專利名稱：一種腎功能不全治療用的自體干細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是干細(xì)胞及其制備方法，具體地說是一種腎功能不全治療用的脂肪 來源的自體干細(xì)胞及其制備方法。
背景技術(shù)：
腎功能不全(renal insufficiency)是由多種原因引起的，腎小球嚴(yán)重破壞，使身 體在排泄代謝廢物和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)、酸堿平衡等方面出現(xiàn)紊亂的臨床綜合癥后群。分為急 性腎功能不全和慢性腎功能不全。腎功能不全可分為四期一期腎功能儲備代償期；二期 腎功能不全期；三期腎功能衰竭期；四期尿毒癥期或腎功能不全終末期。其是世界公認(rèn)的 疑難頑癥，預(yù)后嚴(yán)重，是威脅生命的主要病癥之一。尿毒癥被稱為第二癌癥，是各種慢性腎 病腎功能惡化、衰竭的終末階段。目前對腎病的治療，包括早期的激素，免疫抑制劑和抗菌 素治療及病情后期的透析與換腎，方法雖可行，但長期持續(xù)的透析只能是維持，達(dá)不到治療 的目的，因欠缺器官捐贈致使換腎機(jī)會可能遙遙無期，而腎移植成功率目前還不太高，排異 現(xiàn)象目前還難以徹底解決，且費(fèi)用昂貴，給患者帶來較大的心理壓力和經(jīng)濟(jì)壓力。只是在病 人腎衰竭嚴(yán)重時，用透析治療或腎臟移植來維持病人的生命。近來，對于干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞對許多疾病的獨(dú)特療效逐步受到重視。 干細(xì)胞療法是利用干細(xì)胞的自我復(fù)制和分化潛能來替代、修復(fù)患者受損的細(xì)胞，恢復(fù)受損 器官、組織的正常功能。干細(xì)胞療法就像給機(jī)體注入新的活力，是從根本上治療許多疾病的 有效方法，是傳統(tǒng)療法無能為力的“不治之癥”的新療法和新希望，是目前疾病治療的新遠(yuǎn)
旦
ο雖然胚胎干細(xì)胞在理論上具有很高的評價，但在宗教和倫理上有著潛在的限制。 成體干細(xì)胞是存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新并且具有 多向分化潛能。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中，來源廣泛，取材方便，且沒有胚 胎干細(xì)胞所涉及的倫理問題，已成為普遍研究和應(yīng)用的對象。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前應(yīng) 用最多的種子細(xì)胞，然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的采集獲得又常常需麻醉后，進(jìn)行骨髓穿刺， 會給患者帶來痛苦，且麻醉會引起意外，而且采集量有限。近年來也有采用外周血干細(xì)胞進(jìn) 行治療的報導(dǎo)，雖然采集容易，但是外周血中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極少，不是十分理想的選 擇。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ASC)是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干 細(xì)胞。由^ik等于2001年首次從人抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中分離獲得，在體外培養(yǎng) 中保持著穩(wěn)定的生長增殖活性，而且和間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能，可向脂肪、成 骨、軟骨、成肌、神經(jīng)元等多向分化，并且它的獲取比常用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞容易且量大， 具有重復(fù)性，給患者帶來的痛苦很小。ASC體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，擴(kuò)增速度快。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞、多功 能干細(xì)胞。具有自我自我分化和增值能力，能定向歸巢。內(nèi)皮祖細(xì)胞有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞再生 和促進(jìn)血管再生的功能。
然而，干細(xì)胞的應(yīng)用都不可避免地面對一個關(guān)鍵問題，即異體應(yīng)用時干細(xì)胞的免 疫排斥反應(yīng)。而患者自身來源的干細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增、定向誘導(dǎo)分化后再回輸?shù)襟w內(nèi)的一對 一個性化治療，可以克服異體的排斥反應(yīng)。因而ASC可為多種疾病的治療提供充足的種子 細(xì)胞。目前國內(nèi)外尚無應(yīng)用誘導(dǎo)分化的ASC移植治療腎功能不全的文獻(xiàn)報道。因此，開發(fā) 用于治療腎功能不全的干細(xì)胞及其制備方法具有特別重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服腎功能不全常規(guī)治療方法的缺陷，提供一種腎功能不全 治療用的干細(xì)胞及其制備方法。本發(fā)明涉及的干細(xì)胞采取的技術(shù)方案為從患者腹部或者臀部抽吸脂肪組織，分 離提純、擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASC)，誘導(dǎo)分化成治療腎功能不全用的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。本發(fā)明涉及的腎功能不全治療用自體干細(xì)胞及其制備方法包括以下步驟
a、在無菌條件下從患者腹部或者臀部抽吸脂肪組織，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次去除 紅細(xì)胞和其它細(xì)胞碎片后，剪碎，加入2 3倍體積的含0. 075% 0. 1% I型膠原酶的PBS 緩沖液，37°C水浴中充分振蕩消化30min以上。b、而后加入等量的含10%自體血清或人AB血清的DMEM培養(yǎng)液中和膠原酶， IOOOrpm離心lOmin，去除漂浮的脂肪細(xì)胞和上清液，獲得的細(xì)胞沉淀加入14(Tl80mM NH4Cl 的PBS緩沖液重新懸浮，室溫靜置IOmin裂解紅細(xì)胞后，IOOOrpm離心IOmin棄去上清液，獲 得細(xì)胞沉淀。C、獲得的細(xì)胞沉淀經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，用含10%自體血清或人AB血清、100U/mL 青霉素、100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸，以約104/cm2密度接種至IOOmm培養(yǎng)皿中， 在37°C、5%C02、飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后首次換液；待細(xì)胞生長至80%以上 融合時，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例傳代。d、選取第2 4代的細(xì)胞，用0. 25%胰酶/EDTA消化后，接種在含1 lOng/mL人 重組血管內(nèi)皮生長因子(hrVEGF)，0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自 體血清或人AB血清的X-vivo-15培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 4d，誘導(dǎo)分化成腎功能不全治療用的 自體干細(xì)胞(EPC)。本發(fā)明具有如下突出特點(diǎn)
1、按照本發(fā)明提供的制備方法，可以從自體脂肪組織中分離提純、擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪干細(xì) 胞(ASC)，并且將其誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。2、按照本發(fā)明提供的制備方法制備的干細(xì)胞可用于腎功能不全患者的治療。脂肪 來源的干細(xì)胞具有獲取容易，安全簡便，痛苦小，并且體外增殖速度快，可獲取足夠的細(xì)胞 用于移植等優(yōu)點(diǎn)；自體移植克服異體的排斥反應(yīng)，本發(fā)明制備的干細(xì)胞回輸治療腎功能不 全患者時，治療效果明顯、安全性好、無明顯毒副作用和不良反應(yīng)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明
a、在無菌條件下從患者腹部或者臀部抽吸脂肪組織，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次去除 紅細(xì)胞和其它細(xì)胞碎片后，剪碎，加入2 3倍體積的含0. 075% 0. 1% I型膠原酶的PBS
4緩沖液，37°C水浴中充分振蕩消化30min以上。b、而后加入等量的含10%自體血清或人AB血清的DMEM培養(yǎng)液中和膠原酶， 1000rpm離心10min，去除漂浮的脂肪細(xì)胞和上清液，獲得的細(xì)胞沉淀加入140~l80mM NH4Cl 的PBS緩沖液重新懸浮，室溫靜置IOmin裂解紅細(xì)胞后，1000rpm離心10min棄去上清液，獲 得細(xì)胞沉淀。C、獲得的細(xì)胞沉淀經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，用含10%自體血清或人AB血清、100U/mL 青霉素、100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸，以約104/cm2密度接種至IOOmm培養(yǎng)皿中， 在37°C、5%C02、飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后首次換液；待細(xì)胞生長至80%以上 融合時，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例傳代。d、選取第2 4代的細(xì)胞，用0. 25%胰酶/EDTA消化后，接種在含1 10ng/ mL hrVEGF, 0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自體血清或人AB血清的 X-vivo-15培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 4d，誘導(dǎo)分化成腎功能不全治療用的自體干細(xì)胞(EPC)。采用上述方法制備的干細(xì)胞，用于治療腎功能不全，正是充分利用了內(nèi)皮祖細(xì)胞 (EPC)所具有的以下特點(diǎn)
內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞、多功能干細(xì)胞。它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞層再生 和促進(jìn)血管再生。當(dāng)組織受到損傷時，尤其是缺血性損傷時，循環(huán)及組織中EPC動員和增值 能力增強(qiáng)，并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞、修復(fù)血管內(nèi)皮損傷 區(qū)，并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成，從而改善缺血器官的功能；而如果創(chuàng)傷后EPC的 分化、遷徙功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，則會導(dǎo)致?lián)p傷部位微循環(huán)嚴(yán)重?fù)p害而無法得到修復(fù)，甚至發(fā) 生器官功能衰竭。EPC是機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)過程中不可缺少的組成部分。臨床移植使用方法移植過程嚴(yán)格無菌操作。ASC經(jīng)誘導(dǎo)分化3 4d后，獲得的EPC用0. 25%胰酶/EDTA消化，生理鹽水洗滌2 3 次。選取大于10 7干細(xì)胞，用含1%自體血清的生理鹽水重懸，混勻，通過靜脈輸注回輸腎功 能不全患者進(jìn)行治療。剩余干細(xì)胞以1. 2 2X 10 7/支，嚴(yán)格按干細(xì)胞低溫保存步驟凍存， 共2 3支，用于后面回輸患者。每間隔2周左右，進(jìn)行凍存干細(xì)胞復(fù)蘇后，回輸患者。
權(quán)利要求
1.一種腎功能不全治療用的自體干細(xì)胞，其特征在于所述的自體干細(xì)胞是從患者腹 部或者臀部抽吸的脂肪組織中分離提純、擴(kuò)增培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化形成的自體內(nèi) 皮祖細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的一種腎功能不全治療用的自體干細(xì)胞，其特征在于所述的自 體干細(xì)胞的具體制備方法為a、在無菌條件下從患者腹部或者臀部抽吸脂肪組織，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次去除 紅細(xì)胞和其它細(xì)胞碎片后，剪碎，加入2 3倍體積的含0. 075% 0. 1% I型膠原酶的PBS 緩沖液，37°C水浴中充分振蕩消化30min以上；b、而后加入等量的含10%自體血清或人AB血清的DMEM培養(yǎng)液中和膠原酶，IOOOrpm離 心lOmin，去除漂浮的脂肪細(xì)胞和上清液，獲得的細(xì)胞沉淀加入140 180mM NH4Cl的PBS 緩沖液重新懸浮，室溫靜置IOmin裂解紅細(xì)胞后，IOOOrpm離心IOmin棄去上清液，獲得細(xì)胞 沉淀；c、獲得的細(xì)胞沉淀經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，用含10%自體血清或人AB血清、100U/mL青 霉素、100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸，以約104/cm2密度接種至IOOmm培養(yǎng)皿中，在 37°C、5%C02、飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 后首次換液；待細(xì)胞生長至80%以上融 合時，用0. 25%胰酶/EDTA消化、按1 3的比例傳代；d、選取第2 4代的細(xì)胞，用0.25%胰酶/EDTA消化后，接種在含1 lOng/mL hrVEGF, 0. 05 0. 2 mol/L atorvastatin和5% 20%患者自體血清或人AB血清的 X-vivo-15培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 4d，誘導(dǎo)分化成腎功能不全治療用的自體內(nèi)皮祖細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的一種腎功能不全治療用自體干細(xì)胞的制備方法，其特征在于 選取第2、代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療腎功能不全的自體干細(xì)胞及其制備方法。從患者脂肪組織中分離純化、擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)分化成治療腎功能不全用的自體內(nèi)皮祖細(xì)胞。其來源豐富、取材方便、簡便易行、經(jīng)濟(jì)實用。制備的干細(xì)胞自體回輸治療腎功能不全，治療的效果明顯、安全性好、無免疫排斥、無明顯毒副作用和不良反應(yīng)，病人痛苦小。為腎功能不全患者提供了一種全新的治療手段，具有深遠(yuǎn)的積極意義。
文檔編號C12N5/071GK102146357SQ20101061872
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者吳國祥, 張緒敏, 許鳳華 申請人:上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司