專利名稱：使用高甘油濃度的用于1,3-丙二醇生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于1，3-丙二醇生產(chǎn)的新方法，包括在具有高甘油含量的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物。本發(fā)明還涉及新的微生物，或微生物的菌株，其經(jīng)適應(yīng)用于從包含高甘油含量的培養(yǎng)基產(chǎn)生1，3_丙二醇。本發(fā)明還涉及“適應(yīng)性微生物”，其丙三醇代謝定向于1， 3-丙二醇產(chǎn)生，并且允許其在高濃度的工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的生物來源的1，3-丙二醇。最后，本發(fā)明涉及上述生物來源的1，3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈(extender chain)，作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯中的單體和作為化妝品配制劑中的組分的用途。
背景技術(shù)：
1，3_丙二醇(PDO)是知曉時(shí)間最久的發(fā)酵產(chǎn)物之一。其早在1881年就由August Freund在明顯含有巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)作為活性生物的丙三醇發(fā)酵混合培養(yǎng)中可靠地得到了鑒定。對(duì)產(chǎn)生PDO(亞丙基二醇，丙二醇)的不同腸細(xì)菌的發(fā)酵的定量分析早在1擬8年就在代爾夫特微生物學(xué)院(microbiology school of Delft)開始，并且在20世紀(jì)40年代在Ames，Iowa成功地繼續(xù)。在20世紀(jì)60年代，興趣轉(zhuǎn)移到攻擊丙三醇的酶，特別是丙三醇和二醇脫水酶，因?yàn)檫@些酶在需求輔酶B12方面很特殊。形成PDO的梭菌首次記載于1983年，作為從分泌丙三醇的藻類獲得特別產(chǎn)物的方法的一部分(Nakas等，198 。PDO是丙三醇發(fā)酵的典型產(chǎn)物，并且尚未在其他有機(jī)底物的厭氧轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)。只有非常少數(shù)的生物(其均為細(xì)菌)能夠形成PD0。它們包括克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)(月市炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae))、腸桿菌屬(Enterobacter)(成團(tuán)腸桿菌 (E. agglomerans))和檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)(弗氏檸檬酸桿菌(C. freundii))的腸細(xì)菌，乳桿菌(IactcAacilli)(短乳桿菌和布氏乳桿菌(L. buchneri))，和丁酸梭菌和巴氏梭菌類的梭菌。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的分析顯示，部分丙三醇轉(zhuǎn)化成與這種不同類型的糖發(fā)酵中相同的產(chǎn)物，即乙酸、2，3_ 丁二醇、丁酸、乳酸、乙醇和琥珀酸。這種轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)提供了必需的能量，但是對(duì)于許多產(chǎn)物而言，在丙三醇向PDO的還原性轉(zhuǎn)化中所用的還原當(dāng)量也被釋放。降低梭菌中PDO產(chǎn)量的丁酸形成在某種程度上與克雷伯氏菌屬中的乙醇形成相當(dāng)，但是其似乎更依賴于生長(zhǎng)速率。丁酸隨著稀釋率迅速減少，即使是在不存在底物過量的情況下。在任何情況下，乙酸/ 丁酸比的改變對(duì)PDO產(chǎn)量(yield)沒有很大影響。PDO作為雙官能有機(jī)化合物，能夠潛在地用于許多合成反應(yīng)，特別是作為產(chǎn)生聚酯、聚醚和聚氨酯的縮聚中的單體。PDO能夠通過不同的化學(xué)途徑產(chǎn)生，但是它們生成含有極具污染性的物質(zhì)的廢料流，因而生產(chǎn)成本高并且化學(xué)產(chǎn)生的PDO無法與能夠通過石油化學(xué)獲得的二醇如1，2_乙二醇、1，2_丙二醇和1，4_ 丁二醇競(jìng)爭(zhēng)。因此，在過去PDO只能找到市場(chǎng)交易量可以忽略的特殊領(lǐng)域應(yīng)用(niche application)。這是為何在1995年杜邦 (Dupont)起動(dòng)了葡萄糖生物轉(zhuǎn)化為PDO的研究項(xiàng)目。盡管這種過程是環(huán)境友好的，但是其具有如下缺點(diǎn)i)使用維生素B12，一種非常昂貴的輔因子和ii)因?yàn)樯a(chǎn)菌株的不穩(wěn)定性
4而是一種不連續(xù)的過程。由于從生物柴油工業(yè)流出的大量丙三醇的可用性，連續(xù)的過程、不用維生素B12以及較高碳得率會(huì)是有利的。本領(lǐng)域已知PDO能夠從甘油(glycerine)產(chǎn)生，甘油(glycerine)是生物柴油生產(chǎn)的一種不想要副產(chǎn)物，其含有混有鹽和水的大約80-85%的丙三醇。先前描述了丁酸梭菌能夠在分批和兩階段連續(xù)發(fā)酵中生長(zhǎng)并從工業(yè)丙三醇產(chǎn)生 PDO (Papanikolaou等，2000)。然而，在最高丙三醇濃度下，以0. O^T1的稀釋率獲得的最大 PDO效價(jià)為48. lg/L，意味著0. 9g/L/H的生產(chǎn)率。所述培養(yǎng)以補(bǔ)料培養(yǎng)基中最大丙三醇濃度為90g/L并在酵母提取物(本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于幫助增加細(xì)菌生物量產(chǎn)生的一種昂貴的含有有機(jī)氮的化合物)存在下進(jìn)行。W02006/128381公開了這種甘油用于以使用天然PDO生產(chǎn)生物如肺炎克雷伯氏菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌的分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)生PDO的用途。另外，W02006/U8381中使用的培養(yǎng)基也含有酵母提取物。如該專利申請(qǐng)中所述，達(dá)到的最大生產(chǎn)率為0.8-1. Ig. 1. tf1 (含端值)(comprised between)。經(jīng)修飾而含有來自丁酸梭菌(C. butyricum)的維生素B12-非依賴性丙三醇脫水酶和PDO-脫氫酶的丙酮丁醇梭菌菌株(稱為丙酮丁醇梭菌DGlpSPD5)的性能已經(jīng)在 Gonzalez-Pajuelo等，2005中描述。這種菌株在原始狀態(tài)下(originally)使用含有多至 120g. Γ1的純丙三醇的補(bǔ)料培養(yǎng)基生長(zhǎng)并產(chǎn)生PD0。此外，使用含有最多60g. Γ1的純的或工業(yè)丙三醇的補(bǔ)料培養(yǎng)基的分析沒有鑒別出任何差異。當(dāng)比較丁酸梭菌與丙酮丁醇梭菌 DGl pSPD5時(shí)，作者Gonzalez-Pajuelo等，2006觀察到了全局性的相似行為。然而，在不含有機(jī)氮的合成補(bǔ)料培養(yǎng)基中使用105g. Γ1的工業(yè)丙三醇測(cè)試的相同丙酮丁醇梭菌DGl pSPD5菌株不能給出與使用相同濃度的純丙三醇相同的性能(參見實(shí)施例1)。本發(fā)明提供使用高濃度工業(yè)甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的方法(means)，并且其中能夠達(dá)到較高的PDO效價(jià)和生產(chǎn)率。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1，3_丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，和回收1， 3-丙二醇，其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油包含丙三醇，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預(yù)先適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，丙三醇以90_120g/L，優(yōu)選約105g/L的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。所述培養(yǎng)基優(yōu)選為合成培養(yǎng)基，不添加任何有機(jī)氮源，并且特別是沒有酵母提取物。所述工業(yè)甘油具體而言是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物。所述生產(chǎn)微生物優(yōu)選為細(xì)菌，更優(yōu)選選自梭菌屬的成員，特別是丙酮丁醇梭菌。有利地，所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾而改進(jìn)1，3-丙二醇從丙三醇的產(chǎn)生的微生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)微生物中的丙三醇脫水酶活性不依賴于輔酶 B12或其多種前體中的一種的存在，并且源自丁酸梭菌。
優(yōu)選地，所述生產(chǎn)微生物是之前通過將微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇適應(yīng)性微生物而適應(yīng)于在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物。最后，1，3-丙二醇經(jīng)進(jìn)一步純化。本發(fā)明還涉及一種用于將微生物修飾成適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物的方法，包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的適應(yīng)性微生物。有利地，將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時(shí)M小時(shí)至10天，優(yōu)選多于2天，更優(yōu)選約8天的時(shí)間。所述稀釋率通常為0. 005-0. 11Γ1，優(yōu)選0. 005-0. 021Γ1。所述稀釋率在所述適應(yīng)方法的過程中可以變化，最終具有稀釋率為0. 005-0. 021Γ1的第一步和其中稀釋率增長(zhǎng)至 0. lh—1，優(yōu)選0. (MT1的第二步。本發(fā)明還涉及適應(yīng)性微生物，即可以通過上文和下文公開的方法獲得的適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的生產(chǎn)微生物。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇。本發(fā)明還涉及生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于"(和wO同位素值的組合選自 s 1V 低于-34%。且 δ 為 21.5%。-0.5%。，優(yōu)選 δ 13C 低于-35%。且 δ wO 為 21. 9%。-0. 5%0， 更優(yōu)選 δ 13C 為-35. 05%。 -36. 09%。且 δ 18O 為 21. 9%。-17. 34%0。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物來源的1，3_丙二醇的特征在于δ 13C/ δ "0同位素比值為-2 0，優(yōu)選-1 -0. 2，且更優(yōu)選-0. 65 -0. 4。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的或如上限定的生物來源的1，3_丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈，作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯中的單體或作為化妝品配制物中的組分的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1，3_丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，和回收1， 3-丙二醇，其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油包含丙三醇，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預(yù)先適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物。術(shù)語(yǔ)“微生物”意指選自由細(xì)菌、酵母和真菌組成的組的微生物。優(yōu)選地， 所述微生物是優(yōu)選選自下組的細(xì)菌腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科 (Bacillaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、鏈霉菌禾斗(Streptomycetaceae)禾口棒桿菌禾斗 (Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地，所述細(xì)菌選自下組埃希氏菌屬菌種(Escherichia sp.)(優(yōu)選大腸桿菌)、克雷伯氏菌屬菌種(Klebsiella sp)(優(yōu)選肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae))、芽孢桿菌屬菌禾中(Bacillus sp.)(優(yōu)選枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis))、梭菌屬菌種(優(yōu)選丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 和丁酸梭菌(Clostridium butyricum))和棒桿菌屬菌種(Corynebacterium sp)(優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum))。術(shù)語(yǔ)“埃希氏菌屬”、“克雷伯氏菌屬”、“芽孢桿菌屬”、“梭菌屬”(〃 Clostridium" and" Clostridia")和“棒桿菌屬”是指屬于這些科或?qū)俚娜考?xì)菌種類。術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)微生物”或“微生物的生產(chǎn)菌株”是指其中該微生物的丙三醇代謝定向于1，3_丙二醇生產(chǎn)的微生物或微生物菌株?！敖?jīng)適應(yīng)的微生物”是指經(jīng)修飾而能夠在高濃度工業(yè)甘油上生長(zhǎng)的微生物?！斑m當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”是指對(duì)于所述生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)和二醇生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化
的培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)“高甘油含量”或“高濃度甘油”意指培養(yǎng)基中超過90g/l的丙三醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基以90-120g/L，優(yōu)選約105g/L的濃度包含丙三醇?！肮I(yè)甘油”意指從不進(jìn)行實(shí)質(zhì)性純化的工業(yè)過程獲得的甘油產(chǎn)物。工業(yè)甘油也可稱作“粗甘油”、“粗丙三醇”或“工業(yè)丙三醇”。工業(yè)甘油含有超過約70%，優(yōu)選超過約 80%的丙三醇，少于15%的水和雜質(zhì)如無機(jī)鹽和脂肪酸。無機(jī)鹽的濃度小于10%，優(yōu)選小于5%。脂肪酸的濃度小于20%，優(yōu)選小于5%。工業(yè)甘油中最具代表性的脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、亞油酸和花生酸。獲得工業(yè)甘油的工業(yè)過程為，但不限于，其中將脂肪和油，特別是植物來源的脂肪和油加工成工業(yè)產(chǎn)品如洗滌劑或潤(rùn)滑劑的制造方法。在這樣的制造方法中，認(rèn)為工業(yè)甘油是副產(chǎn)物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，工業(yè)甘油是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物并且包括從生物柴油生產(chǎn)獲得的甘油的已知雜質(zhì)，包含約80-85%的丙三醇以及鹽、水和一些其他有機(jī)化合物如脂肪酸。從生物柴油生產(chǎn)獲得的工業(yè)甘油未進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟。術(shù)語(yǔ)“合成培養(yǎng)基”意指生物在其上生長(zhǎng)的包含化學(xué)上確定的底物的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，有利地，丙三醇是碳的單一來源。優(yōu)選地，這種培養(yǎng)基不含任何有機(jī)氮源。氮是對(duì)于植物和動(dòng)物二者的生長(zhǎng)和繁殖關(guān)鍵的天然存在的元素。其存在于氨基酸中和許多其他有機(jī)和無機(jī)化合物中。根據(jù)本發(fā)明，“有機(jī)氮”意指包含從活的生物獲得的包含氮的有機(jī)化合物。用于細(xì)菌培養(yǎng)的有機(jī)氮的常用來源包含酵母提取物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)微生物是梭菌屬菌株，更優(yōu)選丙酮丁醇梭菌。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌。短語(yǔ)“經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌”意指該菌株經(jīng)過以改變其遺傳特征為目的的轉(zhuǎn)化?？梢詫?nèi)源基因削弱、缺失、或過表達(dá)?？蓪⑼庠椿蛞搿⑼ㄟ^質(zhì)粒攜帶、或整合入所述菌株的基因組中，以在細(xì)胞中表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！被颉拜d體”如用于本文是指通常攜帶不屬于細(xì)胞中央代謝的一部分的基因，并且通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式的額外染色體元件。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述方法的特征在于所述生產(chǎn)微生物具有丙三醇脫水酶活性，該活性不依賴于輔酶B12或其多種前體之一的存在，并且該活性源自丁酸梭菌。具體而言，所述生產(chǎn)微生物通過或者由質(zhì)粒過表達(dá)或者整合至所述微生物的染色體中來引入額外拷貝的來自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操縱子(編碼維生素B12-非依賴性1， 3-丙二醇途徑中涉及的酶)而呈現(xiàn)增加的1，3_丙二醇產(chǎn)生流(flux)。例如，pSPD5質(zhì)?？梢杂糜?，3-丙二醇操縱子的過表達(dá)。用于將丙三醇代謝定向于1，3_丙二醇的產(chǎn)生的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如 W02006/128381, Gonzalez-Pajuelo 等，2006)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述生產(chǎn)微生物是預(yù)先適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物。生產(chǎn)微生物的所述“適應(yīng)”是通過將該微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的適應(yīng)性微生物來獲得的。本發(fā)明還涉及用于將微生物修飾成適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物的方法。幾種“適應(yīng)方法”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇以將生產(chǎn)微生物轉(zhuǎn)化成允許在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的生產(chǎn)微生物。根據(jù)本發(fā)明，將微生物轉(zhuǎn)化成適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物的修飾包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的適應(yīng)性微生物。有利地，將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時(shí)M小時(shí)至10天，優(yōu)選多于2天，更優(yōu)選約8天的時(shí)間。所述稀釋率通常為0. 005-0. 11Γ1，優(yōu)選0. 005-0. 021Γ1。所述稀釋率在所述適應(yīng)方法的過程中可以變化，最終具有稀釋率為0. 005-0. 021Γ1的第一步和其中稀釋率增長(zhǎng)至 0. ltr1，優(yōu)選0. 061Γ1的第二步。當(dāng)在適應(yīng)方法的過程中改變稀釋率時(shí)，0. 005-0. 021Γ1的稀釋率稱為“低稀釋率”，而0. 02-0. ItT1的稀釋率為普通稀釋率。本發(fā)明還涉及適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物，其容許通過如上所述的方法獲得。使用本發(fā)明的方法適應(yīng)的微生物優(yōu)選是進(jìn)一步適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的生產(chǎn)微生物。所述適應(yīng)性微生物也可以是首先適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)，再修飾為具有其定向于1，3-丙二醇生產(chǎn)的丙三醇代謝的微生物。根據(jù)本發(fā)明的“適應(yīng)性微生物”是適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)并且具有以下兩種關(guān)鍵特征的生產(chǎn)微生物-其丙三醇代謝定向于1，3_丙二醇產(chǎn)生，和-允許其在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，將丙酮丁醇梭菌DGl PSPD5菌株使用含有 105g. Γ1來自生物柴油生產(chǎn)的粗丙三醇的補(bǔ)料培養(yǎng)基在連續(xù)培養(yǎng)中以0. 005-0. 021Γ1，優(yōu)選 0. 02^1的稀釋率培養(yǎng)。歷時(shí)最多10天，優(yōu)選5-8天的時(shí)間，使所述菌株適應(yīng)于補(bǔ)料培養(yǎng)基中存在的高甘油濃度，并且可以將稀釋率增長(zhǎng)至0. Ih-1,優(yōu)選增長(zhǎng)至0. OBh-1 (參見實(shí)施例 2)。稀釋率的逐漸增加可以在分批階段(batch phase)結(jié)束_10天，優(yōu)選在5天之后， 5-8天，約7天進(jìn)行，導(dǎo)致連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率改進(jìn)(參見實(shí)施例3)。有利地，在適應(yīng)階段之后，補(bǔ)料培養(yǎng)基中的丙三醇濃度可以增加至UOg.r1。然而， 直接嘗試使菌株適應(yīng)于120g. Γ1的工業(yè)丙三醇不可行，即使對(duì)于105g. Γ1的丙三醇濃度以 0. 021Γ1的稀釋率，再次說明了所述菌株不能在不進(jìn)行在先適應(yīng)的情況下在補(bǔ)料培養(yǎng)基中在高甘油濃度存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明的方法，在其不同的實(shí)施例中(使用經(jīng)遺傳修飾的微生物和/或使用不含額外有機(jī)氮源的培養(yǎng)基)，導(dǎo)致對(duì)于0. 05-0. 6g. h—1的稀釋率而言1，3-丙二醇以0. 4-0. 6g. g-1的得率和1. 8-3. 5g. Γ1, h"1的生產(chǎn)率產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述得率為0. 5-0. 56g. 并且所述生產(chǎn)率為2-2. 9g. Γ1』-1。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，產(chǎn)生的1，3-丙二醇經(jīng)進(jìn)一步純化。連續(xù)發(fā)酵方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。發(fā)酵方法通常在反應(yīng)器中進(jìn)行，所述反應(yīng)器具有適應(yīng)于所用細(xì)菌的具有已知確定的組成的無機(jī)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基至少含有甘油，一種含有丙三醇的來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物，并且視需要含有用于代謝物產(chǎn)生的共底物。本發(fā)明的這種方法優(yōu)選在連續(xù)工藝中實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何掌控這些實(shí)驗(yàn)條件中的每一種，和如何限定用于本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)條件。具體而言，梭菌在 20°C-60°C，優(yōu)選25°C-40°C (對(duì)于丙酮丁醇梭菌而言)的溫度發(fā)酵。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并最終純化1，3_丙二醇的方法是技術(shù)人員已知的。1， 3-丙二醇可以通過蒸餾分離。在大多數(shù)實(shí)施方案中，1，3-丙二醇與副產(chǎn)物如乙酸一起從發(fā)酵培養(yǎng)基中蒸餾，然后通過已知方法進(jìn)一步純化。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1，3-丙二醇。本發(fā)明還涉及以其同位素比為特征的生物來源的1，3_丙二醇。對(duì)氫(D/H)和碳(1 /1 )的同位素比分析為特定產(chǎn)品如蜂蜜(Grenier-Loustalot等，2006)或葡萄酒 (Guillou等，2001)提供可靠的指標(biāo)(indicator)。13CfC同位素比為來源的區(qū)分提供指示并反映特定產(chǎn)物的生物合成代謝途徑和使用的原料。使用Calvin-Benson光合循環(huán)的C3植物和使用Hatch-Slack光合循環(huán)的C4植物之間確實(shí)可以產(chǎn)生差異。專利申請(qǐng)WO 01/11070 描述了產(chǎn)生自葡萄糖的生物來源的1，3-丙二醇的13C/12C同位素比為-10. 9 -15. 4 ；產(chǎn)生自丙三醇的生物來源的1，3-丙二醇的13Cz^C同位素比為-22. 41 -22. 60，而化學(xué)產(chǎn)生的 1,3-丙二醇的13C/12C同位素比為-17. 95至-18. 33。根據(jù)本發(fā)明，1，3_丙二醇D/H* (記錄為51)) /1 比(記錄為δ 13C)、180/160 比(記錄為δ 18O)在燃燒之后通過質(zhì)譜測(cè)定。同位素13CZ^C比參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(PDB = Pee Dee Belemite (Pee Dee箭石))作為δ按千分比(per mill)計(jì)算。同位素w0/lfi0比參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水(SMOW)作為δ按千分比計(jì)算。同位素D/H比與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水 (SMOff)比較按ppm計(jì)算。盡管D/H比和13CZ^C比公知用于給定產(chǎn)品的表征，180/160比卻主要用于水分析作為古氣候指標(biāo)(paleoclimatic indicator)。不同類型的1，3-丙二醇之間的比較顯示SD沒有差別。來自丙三醇的生物來源的1，3_丙二醇(本發(fā)明的目的)的SD為147. 38ppm-145.84ppm，而來自葡萄糖的生物來源的1，3-丙二醇為145ppm，且對(duì)于化學(xué)1，3-丙二醇為150. 19ppm-139. 37ppm。本發(fā)明涉及容許根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1，3-丙二醇，其特征在于51 同位素值低于_；34%。，優(yōu)選低于_；35%。，并且更優(yōu)選為-35. 05%。 -36. 09%0。本發(fā)明還涉及容許根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于 δ 18O 同位素值為 21. 5%ο -0. 5%。，優(yōu)選 21. 9%。-15%。，并且更優(yōu)選 21. 9%。-17. 34%0。本發(fā)明還涉及生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于以下特征之一或其組合-13C 和 18O 同位素值選自低于 _；34%。的 δ 13C 和 21. 9%。-0. 5%。的 δ 18O,
9
-優(yōu)選δ 13C 低于-35%。且 δ 18O 為 21. 9%。-0. 5%0，-更優(yōu)選δ 13C 為-35. 05%。 -36. 09%。且 δ 18O 為 21. 9%。-17. 34%。(參見實(shí)施例 4)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物來源的1，3_丙二醇的特征在于"0/1 同位素比值為-2 0 ；優(yōu)選-1 -0. 2，并且更優(yōu)選-0. 65 -0. 4。優(yōu)選地，以前述同位素比為特征的生物來源的1，3_丙二醇是通過以作為原料的丙三醇為基礎(chǔ)的發(fā)酵獲得的。更優(yōu)選地，以前述同位素比為特征的生物來源的1，3_丙二醇是從用于產(chǎn)生1，3_丙二醇的本發(fā)明的方法獲得的。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的或如上限定的生物來源的1，3_丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈，作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯中的單體或作為化妝品配制物中的組分的用途。生物來源的1，3_丙二醇可以用于化學(xué)1，3_丙二醇的所有已知應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何從1，3_丙二醇獲得這些終產(chǎn)物。本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1，3_丙二醇作為延伸鏈制備熱塑性聚氨酯的方法。其還涉及制備含有根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1，3_丙二醇的化妝品組合物的方法。其還涉及使用根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1，3_丙二醇作為單體合成聚對(duì)苯二甲酸丙二酯的方法。


圖1 以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的％。表示的PDO δ %和δ 18O =PDOl 根據(jù)描述的方法產(chǎn)生的PDO ； PD02 從作為底物的葡萄糖產(chǎn)生的PDO ；PD03 通過化學(xué)方法產(chǎn)生的PD0。圖2 =PDO的δ 18O/ δ 13C比PD01 根據(jù)描述的方法產(chǎn)生的PDO ；PD02 從作為底物的葡萄糖產(chǎn)生的PDO ；PD03 通過化學(xué)方法產(chǎn)生的PD0。
實(shí)施例實(shí)施例1用于梭菌屬分批培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基每升去離子水含有丙三醇，30g;KH2P04， 0. 5 ；K2HP04,0. 5g ；MgSO4, 7H20,0. 2g ；CoCl2 6H20,0. Olg, H2SO4,0. Iml ；NH4Cl, 1. 5g，生物素， 0. 16mg;對(duì)氨基苯甲酸，3ang和FeS04，7H20，0.(^8g。將該培養(yǎng)基的pH使用NH4OH 3N調(diào)節(jié)至6.3。對(duì)于分批培養(yǎng)，使用購(gòu)自Sigma (純度99. 5%)的商業(yè)丙三醇。用于連續(xù)培養(yǎng)的補(bǔ)料培養(yǎng)基每升自來水(tap water)含有粗丙三醇，105g ；KH2P04,0. 5 ;Κ2ΗΡ04，0· 5g ；MgSO4, 7Η20，0· 2g ；CoCl2 6Η20，0· 026g ；NH4Cl, 1. 5g，生物素，0. 16mg ；對(duì)氨基苯甲酸，32mg ；FeSO4, 7H20,0. 04g,消泡劑，0. 05ml ；ZnSO4, 7H20,8mg ；CuCl2, 2H20,4mg ；MnSO4, H20,40mg, H3BO3, 2mg ； Na2MoO4, 2H20,0. 8mgo在此情況下不調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。產(chǎn)生自生物柴油生產(chǎn)的酯交換過程的粗丙三醇由SAIP0L(Le Meriot，F(xiàn)rance)供應(yīng)并且含有83%丙三醇(w/w)。連續(xù)培養(yǎng)在2L生物反應(yīng)器Tryton (Pierre Guerin，F(xiàn)rance)中進(jìn)行，工作容積為 1000ml。通過自動(dòng)調(diào)整培養(yǎng)水平將培養(yǎng)容積保持恒定在1000ml。在35°C的溫度以200RPM 攪拌培養(yǎng)物，并且通過自動(dòng)添加NH4OH 3N將pH維持在6.5。在實(shí)驗(yàn)期間控制并記錄以mV 表示的培養(yǎng)基的氧化-還原力(Oxido-Reductive Power)。為了創(chuàng)造厭氧條件，將容器中經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基用不含02的無菌氮?dú)庠?0°C沖洗1小時(shí)，并再次沖洗直至達(dá)到35°C。所述
10生物反應(yīng)器的氣體出口通過連苯三酚(pyrogallol)的布置保護(hù)其免于氧氣(Vasconcelos 等，1994)。在滅菌之后，將補(bǔ)料培養(yǎng)基也用不含&的無菌氮?dú)鉀_洗直至達(dá)到室溫，并維持在200mbar的氮?dú)鈮合乱员苊饣M(jìn)入。以濁度計(jì)在620nm測(cè)量細(xì)胞濃度并與直接評(píng)估的細(xì)胞干重相關(guān)聯(lián)。丙三醇、1， 3-丙二醇、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸以及其他痕量水平的酸的濃度通過HPLC分析來測(cè)量。在 Biorad Aminex HPX087H柱上進(jìn)行分離，并通過折射率實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。操作條件如下流動(dòng)相硫酸 0. 5mM ；流速 0. 5ml/min，溫度，25 °C。使用于指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)取得的IOOml燒瓶中合成培養(yǎng)基(與上述分批培養(yǎng)基相同，但是不添加乙酸，2. 2g. Γ1和M0PS，23.03g. Γ1)上的生長(zhǎng)中的培養(yǎng)物作為接種物(5% v/V)。首先將培養(yǎng)物分批(batch-wise)培養(yǎng)。在指數(shù)生長(zhǎng)早期，加入商業(yè)丙三醇的脈沖 (pulse)將脈沖定義為在3小時(shí)期間以50ml. IT1的流速添加含商業(yè)丙三醇120g. Γ1的合成培養(yǎng)基(與對(duì)分批培養(yǎng)描述的相同)(即添加18g丙三醇)。然后生長(zhǎng)繼續(xù)分批進(jìn)行，并且在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束之前，以0. OBh-1的稀釋率和含105g. Γ1的粗丙三醇的補(bǔ)料培養(yǎng)基開始連續(xù)補(bǔ)料。表1 丙酮丁醇梭菌DGl (pSPD5)在105g. Γ1的粗丙三醇上的連續(xù)培養(yǎng)(D = 0. 06h-l，pH 6. 5且T°C= 35°C )。給出的值代表在3次容積變化之后獲得的穩(wěn)態(tài)條件下7 個(gè)點(diǎn)的平均值。
權(quán)利要求
1.一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1，3_丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇，和回收1，3_丙二醇， 其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油(glycerine)包含丙三醇 (glycerol)，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預(yù)先適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在所述培養(yǎng)基中丙三醇以90-120g/L，優(yōu)選約 105g/L的濃度存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述工業(yè)甘油是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基是未添加有機(jī)氮源，特別是未添加酵母提取物的合成培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物選自梭菌屬(genus Clostridium)的成員。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物中的丙三醇脫水酶活性不依賴于輔酶B12或其多種前體中的一種的存在并且源自丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物通過將該微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的適應(yīng)性微生物而適應(yīng)成為生產(chǎn)微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于1，3-丙二醇經(jīng)進(jìn)一步純化。
11.一種用于將微生物修飾成適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物的方法， 包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的適應(yīng)性微生物。
12.權(quán)利要求11的方法，其特征在于將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時(shí)范圍從M小時(shí)至10天的時(shí)間。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其特征在于所述稀釋率為0.005-0. ItT1。
14.一種適應(yīng)于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)的微生物，其容許(susceptible to be obtained by)通過如權(quán)利要求11_13中之一所述的方法獲得。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法獲得的生物來源的1，3-丙二醇。
16.容許根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于S 13C同位素值低于_；34%。，優(yōu)選低于_；35%。，并且更優(yōu)選為-35. 05%。 -36. 09%0。
17.容許根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于 δ 18O 同位素值為 21. 5%ο -0. 5%。，優(yōu)選 21. 9%。-15%。，并且更優(yōu)選為 21. 9%。-17. 34%0。
18.容許根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于δ 13C和δ 18O同位素值選自以下值a)δ 13C 值低于-34%。且 δ 18O 為 21. 5%。-0. 5%0 ；b)δ 13C 值低于-35%ο5. δ 18O 為 21. 9%ο -15%。；或c)δ 13C 值為-35. 05%。至-36. 09%。且 δ 18O 為 21. 9%。-17. 34%0。
19.容許根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法獲得的生物來源的1，3_丙二醇，其特征在于180/13C同位素比值為-2 0，優(yōu)選-1 -0. 2，更優(yōu)選-0. 65 -0. 4。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的1，3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯合成中延伸鏈的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的1，3_丙二醇作為化妝品配制物中的組分的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的1，3-丙二醇作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯合成中的單體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生1，3-丙二醇的新方法，包括在具有高甘油含量的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物。本發(fā)明還涉及新的微生物，或微生物菌株，其經(jīng)適應(yīng)用于從包含高甘油含量的培養(yǎng)基產(chǎn)生1，3-丙二醇。本發(fā)明還涉及“適應(yīng)性微生物”，其丙三醇代謝定向于1，3-丙二醇產(chǎn)生，并且允許其在高濃度的工業(yè)甘油存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的生物來源的1，3-丙二醇。最后，本發(fā)明涉及上述生物來源的1，3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈，作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯中的單體和作為化妝品配制劑中的組分的用途。
文檔編號(hào)C12P7/18GK102421907SQ201080019774
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者J-Y.杜博伊斯, M.查蒂奧, P.索凱爾 申請(qǐng)人:代謝探索者公司