專利名稱：使用編碼的微載體進行的基因組選擇和測序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸雜交和測序方法。本發(fā)明進一步涉及使用編碼的微載體進行的核酸片段的選擇、測序和鑒定。
背景技術(shù)：
最近的測序技術(shù)使得同時測定大量核苷酸序列。這取消了對在不同的毛細(xì)管或分離的反應(yīng)孔中進行分離的測序反應(yīng)的需要。通常地，DNA樣品通過機械或酶促技術(shù)被片段化，其后單個的DNA片段經(jīng)由連接到片段的一種類型的核苷酸接頭分子被結(jié)合到基質(zhì)、例貪反應(yīng)室的壁或微載體/珠)，所述核苷酸接頭分子也發(fā)揮通用引物的功能。對于多于單個分子測序的技術(shù)，基于PCR的擴增步驟如下。例如，測序技術(shù)例如“4M”焦磷酸測序 (Roche)利用單個的微珠作為基質(zhì)，其在反應(yīng)室微孔中設(shè)置。隨后，在所有技術(shù)中，核苷酸逐步參入并對于結(jié)合基質(zhì)的各個DNA分子進行鑒定。該過程重復(fù)多次并將所有單個的片段的測序讀碼進行比對以得到所研究的靶DNA樣品的完整序列。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已知為 “下一代測序”并被例如Helicos，Illumina和Applied Bio系統(tǒng)和Roche等公司商業(yè)化。 下一代測序方法要求同時進行的不同反應(yīng)可在物理上各自分離。DNA樣品的富集可以在測序前進行以降低樣品的復(fù)雜性和選擇基因組的特定區(qū)域用于測序。方法描述在Hodges等人Q007) Nature Genetics 39，1522-1527中以選擇或富集基因組DNA片段用于隨后測序，其通過選擇雜交探針來進行。已發(fā)展了更多種多樣的方法用于DNA雜交，其中多路方法部分或完全在溶液中進行和其中使用具有不同顏色的微載體或使用編碼的標(biāo)志物索引單個反應(yīng)(所綜述的Braeckmans等人Q002) Nature Rev. Drug Discovery 1,447-448)。在該內(nèi)容中，Braeckmans 等人(2003) Nature Mat. 2，169-173表明光漂白的編碼的顆粒用于DNA雜交測定的用途。目前測序方法的缺點是可被測序的DNA的相對短的單個閱讀長度，導(dǎo)致具有有限信息含量的序列。這使得在參考基因組序列中定位測定的序列通常困難(序列注解)。特別困難的是硫酸氫鹽測序的情況下，其中在測序反應(yīng)之前，在片段的CpG序列中的未甲基化的C核苷酸轉(zhuǎn)換成T核苷酸，導(dǎo)致用于與參考基因組進行測序讀碼比對的減少的信息和因此在最終核酸序列的正確組裝中增加的難度。特別對于未來臨床診斷應(yīng)用，例如癌癥測序，微生物學(xué)和臨床遺傳學(xué)，加快測定患者基因組樣品的序列的時間和獲得最高的可能準(zhǔn)確度應(yīng)是有利的。發(fā)明概述
本發(fā)明的具體和優(yōu)選方面在所附獨立和從屬權(quán)利要求中闡述。從屬權(quán)利要求的特征可與合適的且不只是權(quán)利要求中明確闡述的獨立權(quán)利要求的特征和其他從屬權(quán)利要求的特征組合。本發(fā)明涉及用于測定靶核酸分子的序列的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供與編碼的微載體連接的俘獲寡核苷酸探針，其中所述微載體的代碼(代碼)鑒定所述寡核苷酸探針的序列和/或其在參考基因組上的位置，
b)將所述俘獲寡核苷酸探針與包含核酸分子的樣品雜交，其中所述核酸分子包含至少部分與俘獲寡核苷酸探針的序列互補的序列，
c)通過產(chǎn)生至少2個核苷酸的序列閱讀，測定步驟b)的雜交的核酸分子的序列，
d)測定微載體上的代碼，
e)如步驟d)中所測定的，鑒定與微載體上的代碼相對應(yīng)的俘獲寡核苷酸探針的核苷酸序列以及其在參考基因組上的位置，
f)將步驟c)中測定的序列信息與步驟e)中鑒定的信息組合以測定靶核酸分子的序列。步驟c和d可以任何順序進行。目前本領(lǐng)域已知的方法包括將DNA樣品的選擇的部分與一組探針結(jié)合的步驟。單個的DNA片段與在陣列上的各個探針雜交的信息有丟失，因為所有雜交的DNA片段從陣列中釋放并在進一步測序步驟中批量處理。以上確定的問題通過根據(jù)本發(fā)明的方法解決。本發(fā)明引起測定的序列的信息量增加，而同時利用了最近開發(fā)的DNA測序技術(shù)的優(yōu)勢，例如大通量和速度和靈敏度。本發(fā)明精良地顯示基因組富集/選擇和測序步驟的整合，提供了最小化的測定時間和樣品損失以及因而診斷測序測試的改進的特異性。方法促進了測定與參考序列比較的靶核酸分子的序列改變。在優(yōu)選實施方案中，靶核酸分子包含至少2個核苷酸探針序列。本發(fā)明另一個實施方案是用于測定核酸樣品的序列的設(shè)備，所述設(shè)備包含用于將俘獲探針與核酸退火的部件，用于測定DNA分子的序列的部件，用于操作微載體的部件和用于測定微載體的代碼的部件。在本發(fā)明的方法的具體實施方案中，使用多個不同編碼的微載體，其中每個代碼對應(yīng)于俘獲寡核苷酸探針的唯一序列。優(yōu)選地，編碼的微載體在所述方法的一個或多個步驟中處于懸浮液中。在本發(fā)明的方法的其他具體實施方案中，微載體是磁性顆?；驇щ婎w粒。任選地，在步驟d)中，載體位于磁場中。
在本發(fā)明的方法的具體實施方案中，在步驟d)中，編碼的載體的代碼用光學(xué)方法測定。微載體可以是熒光顆粒，其中通過光漂白應(yīng)用代碼。序列測定可以例如通過測定參入的熒光核苷酸的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)進行，但是多種其他已知的測序化學(xué)方法是可用的。在本發(fā)明的方法的具體實施方案中，步驟c)中測定的序列的長度可具有20-40個核苷酸的長度。如本發(fā)明所用的DNA樣品可以通過片段化基因組DNA (例如用限制酶)產(chǎn)生。使用這類片段化方法，通過選擇特定的限制酶可以選擇足夠長度的片段化DNA。優(yōu)選長度為 200-1000個堿基對。本發(fā)明另一方面涉及設(shè)備用于測定核酸樣品的序列，所述設(shè)備包含用于將俘獲探針與核酸退火的部件，用于測定DNA分子的序列的部件，用于操作微載體的部件和用于測定微載體的代碼的部件。這類設(shè)備可以是微流設(shè)備。在具體實施方案中，用于操作微載體的部件包含用于施加至少一個磁場的裝置。根據(jù)本發(fā)明的方法和設(shè)備顯著地增加測序的DNA片段的信息含量。在現(xiàn)有技術(shù)中，接頭DNA序列用于將DNA片段隨機固定至基質(zhì)。在本發(fā)明中，DNA片段經(jīng)由與互補DNA 寡核苷酸探針(俘獲探針)雜交被固定至微載體。使用的微載體被編碼為識別俘獲探針的序列。在本發(fā)明的方法中，俘獲探針發(fā)揮特定地從全基因組DNA中提取DNA片段的功能，類似基于微陣列的基因組選擇(MGS)技術(shù)。俘獲探針任選地進一步發(fā)揮作為引物的功能用于基于DNA聚合酶的DNA擴增(PCR-克隆步驟)或單個分子測序方法。本文優(yōu)選地僅一個 DNA片段結(jié)合一個微載體。雜交的(俘獲的)DNA片段的信息，或在測序步驟后，測序的片段的信息與俘獲探針的信息組合(通過測定微載體上相應(yīng)代碼進行)。編碼的微載體的使用使得在溶液中進行反應(yīng)步驟和操作的全部或部分。通過從來自俘獲探針的序列和測定的序列獲得的序列信息的增加將顯著降低序列組裝的時間并將需要復(fù)雜度較低的軟件和硬件。本發(fā)明的以上和其他特征、特點和優(yōu)勢將從以下詳述結(jié)合附圖中變得顯而易見， 所述附圖通過舉例說明本發(fā)明的原理。給出的該說明僅用于示例目的，而不限制本發(fā)明的范圍。以下引用的參考圖是指附圖。附圖簡述


圖1示意性比較現(xiàn)有技術(shù)雜交方法(A)與根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的雜交方法⑶。A: DNA片段(實線)與連接到不具有代碼的微載體的接頭(虛線)連接。B: DNA片段(實線)與連接到編碼的微載體的俘獲探針(點線)雜交。發(fā)明詳述
本發(fā)明應(yīng)參考具體實施方案和參考特定附圖描述，但是本發(fā)明不限于此，本發(fā)明僅被權(quán)利要求限定。權(quán)利要求中的任何參考標(biāo)識不應(yīng)解釋為限制范圍。所述附圖僅是示意性和非限制性的。在附圖中，一些元件的大小可被放大，并且按比例繪制以用于說明性目的。當(dāng)本說明書和權(quán)利要求使用術(shù)語“包括”時，其不排除其他要素和步驟。當(dāng)提及單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“一”或“其”(“a”或“an”，“the”)時，這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非另有特別說明。另外，在說明書和權(quán)利要求中術(shù)語第一、第二、第三和類似術(shù)語用于區(qū)別相似的要素而對描述連續(xù)的或時間順序是非必要的。應(yīng)理解的是如此使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中是可互換的，本文中所描述的本發(fā)明的實施方案能夠以其它而非本文中描述或舉例的順序進行。以下術(shù)語或定義單獨提供以幫助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)解釋為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的范圍。如本發(fā)明所用的“(微)載體”涉及顆粒，優(yōu)選固體顆粒，具有直徑0. 1-1000微米。 同義詞是“(微)珠”、“(微)顆?！被颉?微)球”或“納米線”。微珠的形狀被認(rèn)為是本發(fā)明的限制。如本發(fā)明所用的“俘獲探針”涉及寡核苷酸分子(或其部分)，其特定地結(jié)合互補核苷酸序列。如本發(fā)明所用的“編碼的”涉及微載體的可檢測性質(zhì)、例如跳，圖案，字母數(shù)字信息)，其允許將一種微載體與另一種微載體區(qū)別。在其最簡單的意思中，其指兩種微載體的區(qū)別。如本發(fā)明所用的“代碼”(“代碼”)指微載體上的設(shè)備可讀代碼，確保至少100、250、 500,1, 000,2500,5000或10，000的復(fù)雜度。由聚合酶依賴的核苷酸參入或連接酶依賴的寡聚體添加測定的DNA序列還稱為“序列閱讀”。核酸通常為DNA，但是方法也可應(yīng)用于RNA (例如信使RNA (mRNA)或微RNA)，其也可與寡核苷酸俘獲探針雜交并可使用基于逆轉(zhuǎn)錄酶的方法被轉(zhuǎn)換成DNA。在這些方法中，俘獲寡核苷酸探針可用于步驟c)作為DNA聚合酶的測序引物。本發(fā)明涉及雜交和DNA測序方法。根據(jù)本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何測序方法， 包括基因組的構(gòu)象測序以測定物種的株(具體)和世系(race)之間的基因多樣性，或基因組的肩關(guān)測序。具體實施方案指單個的哺乳動物(特別是人)基因組的測序以鑒定個體的 SNP。樣品和核酸片段化
通過使用本發(fā)明的方法可以對全基因組DNA選擇的部分進行測序?？蛇x地，碰例如分離個別染色體或經(jīng)由資/貪脈沖場電泳分離片段來部分純化樣品。在與微載體孵育之前，基因組DNA被片段化至選擇的長度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將樣品基因組DNA片段化，遞送在80—1000個核苷酸的選擇的范圍中的片段，但是優(yōu)選長度取決于俘獲探針的選擇的長度，并通常長于俘獲探針的長度。片段可以使用物理方法獲得(例如超聲處理，物理剪切)。DNA片段也可使用限制酶(或不同的限制酶的組合)獲得，其提供具有確定長度的可預(yù)測的和可重復(fù)的片段混合物。片段的平均長度可以通過選擇短識別位點(導(dǎo)致大量的短片段)或長識別位點(導(dǎo)致少量的短片段)或組合被調(diào)整。當(dāng)使用具有已知的參考基因組序列的全基因組DNA樣品時，使用限制酶使得對片段長度和片段末端序列的精確預(yù)測。這使得可預(yù)測在雜交的探針的3’和5’端未雜交的序列的長度，其在探針3’端的部分可被測序以產(chǎn)生序列閱讀?？蛇x地，RNA可用作樣品。RNA可以使用基于逆轉(zhuǎn)錄酶的方法被轉(zhuǎn)換成DNA。轉(zhuǎn)換后，樣品可以如任何其他DNA序列被處理。微載體
本發(fā)明所用的微載體由使得寡核苷酸“俘獲探針”結(jié)合到微載體上的材料制成或用這種材料官能化。寡核苷酸與微載體的偶聯(lián)是本領(lǐng)域熟知的。該偶聯(lián)可以是不可逆或可逆的(例如通過硫醇基、酸性基團或不穩(wěn)定的堿性基團)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，(并且這與微陣列技術(shù)相反)，俘獲探針不被基質(zhì)上的它的坐標(biāo)(co-ordinate)鑒定但是被微載體的代碼或性質(zhì)鑒定。結(jié)果，具有俘獲探針的編碼的微載體可以在所述方法的至少一個步驟或甚至全部步驟中存在。如本發(fā)明所用的微載體可在形狀、大小、多孔性、材料和其他特征上變化，取決于對在其中進行根據(jù)本方法的測序方法的測定或設(shè)備的要求。如本發(fā)明所述的方法可以在存在不具有或具有改裝的測序裝置的情況下進行。因此，直徑約1 Mm或約40Mm的微載體分別適于ABI固體測序和‘妨4’ 測序。在某些實施方案中，顆粒具有允許在微流設(shè)備中操作顆粒的大小和形狀。微載體可具有電荷以允許在電場中操作。
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在其他實施方案中，載體是磁性的或可磁化的顆粒，其允許在磁場中操作、旋轉(zhuǎn)或定位。在其他實施方案中，顆粒使用光鉗定位和/或操作。如本發(fā)明所用的微載體進一步包括代碼，其允許多個載體中鑒定單個的載體。載體的編碼在多路方法中是長期已知的，其中載體用具有不同的吸收或發(fā)射最大值的發(fā)色 、例如標(biāo)記官能化。例如Luminex (Austin，Texas)提供微載體，包含不同濃度的兩種染料，導(dǎo)致100種不同的混合。編碼的較高復(fù)雜度可通過使用資/貪量子點獲得，使用10強度水平和6種顏色允許直至一百萬的復(fù)雜度。在具體實施方案中，高復(fù)雜度可通過使用通過使用非發(fā)色條碼方法獲得，允許大于100000，大于一百萬或甚至直至一千萬或一億的的復(fù)雜度。不同類型的條碼是本領(lǐng)域已知的和包括使用無線射頻標(biāo)簽的電子條碼、激光蝕刻條碼、金屬納米棒(Jain K. (2003) Expert Rev Mol Diagn. 3，153-161; Lehmann (2002) Nature Materials b 12~13； Braeckmans 等人(2002) Nature review, drug discovery 1,447-448所綜述的)。在金屬納米棒中，條碼提供不同的材料獲得，其用于制造載體。在具體實施方案中，條碼是具有任何幾何學(xué)、設(shè)計或符號的小型化可讀代碼，其可在表面上寫入或甚至在微載體中或在其上讀出的。例如，代碼可以被寫為數(shù)字或字母，或?qū)憺橐源a符號、圖片、條碼、環(huán)碼或三維代碼的形式的代碼。環(huán)代碼類似條碼，除了使用同心圓而不是直線?？蛇x地，二維模式用于代表代碼。在具體實施方案中，使用經(jīng)由熒光顆粒的部分光漂白在微載體上或其內(nèi)寫入的條碼獲得高復(fù)雜度。該過程允許在顆粒上寫入符號、線、數(shù)字等。線模式可以在微載體上寫入，以使獲得可以通過光學(xué)設(shè)備閱讀的條碼模式。微載體的空間選擇光漂白在 Braeckmans 等人(2003) Nature Materials 2，169—173 和 Serveaux (2007) Langmuir0 25 10272-10279中詳述。條碼可以在微載體上幾次寫入，允許閱讀條碼而與微載體的方向無關(guān)。在另一個具體實施方案中，微載體還包含磁性材料，其允許顆粒的磁性操作。這類顆粒的制備在專利申請W02007115815.EP1346224和W00063695中詳述。富集和雜交
基于參考基因組(在人樣品的情況下，人基因組)選擇寡核苷酸的序列，目的是能夠從片段化全基因組DNA樣品俘獲DNA片段。俘獲片段來自與俘獲探針相同的基因組位置，以使3’來自俘獲探針的序列可以使用俘獲DNA片段作為模板測序。隨后，鑒定微載體上的代碼使得鑒定俘獲探和結(jié)合俘獲探針的DNA片段的相關(guān)基因組位置，而不需測定該寡核苷酸自身的序列。這允許俘獲DNA片段的測序的部分與來自人基因組(或任何其他參考基因組，如果樣品是非人來源的)的參考基因組序列的直接比對。本發(fā)明的方法包括將包含片段化基因組的DNA樣品與多個不同的寡核苷酸俘獲探針雜交的步驟，其中多個相同俘獲探針連接到單個編碼的微載體。根據(jù)一個實施方案，基于已知的參考序列設(shè)計寡核苷酸，以覆蓋染色體的區(qū)域、整個染色體或甚至生物的整個基因組。在具體應(yīng)用中，寡核苷酸被設(shè)計成在距用于片段化樣品的限制酶的切割位點的確定距離雜交。在該實施方案中，不僅可預(yù)測因此俘獲的DNA片段的測定的序列，而且可預(yù)測測定的序列的長度直到到達片段末端，因此提供測定的序列在參考基因組序列中的位置的 fn息ο可選地，使用寡核苷酸的文庫，其與研究的DNA樣品的DNA序列無關(guān)。與方法無關(guān)， 在設(shè)計一組探針的過程中要注意的是這組不包括彼此互補的探針對。例如，在變性和隨后與DNA片段退火的過程中微載體被暫時操作和定位在表面上以使兩個互補探針之間不可能雜交?？蛇x地，產(chǎn)生不同的探針限定組，其不成對雜交。進行用在編碼的微載體上的第一組探針進行與片段化DNA的雜交(選擇的DNA片段的富集)。在分離結(jié)合和未結(jié)合的DNA 后，未結(jié)合的DNA再次與在類似的編碼的微載體上的第二組探針雜交。可以重復(fù)該過程直到所有探針與樣品中相應(yīng)DNA片段雜交。雜交后，所有雜交的樣品DNA片段可以結(jié)合在一起并進一步平行處理。在本發(fā)明的方法中，存在這種可能性當(dāng)大量收集的不同的探針與DNA樣品雜交時，兩種(或多種)不同的探針在單個DNA片段的不同位置雜交。在這種情況下，DNA片段將攜帶兩種(或多種)不同的代碼和隨后這類顆粒的測序?qū)a(chǎn)生多個信號。不同的探針結(jié)合同一 DNA片段的機會可以通過使用不同的限制酶或剪切條件增加探針的長度和/或降低DNA片段的平均長度來最小化。俘獲探針可以是具有不同長度，通常長于用于所謂基于陣列的測序的長度，其中測序基于DNA片段的差異雜交，其優(yōu)選結(jié)合完全一致的雜交探針。較長的俘獲探針借助于部分雜交促進俘獲DNA片段，其中允許俘獲探針和DNA片段之間的錯配，但是與測序閱讀不相關(guān)。俘獲寡核苷酸與DNA雜交的長度可從約15直至30，40，60，75，90或150或200 個核苷酸變化。俘獲探針優(yōu)選地超過40個核苷酸長。除了寡核苷酸的雜交部分，俘獲探針可包括另外的寡核苷酸或其他分子，其發(fā)揮微載體和雜交部分之間的間隔區(qū)的功能。探針的雜交部分越長，樣品中發(fā)生的互補序列頻率越低，但是DNA片段的俘獲更具選擇性，而同時允許錯配，原因在于存在的不干擾俘獲的未知的突變(特別是在癌癥基因組樣品中)。俘獲探針可以是在5’和3’結(jié)合微載體表面，但是如果選擇是用于隨后聚合酶擴增反應(yīng)或使用俘獲探針作為引物和使用聚合酶通過合成測序反應(yīng)，俘獲探針用其5’末端偶聯(lián)到微載體表面。具有偶聯(lián)的俘獲寡核苷酸的微載體根據(jù)用于基因組富集的標(biāo)準(zhǔn)方法與片段化的 DNA樣品孵育，如所述的，經(jīng)歷足夠時間(例如3天，優(yōu)選地M小時，甚至更優(yōu)選地在180 分鐘下)以通過與俘獲探針特異性雜交特定地俘獲足夠量的DNA片段。在一個實施方案中，該雜交階段發(fā)生在微流體設(shè)備中，其中雜交動力學(xué)被最優(yōu)化， 并且用于最佳俘獲所需的時間減少。不同的探針結(jié)合同一 DNA片段的機會可以通過使用不同的限制酶或剪切條件增加探針的長度和/或降低DNA片段的平均長度來最小化。片段和探針之間的比值是靈活的，取決于測序俘獲片段的方式。在用在一個載體上的同種類型的俘獲片段作為引物直接測序多個俘獲片段的情況下，俘獲探針的占有率要求較高，接近1:1或1:2。這對在測序反應(yīng)過程中增加信號是必要的。這與當(dāng)在之間進行涉及擴增俘獲片段的PCR步驟相反。在直接單個分子測序的情況下，俘獲片段應(yīng)充分分離的，以能夠檢測單個的分子測序反應(yīng)，例如在單個微載體上的一個俘獲片段。雜交后，選擇反應(yīng)條件、DNA樣品的濃度和寡核苷酸俘獲探針以獲得所期望的對于微載體的探針占有率，例如高占有率或低占有率。在一個實施方案中，選擇反應(yīng)條件、DNA樣品的濃度和寡核苷酸俘獲探針以使統(tǒng)計學(xué)上僅一個DNA片段結(jié)合具有探針的微載體，因為微載體應(yīng)通常地在其表面攜帶多個相同探針?？蛇x地，修改微載體的制備以在每個微載體上具有一個探針的最大值。雜交后，去除未結(jié)合DNA可以如下進行通過操作雜交反應(yīng)室外的編碼的微珠，或通過將微載體固定到反應(yīng)室中的位置，然后進行一個或多個洗滌步驟以去除未結(jié)合DNA。在某些實施方案中，可以分選微載體群并可集合具有相同代碼的同種載體。在該階段，雜交的DNA可保持連接到探針和微載體并且在方法的剩余過程中被一起處理。在可選的方法中，雜交的DNA可保持連接到探針，而探針從微載體上釋放，例如通過減少連接探針與載體的二硫橋。在從一組具有相同代碼的同種載體釋放俘獲DNA片段后，保持它們基因組位置上的信息。測序該選擇的片段集合(pool)顯示DNA閱讀，其在基因組上的位置是已知的。 相同的分選和集合步驟可以用于具有特定代碼的微載體的所有其他組。測序反應(yīng)
所述方法的以下步驟包含測定已與俘獲探針雜交的單個DNA片段的序列。本文中，已在雜交方法中用于俘獲探針的相同寡核苷酸任選地發(fā)揮作為測序引物的功能。在測序方法的過程中，在參入一個或多個核苷酸后，測定參入的序列并測定微載體上的代碼。單個分子測序
在一個實施方案中，在俘獲后，俘獲的片段被直接和單獨地測序。用于單個分子測序方法的特別適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)法使用熒光標(biāo)記的核苷酸，使用FRET進行(例如資/貪由Visigen商業(yè)化的)。本文工程化的DNA聚合酶含有供體熒光團，四種不同顏色受體熒光團之一連接各個的核苷酸的Y磷酸。當(dāng)核苷酸被參入時，鄰近性引起FRET信號。DNA分子激發(fā)(lights up)且顏色顯示堿基同一性，因為核苷酸上的熒光團是具有顏色代碼的。每一次核苷酸參入，含有熒光團的焦磷酸被釋放以使合成的新生鏈?zhǔn)翘烊籇NA，并且在下一個核苷酸可被參入之前，不需要另外的處理。此處，光學(xué)檢測檢測每個俘獲的DNA片段上核苷酸的參入。在可選的具體實施方案中，使用可逆染料終止劑方法，如Ju等人Q006) Proc Natl. Acad. Sci. 103，19635-19640所述。與常規(guī)測序方法相反，僅使用終止劑核苷酸， 其各個具有不同的熒光標(biāo)記，以使僅一個核苷酸可以通過DNA聚合酶參入。測定參入核苷酸的性質(zhì)并去除終止劑基團和熒光基團。之后，可以進行另外的測序步驟。肓接測序
在一個實施方案中，在俘獲后對俘獲的片段直接測序，并且對組合的信號光學(xué)檢測。此處，存在足夠的俘獲片段以能夠在測序反應(yīng)過程中檢測各個核苷酸的參入，其中信號由一個微載體上多個俘獲探針同時發(fā)生的測序反應(yīng)構(gòu)成。這是最適于非癌癥基因組DNA樣品的測序，如用于臨床遺傳學(xué)診斷，其中期望在DNA片段混合物中的兩個等溫基因的最大量。基于乳液
在具體實施方案中，在乳液中的一個或多個步驟過程中存在編碼的微載體，所述乳液發(fā)揮作為反應(yīng)室(小反應(yīng)器(picoreactor))反應(yīng)的功能，資/貪用于進行基于PCR的擴增反應(yīng)。在這些乳滴擴增方法中，微載體保持存在以保留俘獲探針的序列信息。相同地，在從微載體去除DNA的應(yīng)用中，微載體保持在同一乳滴/微孔中以避免微載體上的編碼的信息丟失。具有俘獲探針的編碼的微載體與油中的基因組DNA片段混合以產(chǎn)生乳液。選擇不同成分的濃度以使具有俘獲探針的單個編碼的微載體和單個DNA片段和擴增試劑最后一起存在于乳液中的每個乳滴小反應(yīng)器中。當(dāng)使用磁性顆粒時，它的磁性性質(zhì)可以用于運輸和操作乳液滴和排列顆粒。珠可以單獨操作，其使用它們磁性能力和微流性質(zhì)以運輸它們。 在這種情況下，在隨后步驟中，可以添加擴增和測序成分。本文中，珠是彼此分離且固定的以達到可以檢測單個的微載體測序反應(yīng)的程度。通常地，保持較低溫度以防止測序作用開始直到準(zhǔn)備檢測。乳滴以行或格子排列，然后通過增加溫度以啟動聚合酶，在一滴中開始測序反應(yīng)，接著在下一滴中進行。多個檢測器可以高通量方法以這種方式使用。通常地，在測序反應(yīng)中，具有俘獲探針的編碼的微載體與油中的基因組DNA片段混合以產(chǎn)生乳液。選擇不同成分的濃度以使具有俘獲探針的單個編碼的微載體和單個DNA 片段和擴增試劑最后一起存在于乳液中的每個乳滴小反應(yīng)器中。當(dāng)使用磁性顆粒時，它的磁性性質(zhì)可以用于運輸和操作乳液滴和排列顆粒。珠可以單獨操作，其使用它們磁性能力和微流性質(zhì)以運輸它們。在這種情況下，在隨后步驟中，根據(jù)特定測序化學(xué)法(資/貪焦磷酸測序)的要求，可以添加測序成分并洗掉。本文中，珠是彼此分離以達到可以檢測單個的測序反應(yīng)的程度。在另一可選的具體實施方案中，使用所謂“焦磷酸測序”或“454”測序方法的修改形式(US7211390和US 6956114)。在現(xiàn)有技術(shù)方法中，DNA片段經(jīng)由一種類型的接頭分子連接到一種類型的微載體(參見圖1A)。這些載體是單個地分配到乳滴中并設(shè)置在基質(zhì)上的孔中。孔含有用于測序反應(yīng)的必需的試劑和酶(聚合酶、硫酸化酶和螢光素酶)并作為分離的反應(yīng)室。在測序反應(yīng)過程中，DNA核苷酸以試劑流順序添加到樣品中。每次參入一個核苷酸，硫酸化酶和螢光素酶通過發(fā)出光信號報告這次參入。因此從通過在珠上合成的測序?qū)ｉT地獲得測序信息。在本發(fā)明的一個實施方案中，DNA片段經(jīng)由雜交編碼的微載體上的俘獲探針而連接(圖1B)。在該變體中，通過焦磷酸測序技術(shù)獲得的序列信息可以與通過測定微珠的代碼的探針的序列信息組合。這些代碼可以是在測序反應(yīng)之前測定的，或?qū)τ谀切┓磻?yīng)僅提供足夠測序信號的反應(yīng)可以在測序反應(yīng)后閱讀。除了聚合酶依賴的測序，本發(fā)明的方法也可用其他測序方法例如DNA連接酶依賴的寡核苷酸的退火進行，如^iendure等人Q005) Science 309，1728-1732所述的。微載體的處理
取決于測序方法，微載體定位在基質(zhì)(檢測區(qū)域)上用于檢測參入序列和鑒定編碼的微載體，例如在微型孔中。定位可以不同的方式發(fā)生例如重力或離心，經(jīng)由電勢原因在于載體中的電荷或利用連接到微載體的DNA的電荷。在具體實施方案中，使用磁場將微載體操作至檢測區(qū)域。根據(jù)另一實施方案，使用泵、電滲法、經(jīng)由電鉗的操作或經(jīng)由磁場的操作，將微載體操作在微流系統(tǒng)中。一旦微載體在檢測室中通過，發(fā)生檢測。任選地，微載體在磁場和/ 或電場中定位和/或旋轉(zhuǎn)以使顆粒束縛(caged)足夠長得時間進行檢測。在具體實施方案中，其中使用部分光漂白得磁性顆粒，這些微載體被定位和旋轉(zhuǎn)以允許在微載體的代碼的光學(xué)檢測(資/貪條碼或發(fā)色標(biāo)記)。檢測步驟
在如本發(fā)明所述的方法中，發(fā)生兩個不同的檢測步驟
第一檢測步驟包含鑒定微載體的代碼(資/貪條碼的光學(xué)檢測)，其提供俘獲探針的序列，所述俘獲探針已用于雜交來自樣品的核酸例如DNA和任選地已用作序列引物。第二檢測步驟包含檢測雜交微載體的核苷酸片段的序列。這些檢測步驟的順序也可顛倒。如上所述的可逆染料終止劑測序方法通常允許測定DNA分子的約30個核苷酸。 當(dāng)多態(tài)性發(fā)生在這類短片段中時，這可能容易被忽視，并且當(dāng)具有多態(tài)性的序列序列在基因組的另一部分中作為野生型存在時，其變得未被注意到。從俘獲探針獲得的另外序列的存在允許測定在基因組上的測序的閱讀的位置，從而避免這類問題。在這類情況下，其中測定的序列與基因組不同位置存在的序列高度相似或相同， 鄰近測定的序列的引物序列顯著增加樣品中DNA片段的信息量并且增加解釋實驗測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。相同地，具有測序錯誤的短片段可具有與位于基因組的另一部分處的序列精確的匹配，導(dǎo)致例如不正確序列組裝等問題。任選地，序列信息的第三部分獲自測定的序列的長度?；诜@探針在序列和用于制備的限制酶中的位置，可能的是確定由用于進行測序的DNA聚合酶產(chǎn)生的DNA的長度。通過測序獲得的序列長度的測定表明限制位點是否在預(yù)測的位置。當(dāng)使用限制酶切割 DNA時應(yīng)用其，且繼續(xù)測序反應(yīng)直到DNA片段的末端。如本發(fā)明所述的方法具有多種優(yōu)勢性質(zhì)。探針的設(shè)計允許僅測定序列的目的部分。如本發(fā)明所述的方法允許快速和r可信的SNP/突變檢測和結(jié)構(gòu)DNA變化，例如拷貝數(shù)變化和重排，并避免由重復(fù)序列或假基因引起的錯誤和由隨后測序過程引入的錯誤。分析 DNA測序閱讀結(jié)果所需的時間將顯著減少，因為至少一部分的序列，或甚至測序閱讀在基因組上的的位置是已知的。另外，進行數(shù)據(jù)分析的硬件要求因此顯著降低，以使分析可再標(biāo)準(zhǔn)個人計算機上進行。本發(fā)明的方法的進一步優(yōu)勢是例如提高的速度，稱為經(jīng)由閱讀代碼對俘獲探針的序列的鑒定比測序探針本身快得多。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備
本發(fā)明另一方面涉及用于進行上述DNA測序方法的設(shè)備。這類設(shè)備包含微載體操作部件，用于將俘獲探針與核酸雜交的部件，用于鑒定退火至俘獲探針的DNA片段(之前)的序列的序列測定部件和用于測定微載體上代碼(其鑒定連接的俘獲寡核苷酸探針)的部件。雜交部件通常是反應(yīng)室，其中核酸樣品(通常為DNA)與編碼的微載體上的寡核苷酸俘獲探針接觸。該反應(yīng)室含有元件以可控方式改變溫度用于變性和退火樣品。雜交部件任選地包含進口用于施加或去除核酸樣品、緩沖劑、試劑、寡核苷酸俘獲探針。緩沖劑等的替換可以通過液體洗滌步驟進行或可以通過將寡核苷酸載體操作至設(shè)備的另一部件來進行，例如通過磁性操作磁性微載體。根據(jù)一個實施方案，雜交部件還在雜交前使用，用于用一種或多種限制酶片段化
11DNA樣品。序列測定部件包含反應(yīng)室，其中進行由DNA聚合酶參入核苷酸，和檢測室，其中進行鑒定參入的核苷酸。在測序部件的特別配置中，反應(yīng)和檢測發(fā)生在同一室，例如具有透明部分的反應(yīng)室。本文中，微載體被設(shè)置在表面上或孔中用于檢測參入的核苷酸，所述微載體在單分子測序的情況下含有一個DNA片段或可選地攜帶多個相同片段(作為基于載體PCR 克隆步驟的結(jié)果)，其中載體上的片段是相同的。然后釋放微載體用于進一步測序反應(yīng)。在另一特別配置中，測序部件包含反應(yīng)室，其與檢測部件分離(洶義/^|存檢測器的微流通道)。在反應(yīng)后，微載體經(jīng)由微流操作或電操作被操作至檢測部件。在具體實施方案中，其中磁性顆粒使用，微載體的操作通過施加磁場進行。設(shè)備進一步包含代碼測定部件。取決于微載體上的代碼和參入核苷酸的性質(zhì)，檢測部件(其用于測定序列)也可用于鑒定微載體上的代碼。例如，四種不同的熒光標(biāo)志物用于標(biāo)記測序核苷酸和以不同強度的第五種熒光標(biāo)記物用于標(biāo)記微載體。在另一實施方案中，兩種不同的檢測器在同一檢測區(qū)域使用，其中第一檢測器測定DNA序列，之后第二檢測器測定微載體上的代碼(事件的這種順序可以是等同顛倒的)。在另一實施方案中，微載體在微流設(shè)備中操作，其中通過第一檢測器在流體設(shè)備的第一位置測定序列和通過第二檢測器在流體設(shè)備的第二位置測定微載體上的代碼。設(shè)備的不同室和檢測器是本領(lǐng)域已知的。磁性顆粒的操作已在例如美國申請 US20080314749中詳述。測序方法和設(shè)備由資/貪Ilumina，Applied Biosystems和Roche公開。用于操作載體的方法和設(shè)備已描述在例如PCT申請W00470362中。本發(fā)明涉及雜交和DNA測序的方法和設(shè)備。利用參考基因組包括人基因組的序列的公眾可獲得的信息。根據(jù)本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何測序方法，但是在腫瘤學(xué)診斷領(lǐng)域還在臨床遺傳學(xué)和微生物學(xué)中是特別有用的。高度相關(guān)的臨床應(yīng)用是癌癥基因組選定部分的測序，其含有大量還未知的DNA異常，對于各個測序的腫瘤是不同的，象例如單個或多個核苷酸突變、缺失和擴增、倒位和染色體重排?！?amp;不通過陣列上雜交的測序資衍，板具有每種單個俘獲探針的情況下，一個序列閱讀的一個核苷酸可被測定，并且俘獲探針和被俘獲的DNA片段之間的精確互補性是至關(guān)重要的(不允許錯配)以使得一個測序閱讀的組裝；在上述癌癥測序的情況下，在俘獲探針中太多的突變要求能夠測序癌癥基因組的足夠的部分。在此處所述的本發(fā)明中，俘獲探針足夠長以允許結(jié)合結(jié)合含有一個或多個錯配的 DNA片段，而隨后，測序包含至少2個核苷酸的俘獲片段序列的未知部分，在俘獲片段的雜交的部分的5’第一個核苷酸起始。這能夠測序多個未知的突變。但是除了該應(yīng)用，本發(fā)明也可用于其他診斷應(yīng)用，例如用于測序基因組的(大)部分，用于臨床遺傳學(xué)或用于病原體測序。本發(fā)明特別適于測序從生物樣品(象例如癌癥活檢)分離的細(xì)胞的全基因組中選擇的片段。相反，ifiiA^Ti^^·游適于測序一種或至多有限數(shù)量的確定PCR產(chǎn)物，并且不能測序獲自片段化全基因組的DNA片段。具體化本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他排列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。應(yīng)理解的是雖然優(yōu)選實施方案、具體構(gòu)造和配置以及材料已在本文中討論用于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備，但是可以進行在形式和細(xì)節(jié)上的各種變化或修改而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。
權(quán)利要求
1.一種用于測定靶核酸分子的序列的方法，所述方法包括以下步驟a)提供與編碼的微載體連接的俘獲寡核苷酸探針，其中所述微載體的代碼鑒定所述寡核苷酸探針的序列和/或其在參考基因組上的位置，b)將所述俘獲寡核苷酸探針與包含核酸分子的樣品雜交，其中所述核酸分子包含至少部分與俘獲寡核苷酸探針的序列互補的序列，c)通過產(chǎn)生至少2個核苷酸的序列閱讀，測定步驟b)的雜交的核酸分子的序列，d)測定微載體上的代碼，e)鑒定與如步驟d)中所測定的微載體上的代碼相對應(yīng)的俘獲寡核苷酸探針的核苷酸序列以及其在參考基因組上的位置，f)將步驟c)中測定的序列信息與步驟e)中鑒定的信息組合以測定靶核酸分子的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸分子包含至少2個核苷酸探針序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項的方法，其中所述編碼的微載體在所述方法的一個或多個步驟中處于懸浮液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中使用多個不同編碼的微載體，以及其中每個代碼對應(yīng)于俘獲寡核苷酸探針的唯一序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所述微載體是磁性顆?；驇щ婎w粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中利用俘獲探針作為測序引物進行測序反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中在微載體緊密接近處之上或之中克隆擴增后進行測序反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其中在步驟d)中編碼的載體的代碼用光學(xué)方法測定。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中所述核酸樣品是用限制酶片段化的基因組 DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其中俘獲寡核苷酸探針的長度是40-200個核苷酸。
11.一種用于測定核酸樣品的序列的設(shè)備，所述設(shè)備包含用于將俘獲探針與核酸退火的部件，用于測定DNA分子的序列的部件，用于操作微載體的部件和用于測定微載體的代碼的部件。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的設(shè)備，其是微流設(shè)備。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的設(shè)備，其中所述用于操作微載體的部件包含用于施加至少一個磁場的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測定靶核酸分子的序列的方法。本文中俘獲寡核苷酸探針與編碼的微載體連接，其中所述微載體的代碼鑒定所述寡核苷酸探針的序列。將俘獲寡核苷酸探針與包含核酸分子的樣品雜交，其中所述DNA片段包含與俘獲寡核苷酸探針的序列互補的序列。測定DNA分子的序列，其中俘獲寡核苷酸探針用作DNA聚合酶的引物，在單一分子測序的情況下，其是測序引物。序列測定后，俘獲寡核苷酸探針的核苷酸序列通過測定對應(yīng)于俘獲寡核苷酸探針的微載體上的代碼來鑒定。該序列信息直接鑒定測序的DNA片段在基因組上的位置，允許直接比對。
文檔編號C12Q1/68GK102333890SQ201080009514
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者范 德 斯托爾普 A., M. J. 鄧 圖恩德 J., J. 范 德 扎格 P. 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司