專利名稱：鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑及其在飼料脫毒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫毒劑，特別涉及一種鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒 劑。
背景技術(shù)：
真菌毒素是對糧食和飼料危害最大的生物性污染物之一。F-2毒素又名玉米赤霉 烯酮(karalenone，F(xiàn)-2)為白色晶體，是由多種鐮刀菌在代謝過程中產(chǎn)生的一種非類固醇 結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，其具有雌激素樣活性。主要對動物繁殖機(jī)能造成影響。？-2毒素是2，4一二羥基 苯甲酸內(nèi)酯類化學(xué)物，化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6-氧基碳烯基)-β-雷鎖酸-U-內(nèi)酯，主要 由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，此外還有三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)、木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)、雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale)、粉紅鐮刀菌(Fusarium roseum),黃色鐮刀 菌(Fusarium culmorum)、串珠鍵刀菌(Fusarium moniliforme)、爺病鍵刀菌(Fusarium solani)、尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum)禾口表球鍵刀菌(Fusarium episphaeria)等。 F-2毒素最初于1962年由Mob M(1962)等從污染了禾谷鐮刀菌的發(fā)霉玉米中分離得到， F-2毒素為白色晶體，分子式C18H22O5,熔點161-163°C，不溶于水，溶于堿性溶液、乙醚、苯及 甲醇、乙醇等。其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的綠藍(lán)色熒光。Urry W H等(1966)應(yīng)用經(jīng)典 化學(xué)、核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)確定了玉米赤霉烯醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)。1979年Mirocha C J等闡明 其生物合成途徑。
F-2毒素沒有留體結(jié)構(gòu)，但具有雌激素活性。F-2毒素可由胃腸道持續(xù)吸收，肝腸 循環(huán)可使F-2毒素在胃腸道滯留時間延長，F(xiàn)-2毒素主要隨糞便排出，少量F-2毒素可由乳 汁排泄。在鼠和禽，氚標(biāo)記的F-2毒素在體內(nèi)無蓄積作用。F-2毒素主要有2條代謝途徑 與葡萄糖醛酸結(jié)合，還原為玉米赤霉烯醇，玉米赤霉烯醇有2種異構(gòu)體，即a_玉米赤霉烯醇 (a-F-2ralenone)和β -玉米赤霉烯醇(β-F_2ralenone)。a_玉米赤霉烯醇的雌性激素 活性為玉米赤霉烯酮的3倍，β -玉米赤霉烯醇的雌性激素活性小于或等于玉米赤霉烯酮。 a_玉米赤霉烯醇轉(zhuǎn)化為β-玉米赤霉烯醇(0-F_2ralenone)也屬于解毒。a_玉米赤霉烯 醇熔點較低(168-169°C)，而β-玉米赤霉烯醇熔點較高(174-176°C)。F_2毒素及其代 謝物均有游離型和結(jié)合型，通過β -葡萄糖醛酸的作用，結(jié)合型轉(zhuǎn)為游離型。
1.生殖毒性
在多種動物中對豬繁殖性能的影響報道較多，青年母豬對F-2毒素最敏感。F-2毒 素可引起未性成熟母豬外陰水腫、子宮增大、乳腺增生，甚至直腸和陰道脫出；鏡檢表現(xiàn)為 子宮內(nèi)膜和子宮肌層細(xì)胞增生引起的水腫。有關(guān)F-2毒素對青年母豬性成熟和生產(chǎn)性能影 響的研究報道較少，而且結(jié)論不盡一致。對于性成熟母豬，F(xiàn)-2毒素可引起多種生殖功能失 調(diào)。對于懷孕
母豬主要是引起流產(chǎn)、死胎、新生仔豬死亡和胎兒干尸、胚胎吸收、少胎和弱胎。對 于泌乳母豬，Chang等(1979)報道，飼喂不同劑量F-2毒素的飼料，可導(dǎo)致發(fā)情抑制、卵巢萎縮和子宮角彎曲；斷乳一發(fā)情間隔時間延長；但不影響斷乳后再配種。Christensen等 (1972)報道，未成熟公豬采食含F(xiàn)-2毒素的玉米，可使睪丸重減少30%，甚至可中斷精子生 成；出現(xiàn)性欲降低和血液睪丸酮濃度下降。
牛對F-2毒素不如豬敏感，但與F-2毒素或產(chǎn)生F-2毒素的鐮刀菌有關(guān)的不孕、 產(chǎn)乳下降、雌激素過多癥已有報道(Mirocha，1974)。飼喂含Hmg/kgF_2毒素的大麥，可 引起奶牛不孕；飼料中含25-100mg/kgF-2毒素，可導(dǎo)致荷斯坦牛吞咽障礙和生殖器出血， 但發(fā)情和排卵正常(Mirocha，1978)，引起青年牛乳腺增大的飼料中分離出F-2毒素；用含 385-1925ng/kgF-2毒素的飼料喂牛，產(chǎn)乳量不變，且血、乳、尿及組織中測不出F-2毒素 (Shreeve，1979)。Noller等((1979)報道，F(xiàn)-2毒素污染的玉米含500ng/kgF_2毒素，不影 響牛奶及乳脂產(chǎn)量；初情牛飼喂含250mg/kg F-2毒素共3個發(fā)情周期，受孕率為62%，而 對照為87% (Weaver, 1986) 0 Smith等(1986)報道，日25mgF_2毒素，可導(dǎo)致綿羊排卵率和 懷孕率下降，Olsen等(1986)用800mg/kgF_2毒素飼喂小火雞，不影響其采食、增重和血液 睪丸酮濃度，但導(dǎo)致行為異常和肉冠增大；飼料中F-2毒素達(dá)100mg/kg，可使火雞產(chǎn)蛋下降 (Allen等，198 。量。Jian Ying等研究了 F-2及其代謝產(chǎn)物ZEL對老鼠精液質(zhì)量、受精 能力和睪丸激素濃度的負(fù)面影響。
2.致癌性
F-2有致癌性，能導(dǎo)致DNA收斂、染色體失常，從而產(chǎn)生遺傳方面的危害。孫劍寒 等研究發(fā)現(xiàn)F-2能通過活化人留體激素和外源化學(xué)物受體誘導(dǎo)細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4) 轉(zhuǎn)錄表達(dá)。嚴(yán)繼承等研究發(fā)現(xiàn)F-2在1 μ mol/L,以上就能抑制細(xì)胞間隙連接通訊功能，提 示它在一定條件下可能有促癌作用。F-2會結(jié)合到人的雌激素受體和刺激人乳腺癌細(xì)胞生 長，免疫學(xué)研究表明在人體內(nèi)有致癌性
細(xì)胞毒性
Obremski等^)0 報道豬采食低F_2 (400ugF_2/kg)污染的飼糧，腸粘膜形態(tài) 結(jié)構(gòu)雖然無顯著變化，但杯狀細(xì)胞的活性增加，囊泡中粘蛋白原濃度提高，淋巴細(xì)胞浸潤， 內(nèi)分泌細(xì)胞和小腸隱窩底部的潘氏細(xì)胞活性增加，表明F-2調(diào)動了小腸粘膜的局部防御機(jī) 制。該研究結(jié)果提示F-2的作用不僅僅只局限于對生殖系統(tǒng)的影響。Vaca等(1988)指 出F-2以濃度依賴方式增加丙二醛(malondialdehye，MDA)的生成，通過增強(qiáng)脂質(zhì)的過氧 化反應(yīng)誘導(dǎo)Vero細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的氧化損傷。因此，氧化損傷可能也是F_2發(fā)揮毒性 作用的主要途徑之一。
3.肝毒性
給雌性大鼠腹膜內(nèi)注射F-2 S卩(1. 5-5. Omg/BW)，48h后ALT、AST、ALP、血清肌肝、 膽紅素等生化指標(biāo)以及紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞容積(MCV)、血小板和白細(xì)胞等血液學(xué)參數(shù) 發(fā)生改變(Maaroufi等，1996)，表明F-2有一定的肝毒性，對血凝過程也有一定損害作用。
孫美樂等(1997)在大鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)液中加入0. 5-15mgF-2/mL,結(jié)果使培養(yǎng) 液中白蛋白及細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降，提示F-2對體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞有損傷作用。
4.免疫毒性
F-2能抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴細(xì)胞增殖，還能抑制刀豆素A和美洲 商陸有絲分裂原刺激的B細(xì)胞和T細(xì)胞形成，可降低家畜對病原菌的抵抗力，增加對腫瘤的 敏感性，改變巨噬細(xì)胞功能，降低NK細(xì)胞活力，降低遲發(fā)性超敏反應(yīng)，F(xiàn)-2及其衍生物ZEL誘導(dǎo)胸腺萎縮和激活巨噬細(xì)胞。攝入10mg/kgF-2兩周，降低對李斯特菌屬抵抗力但不影響抗 體形成細(xì)胞對SRBCS應(yīng)答或遲發(fā)性超敏反應(yīng)(Dean等1994)。對免疫器官的毒性作用報道 也較多。5F-2毒素與其它毒素的毒力互作效應(yīng)
檢測霉菌毒素對小鼠免疫功能的影響時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-2可顯著降低同時給予DON對小 鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的抑制效應(yīng)(Kuiper等，1998)。DON與F-2聯(lián)合呈劑量依賴性降低人 和大鼠淋巴細(xì)胞增殖，F(xiàn)-2抑制淋巴細(xì)胞增殖的IC5tl是DON的250倍，兩者具有加性效應(yīng) (Additiveeffects) (Atkinson和Miller，1984)。DON和 F-2 對豬的聯(lián)合效應(yīng)表明F_2 不影 響采食量、增重和飼料效率，但隨日糧DON水平的增加線性降低采食量和增重(P < 0. 05)。 方差分析表明兩種毒素?zé)o交互作用(P = 0. 35)，但F-2以任何濃度存在時可進(jìn)一步降低采 食量(P = 0. 08)。飼糧中DON增加胃、子宮和腎上腺的相對重，F(xiàn)-2不影響這些器官的相對 重。趙虎等2009研究表明日糧中添加1 ;3mg/kg F_2毒素不影響仔豬的平均日增重和 飼料轉(zhuǎn)化效率，可以增強(qiáng)仔豬細(xì)胞和體液免疫功能。蘇軍研究表明鐮刀菌毒素D0N、F-2通 過抑制細(xì)胞增殖內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)使細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致動物消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，并通過 下調(diào)及轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)，降低養(yǎng)分吸收而導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降，具有加性作用，表現(xiàn) 出抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)。
我國的F-2毒素的污染狀況是比較廣泛和嚴(yán)重的；因此去毒技術(shù)的研究尤其是生 物去毒技術(shù)的研究是非常急迫的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑及其在飼 料脫毒中的應(yīng)用，該種脫毒劑可徹底把F-2降解為無毒物質(zhì)。
一種鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，由消膽安、鋁硅酸鹽、碳酸銨、 酵母細(xì)胞壁中的三種或多種(可任意比例)與內(nèi)酯水解酶混合而成。
所述的內(nèi)酯水解酶質(zhì)量含量40%-60%。
所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，優(yōu)選由消膽安、鋁硅酸鹽、碳 酸銨、酵母細(xì)胞壁與內(nèi)酯水解酶混合而成，各成分質(zhì)量含量為消膽安10% -20%、鋁硅酸鹽 10% -20%、碳酸銨10% -20%、酵母細(xì)胞壁10% -20%、內(nèi)酯水解酶40% -60%。
所述的內(nèi)酯水解酶為Fusarium oxysporum AKU 3702的內(nèi)酯水解酶或內(nèi)酯水解酶 zhdlOl或兩者任意比例混合物。
Naoko等克隆了 F_2內(nèi)酯水解酶zhdlOl，并在大腸菌表達(dá)，結(jié)果重組的大腸桿菌 表現(xiàn)出很強(qiáng)的水解內(nèi)酯酶的能力(NaokoTA, ShuichiO, Takehiko S, et al. Metabolism ofzearalenone by geneticallymodified organisms expressing the detoxification gene from clonostachysrosea[J]Applied andEnvironmental Microbiology,2004, 70(6) :3239-3249) ；Michihiko 等對 Fusarium oxysporum AKU3702 的內(nèi)酯水解酶基因 進(jìn)行了分析，根據(jù)內(nèi)酯水解的氨基酸序列設(shè)計PCR引物，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物長大約lOOObp， 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它含有5個內(nèi)含子，6個外顯子(Michihiko K, Makoto S, ChigusaS, et al.Lactonering-cleaving enzyme :Genetic analysis, novel RNA editing, and evolutionaryimplications[J]Proc. Nat. 1 Acad.Sc. i USA. ，1988,95 :12787-12792)； Tomoko等把zhdlOl轉(zhuǎn)化到玉米，結(jié)果玉米也表出對F-2的降解能力(Tomoko !,Naoko TA,Noriyuki 0,et al. Reducedcontamination by the fusarium mycotoxin in zearalenone in maize kernels through geneticmodification with a detoxification gene[J] Applied and Environmental Microbiology,2004,73(5) :1622-1629)
所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑在飼料脫毒中的應(yīng)用。
所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑在飼料脫毒中的應(yīng)用方法為 在被F-2毒素污染的飼料中添加有效量的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑。
—種添有上述鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑的飼料。
一種添有上述鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑的母豬飼料，由以下 按重量份計的組分組成被鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素(F-2毒素)污染的檸檬酸渣 100-110份、豆油15-20份、豆粕745-760份、食鹽17-19份、石粉51-55份、磷酸氫鈣份、賴氨酸M-26份、膽堿4-6份、蛋氨酸3-5份、蘇氨酸3-5份、復(fù)合微量元素8_10份、復(fù)合 維生素8-10份、抗氧化劑0. 5-0. 7份、鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑0. 2-0. 4 份。
所述的添有上述鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑的母豬飼料，還包括 以下組分微生態(tài)制劑0. 5-1份、復(fù)合酶制劑0. 2-1份。
所述的復(fù)合微量元素是硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、亞硒酸鈉、氯化鈷、碘酸 鈣中的兩種或多種組合而成。
所述的復(fù)合維生素是維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K3、維生素Bi、維生素 B2、維生素B6、維生素B12、煙酸、泛酸、葉酸、生物素中的兩種或多種組合而成。
所述的微生態(tài)制劑是乳酸菌、酵母菌中的一種或多種組合而成。
所述的復(fù)合酶制劑是蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶等中的三種或數(shù)種任意比 例混合而成。
復(fù)合酶制劑提高腸道酶的含量，刺激酶的發(fā)育，同時通過參與一種或幾種催化反 應(yīng)有效降解飼料中的F-2毒素含量，提高豬對飼料的吸收利用率，有效屏蔽F-2毒素帶來環(huán) 境雌激素效應(yīng)。
抗氧化劑保證飼料在儲存過程中不發(fā)生氧化，保證維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的有效含量。
本發(fā)明鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑與單獨微生物菌一內(nèi)酯水 解酶比較的效果見下表
表 權(quán)利要求
1.一種鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，其特征是，由消膽安、鋁硅酸鹽、 碳酸銨、酵母細(xì)胞壁中的三種或多種與內(nèi)酯水解酶混合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，其特征是，所 述的內(nèi)酯水解酶質(zhì)量含量40% -60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，其特征是，由 消膽安、鋁硅酸鹽、碳酸銨、酵母細(xì)胞壁與內(nèi)酯水解酶混合而成，各成分質(zhì)量含量為消膽安 10% -20%、鋁硅酸鹽10% -20%、碳酸銨10% -20%、酵母細(xì)胞壁10% -20%、內(nèi)酯水解酶 40% -60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑，其 特征是，所述的內(nèi)酯水解酶為Fusarium oxysporum AKU 3702的內(nèi)酯水解酶或內(nèi)酯水解酶 zhdlOl或兩者任意比例混合物。
5.權(quán)利要求1-3任一項所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑在飼料脫 毒中的應(yīng)用。
6.一種添有權(quán)利要求1-3任一項所述的鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑 的飼料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的飼料，其特征是，由以下按重量份計的組分組成被鐮刀菌 毒素玉米赤霉烯酮毒素污染的檸檬酸渣100-110份、豆油15-20份、豆粕745-760份、食鹽 17-19份、石粉51-55份、磷酸氫鈣M-觀份、賴氨酸M46份、膽堿4_6份、蛋氨酸3_5份、 蘇氨酸3-5份、復(fù)合微量元素8-10份、復(fù)合維生素8-10份、抗氧化劑0. 5-0. 7份、鐮刀菌毒 素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑0. 2-0. 4份。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的飼料，其特征是，還包括以下組分微生態(tài)制劑0.5-1份、復(fù) 合酶制劑0. 1-1份。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的飼料，其特征是，所述的復(fù)合微量元素是硫酸銅、硫酸鐵、 硫酸錳、硫酸鋅、亞硒酸鈉、氯化鈷、碘酸鈣中的兩種或多種組合而成；所述的復(fù)合維生素是 維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K3、維生素Bi、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙 酸、泛酸、葉酸、生物素中的兩種或多種組合而成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的飼料，其特征是，所述的微生態(tài)制劑是乳酸菌、酵母菌中的 一種或多種組合而成；所述的復(fù)合酶制劑是蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶中的三種或 數(shù)種任意比例混合而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鐮刀菌毒素玉米赤霉烯酮毒素的生物脫毒劑及其在飼料脫毒中的應(yīng)用，由消膽安、鋁硅酸鹽、碳酸銨、酵母細(xì)胞壁中的三種或多種(可任意比例)與內(nèi)酯水解酶混合而成。所述的內(nèi)酯水解酶質(zhì)量含量40％-60％。本發(fā)明脫毒劑脫毒效果好，含生物脫毒劑的母豬飼料，生產(chǎn)出具有高效降解飼料中的F-2毒素含量的飼料，從而改善了飼料的營養(yǎng)質(zhì)量，促進(jìn)了母豬的健康成長，利于其適時發(fā)情和提高發(fā)情質(zhì)量，提高母豬的年產(chǎn)胎數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)，達(dá)到提高豬場養(yǎng)殖效益的目的。
文檔編號A23L1/015GK102028128SQ20101060139
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者劉方波, 劉勝利 申請人:菏澤和美華飼料有限公司