)，然后使用PtsH(ptsH)和EI (ptsl)作為磷酸載體，將磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)DHA的磷酸化以生產(chǎn)二羥基丙酮-磷酸(DHAP)。所述路徑被認(rèn)為僅在glpK失活的突變菌株中起作用(Gutknecht等,2001 ;Keseler等，
2005)。與以普遍接受的甘油代謝路徑為基礎(chǔ)的所有預(yù)期相反，ptsl突變顯著增加了甘油產(chǎn) 琥珀酸的量。這些結(jié)果表明，甘油脫氫酶(gldA)和PTS磷酸根中繼系統(tǒng)(磷酸烯醇式丙酮酸，PtsH，PtsI)對(duì)于在NBS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中甘油厭氧發(fā)酵的過程中甘油分解代謝生成二羥基丙酮-磷酸(DHAP)具有預(yù)料不到的重要性。在琥珀酸產(chǎn)率大量增加的基礎(chǔ)上，估計(jì)所述二羥基丙酮(DHA)路徑能引起至少1/3甘油通量流入糖酵解。ptsl的刪除使所述路徑不起作用，增加可用于琥珀酸生產(chǎn)的磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)琥珀酸。同時(shí)，這三種核心突變(pck*，PtsLpflB)有效地且意外地在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵過程中引導(dǎo)碳從甘油流向琥珀酸，產(chǎn)率為最大理論產(chǎn)率的80% (圖15)。此外，所述路徑的使用導(dǎo)致ATP產(chǎn)量大大增長(zhǎng)，促進(jìn)生長(zhǎng)。；
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌細(xì)胞，所述細(xì)胞包含水平增高的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCk)基因轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物編碼活性磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)，其中所述細(xì)胞表現(xiàn)出PCK活性增強(qiáng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為非反芻動(dòng)物細(xì)菌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株，其中所述的細(xì)菌為 大腸桿菌(Escherichia coli)，氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)，淺井氏葡糖桿菌(Gluconobacter asaii)，帶馬瓦無色桿菌(Achromobacter delmarvae)，粘液無色桿菌(Achromobacter viscosus)，乳無色桿菌(Achromobacter Iacticum)，根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，放身寸形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)，類產(chǎn)減桿菌(Alcaligenes faecalis)，梓樣節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)，腫脹節(jié)桿菌(Arthrobacter tumescens)，石錯(cuò)節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus)，裂徑谷氨酸節(jié)桿菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)，氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans),天牛短小桿菌(Aureobacterium saperdae)，印度固氮菌(Azotobacter indicus)，產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)，叉分短桿菌(divaricatum)，乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)，球形短桿菌(Brevibacterium globosum)，暗褐短桿菌(Brevibacterium fuscum)，酮戊二酸短桿菌(Brevibacterium ketoglutamicum)，創(chuàng)傷短桿菌(Brevibacterium helcolum)，極小短桿菌(Brevibacterium pusillum)，磚紅色短桿菌(Brevibacterium testaceum)，玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)， (Brevibacterium immariophilium)，擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)，Brevibacterium protopharmiae，嗜乙酉先棒桿菌(Corynebacterium acetophilum)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，帚石南棒桿菌(Corynebacterium calIunae)，嗜乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，解淀粉桿菌(Erwinia amylovora)，胡蘿卜軟腐桿菌(Erwiniacarotovora)，草生假單胞菌(Erwinia herbicola)，菊果膠桿菌(Erwinia chrysanthemi),奇異黃桿菌(Flavobacterium peregrinum)，F(xiàn)lavobacterium fucatum，禮黃色黃桿菌(Flavobacterium aurantinum)，萊茵黃桿菌(Flavobacterium rhenanum)，塞沃尼黃桿菌(Flavobacterium sewanense)，短黃桿菌(Flavobacterium breve)，腦膜炎黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)，微球菌 CCM825 (Micrococcus sp. CCM825)，摩氏摩根菌(Morganella morganii)，灰暗諾卡氏菌(Nocardia opaca)，粗糖諾卡氏菌(Nocardiarugosa)，(Planococcus eucinatus)，雷特洛變形桿菌(Proteus rettgeri)，謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)，產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)，產(chǎn)氮假單胞菌(Pseudomonas azotoformans)，焚光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)，卵狀假單胞菌(Pseudomonas ovalis)，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovolans)，霉味假單胞菌(Pseudomonas mucidolens)，睪丸酮假單胞菌(Pseudomonas testosteroni)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)，紅球菌ATCC 15592 (Rhodococcus sp. ATCC 15592)，紅球菌 ATCC 19070 (Rhodococcus sp. ATCC19070)，服芽抱八疊球菌(Sporosarcina ureae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii),干酪弧菌(Vibrio tyrogenes),馬杜拉放線菌(Actinomadura madurae),圖列茨鏈霉菌(Actinomyces violaceochromogenes),丘疫性北里抱菌(Kitasatosporia parulosa),天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces coelicolor),淡黃色鏈霉菌(Streptomyces fIavelus),淺灰鏈霉菌(Streptomycesgriseolus),變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans),撤攬色鏈霉菌(Streptomyces olivaceus),田無鏈霉菌(Streptomyces tanashiensis)，弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)，抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus),可可鏈霉菌(Streptomyces cacaoi),淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces Iavendulae)，產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes),殺鮭氣單抱菌(Aeromonas salmonicida),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis),地衣芽 抱桿菌(Bacillus licheniformis)，角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliqyefaciens), 凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans),溶硫胺芽抱桿菌(Bacillus thiaminoliticus),弗羅思特桿菌(Escherichiafreundii)，嗜氨微桿桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens),鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium),乙型副傷寒桿菌 (Salmonella schottmulleri)，柑桔黃單抱菌(Xanthomonas citri)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的pck轉(zhuǎn)錄物的水平增高是因?yàn)橛胮ck基因的改變的調(diào)控序列替換天然調(diào)控序列，所述Pck基因的改變的調(diào)控序列增強(qiáng)了 pck轉(zhuǎn)錄。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的調(diào)控序列是在所述pck基因的啟動(dòng)子區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的pck轉(zhuǎn)錄物的水平增高是因?yàn)閜ck基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的一種或多種突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的一種或多種突變是點(diǎn)突變，所述的點(diǎn)突變包括在pck基因起始密碼子的上游68位點(diǎn)處，用核苷酸G替換核苷酸A。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的pck轉(zhuǎn)錄物水平的增高是因?yàn)橛靡粋€(gè)外源啟動(dòng)子序列替換天然啟動(dòng)子序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的外源啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的外源啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含一種或多種基因修飾，所述的基因修飾破壞PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的功能。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的基因修飾是在編碼PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組分的一種或多種基因中。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的基因修飾是在編碼蛋白的一種或多種基因中，所述的蛋白調(diào)控PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的基因修飾是在一種或多種基因中，所述基因選自由ptsG, ptsH, ptsl, err和crp組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)—種或多種基因修飾，所述的基因修飾破壞PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的功能；(b) —種或多種基因修飾，所述的基因修飾上調(diào)一種或多種編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員之一。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是主要易化子超家族的成員之一。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含基因修飾，所述的基因修飾導(dǎo)致在一種或多種基因中的基因表達(dá)失活，所述的基因參與發(fā)酵路徑。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含基因修飾，所述的基因修飾導(dǎo)致在一種或多種基因中的基因表達(dá)失活，所述的基因選自由adhE，IdhA, focA，pflA, ack，pta，pdh，mgsA, tdcD, tdcE 和 poxB 組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)—種或多種基因修飾，所述的基因修飾破壞PEP依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的功能；(b)參與發(fā)酵路徑的一種或多種基因的突變。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因選自由ptsG, ptsH, ptsl, err和crp組成的組；(b)基因修飾,所述的基因修飾導(dǎo)致在一種或多種基因中的基因表達(dá)失活，所述的一種或多種基因選自由adhE，ldhA，focA, pf 1A, ack, pta, pdh, mgsA, tdcD, tdcE 和 poxB 組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因與TCA循環(huán)的運(yùn)行有關(guān)。
24.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因選自由下列組分組成的組mdh, fumA, fumB, fumC, frdABCD, acceAB, acnAB, icd,iclR, aspC,和 scfAo
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因選自由下列組分組成的組ptsG, ptsH, ptsl, err和crp ； (b)基因修飾,所述的基因修飾導(dǎo)致一種或多種基因中的基因表達(dá)失活，所述的基因選自由下列組分組成的組adhE, IdhA, focA, pf 1A, ack, pta, pdh,mgsA, tdcD, tdcE 和 poxB ；以及(c)在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因選自由下列組分組成的組mdh, fumA, fumB, fumC, frdABO),acceAB, acnAB, icd, iclR, aspC,和 scfA。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株，進(jìn)一步包含在一種或多種基因中的基因修飾，所述的基因選自由下列組分組成的組磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，NADH依賴性蘋果酸酶和NADPH依賴性蘋果酸酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株，進(jìn)一步包含一種外源丙酮酸羧化酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的細(xì)菌菌株，其中所述的丙酮酸羧化酶來自乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis),高梁(Sorghum vulgare)或菜豆根瘤桿菌(Rhizopium etli)。
29.—種基因修飾細(xì)菌細(xì)胞，其中所述的基因修飾細(xì)菌細(xì)胞為XZ320，XZ332，XZ3431，XZ468, XZ469, XZ470, XZ613, XZ615, XZ616, XZ618, XZ620, XZ647, XZ7121，或 XZ723。
30.一種大腸桿菌細(xì)菌菌株，所述菌株包含(a)失活的IdhA ； (b)失活的focA ； (c)失活的PflB ； (d)失活的ackA ； (e)失活的mgsA ； (f)失活的adhE ； (g)失活的tdcD ； (h)失活的tdcE ；⑴失活的aspC ； (j)失活的sfcA ； (k)失活的ptsH ； (I)失活的citD和(m)上調(diào)的 pck。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌菌株在含2^-20%(w/v)葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基中，每摩爾葡萄糖生產(chǎn)至少0. Imol琥珀酸。
32.—種生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括 (a)培養(yǎng)如權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株； (b)供應(yīng)碳源； (C)允許所述的細(xì)菌代謝所述的碳源；并且 (d)分離琥珀酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的細(xì)菌菌株在厭氧條件，有氧條件，微好氧條件或上述條件組合下培養(yǎng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的細(xì)菌菌株在基本鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的基本鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含2%-20%(w/v)碳源。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的碳源為葡萄糖，果糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，蔗糖，纖維二糖，半纖維素，甘油或上述的組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的培養(yǎng)為分批過程或分批補(bǔ)料過程。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，所述培養(yǎng)為連續(xù)過程。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含在gldA基因中的突變。
40.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含在dhaKLM操縱子中的突變。
41.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)在gldA中的突變；和(b)在dhaKLM操縱子中的突變。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)在gldA中的突變；(b)在dhaKLM操縱子中的突變；和(c)在編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的蛋白的一種或多種基因中的突變。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含(a)在gldA中的突變；(b)在dhaKLM操縱子中的突變；(c)在編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的蛋白的一種或多種基因中的突變；和(d)在編碼參與發(fā)酵路徑的的蛋白的一種或多種基因中的突變。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-30或39-43之一的細(xì)菌細(xì)胞,其中所述pck轉(zhuǎn)錄是內(nèi)源pck轉(zhuǎn)錄。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用可再生生物原料有效生產(chǎn)琥珀酸和/或其它產(chǎn)物的生物催化劑。所述生物催化劑作為基因修飾和代謝進(jìn)化共同結(jié)果，所述催化劑從糖類原料中，高效用于與生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的琥珀酸和/或其它產(chǎn)物的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明某些生物催化劑，于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在簡(jiǎn)單控制pH、分批發(fā)酵過程中，高效價(jià)和高產(chǎn)率地生產(chǎn)琥珀酸，所述培養(yǎng)基沒有添加任何外源基因物質(zhì)。本發(fā)明基因修飾涉及與除琥珀酸生產(chǎn)路線外的NADH氧化可供選擇路線的消除偶聯(lián)的能量保存策略。所述生物催化劑包含葡萄糖抑制的糖異生磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)，所述羧激酶通過基因修飾和一個(gè)基因失活的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)而解除抑制。依據(jù)琥珀酸生產(chǎn)效率，本發(fā)明生物催化劑與產(chǎn)琥珀酸瘤胃細(xì)菌功能性相當(dāng)，所述瘤胃細(xì)菌如產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌，不同點(diǎn)在于生物催化劑能在含糖類來源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中高效生產(chǎn)琥珀酸，相反，瘤胃細(xì)菌要求在天然培養(yǎng)基中生產(chǎn)琥珀酸。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102803470SQ201080024527
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者張學(xué)禮, K·簡(jiǎn)特摩, J·C·摩爾, L·R·賈柏, K·T·尚穆根, L·O·英格拉姆 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)公司