專利名稱：抑制Ppif基因的表達(dá)減輕腎缺血再灌注損傷的試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是一種抑制Ppif基因的表達(dá)減輕腎缺血再灌注 損傷的試驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)的概念是 Glaumann B 在 1975年提出的，他在建立大鼠腎缺血模型試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺血腎恢復(fù)灌流后的腎損傷反較恢 復(fù)灌流前嚴(yán)重，提示存在某種有別于缺血損傷的損傷機(jī)制。IRI是導(dǎo)致缺血的器官組織失去 功能的重要原因，減輕缺血再灌注損傷是保護(hù)缺血器官組織的有力途徑。而IRI的核心是 細(xì)胞凋亡，線粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程中的重要通路，因而線粒 體成為近年來(lái)IRI研究的熱點(diǎn)。而蛋白親環(huán)素D(CyCl0philin D，CypD)是定位在線粒體基 質(zhì)里的一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶，是線粒體內(nèi)的核心物質(zhì)，國(guó)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)敲除小鼠Ppif 基因(CypD的編碼基因)，論證了失去CypD的小鼠對(duì)缺血再灌注損傷有明顯的抵抗作用，且 敲除Ppif基因的小鼠沒(méi)有出現(xiàn)明顯異常。上述事實(shí)表明，CypD有可能成為缺血再灌注損傷 治療中重要的靶點(diǎn)，為今后缺血再灌注損傷基因治療指明了又一方向。在這里我們首次報(bào) 道了應(yīng)用RNAi技術(shù)可促進(jìn)大鼠腎小管上皮細(xì)胞增值并使細(xì)胞凋亡減少。小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)技術(shù)是一項(xiàng)近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用于基因功能研究的新技術(shù)，作 用方式是通過(guò)一段與靶基因mRNA互補(bǔ)的19 21nt的寡核苷酸引導(dǎo)，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性酶反 應(yīng)，將轉(zhuǎn)錄合成的靶基因mRNA特異降解。該技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)已被廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞基因 的轉(zhuǎn)錄后抑制。目前隨著RNA干擾技術(shù)在一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的運(yùn)用以及導(dǎo)入方法的改 進(jìn)，研究者已經(jīng)把目光投向其作為基因治療的工具。蛋白親環(huán)素D(CyCl0philin D，CypD) 是定位在線粒體基質(zhì)里的一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶，位于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔上MPTP [1-2]， 線粒體是細(xì)胞關(guān)鍵的細(xì)胞器之一，是細(xì)胞的供能中心，在缺血再灌注損傷中，線粒體扮演著 重要的角色。近年研究表明，Ppif基因(CypD的編碼基因)，與缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制 有著密切的關(guān)系，RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(doubles tranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的mRNA水平上基因沉默，具有高度特異性。哺乳動(dòng)物及人類細(xì) 胞中轉(zhuǎn)染21 23個(gè)核苷酸的小干擾性RNA(small interfering RNA, siRNA)，可特異性降 解靶mRNA，下調(diào)蛋白表達(dá)水平。本發(fā)明所述的試驗(yàn)方法針對(duì)3個(gè)不同干擾靶點(diǎn)，對(duì)大鼠腎細(xì) 胞(normal rat kidney cells，NRK) Ppif進(jìn)行抑制試驗(yàn)，體外觀察沉默Ppif基因?qū)Υ笫竽I 細(xì)胞(NRK)增值和凋亡的影響，能夠?yàn)獒槍?duì)大鼠Ppif基因的靶向治療提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種安全有效的對(duì)大鼠腎細(xì)胞(normal rat kidney cells，NRK) Ppif進(jìn)行抑制的試驗(yàn)方法，方便試驗(yàn)人員體外觀察沉默Ppif基因?qū)Υ?鼠腎細(xì)胞(NRK)增值和凋亡的影響，能夠?yàn)獒槍?duì)大鼠Ppif基因的靶向治療提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是按如下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的
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慢病毒載體包裝實(shí)驗(yàn)制備方法如下1、提取大鼠Ppif基因，即NM_172243基因?yàn)榘谢颍鶕?jù)RNA干擾RNAi序列設(shè) 計(jì)原則，設(shè)計(jì)4對(duì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列，退火形成雙鏈DNA，雙酶切后定向克隆 到慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PGCL-Ppif中，構(gòu)建4個(gè)含靶基因片段的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pGCL-Ppif,并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。2、4個(gè)含Ppif靶基因片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建成功后，從這4個(gè)片段中篩 選有效的RNAi靶點(diǎn)序列，即4個(gè)靶點(diǎn)不一定都有效，要從中篩選出可以抑制Ppif基因的靶
點(diǎn)ο3、將篩選出來(lái)的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif進(jìn)行慢病毒的包裝，此時(shí)介導(dǎo) Ppif基因沉默的慢病毒載體全部完成，此時(shí)得到的是一種試劑，可以理解為一種藥物，可以 用來(lái)注射動(dòng)物，進(jìn)行抑制Ppif基因的功能實(shí)驗(yàn)。4、用pGCL-Ppif注射大鼠，檢測(cè)其對(duì)腎缺血再灌注損傷的抑制效果。本發(fā)明的積極效果在缺血再灌注損傷機(jī)制和治療2個(gè)方面，將研究的層次上由 分子生物學(xué)水平提高到了基因水平，且應(yīng)用的范圍廣所有與缺血再灌注損傷有關(guān)的疾病， 比如應(yīng)用于腎移植，心肌梗死，腦血管意外等均可以使用該項(xiàng)成果。
具體實(shí)施例方式具體試驗(yàn)步驟如下1、提取大鼠Ppif基因，即NM_172243基因?yàn)榘谢?，根?jù)RNA干擾RNAi序列設(shè) 計(jì)原則，設(shè)計(jì)4對(duì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列，退火形成雙鏈DNA，雙酶切后定向克隆 到慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PGCL-Ppif中，構(gòu)建4個(gè)含靶基因片段的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pGCL-Ppif,并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。2、4個(gè)含Ppif靶基因片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建成功后，從這4個(gè)片段中篩 選有效的RNAi靶點(diǎn)序列，即4個(gè)靶點(diǎn)不一定都有效，要從中篩選出可以抑制Ppif基因的靶
點(diǎn)ο3、將篩選出來(lái)的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif進(jìn)行慢病毒的包裝，此時(shí)介導(dǎo) Ppif基因沉默的慢病毒載體全部完成，此時(shí)得到的是一種試劑，可以理解為一種藥物，可以 用來(lái)注射動(dòng)物，進(jìn)行抑制Ppif基因的功能實(shí)驗(yàn)。4、用pGCL-Ppif注射大鼠，檢測(cè)其對(duì)腎缺血再灌注損傷的抑制效果。
權(quán)利要求
1. 一種抑制Ppif基因的表達(dá)減輕腎缺血再灌注損傷的試驗(yàn)方法，其特征在于具體試驗(yàn)步驟如下(1)、提取大鼠Ppif基因，即NM_172243基因?yàn)榘谢颍鶕?jù)RNA干擾RNAi序列設(shè)計(jì) 原則，設(shè)計(jì)4對(duì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列，退火形成雙鏈DNA，雙酶切后定向克隆到 慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif中，構(gòu)建4個(gè)含靶基因片段的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pGCL-Ppif,并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。(2)、4個(gè)含Ppif靶基因片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建成功后，從這4個(gè)片段中篩選 有效的RNAi靶點(diǎn)序列，即4個(gè)靶點(diǎn)不一定都有效，要從中篩選出可以抑制Ppif基因的靶 點(diǎn)ο(3)、將篩選出來(lái)的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif進(jìn)行慢病毒的包裝，此時(shí)介導(dǎo)Ppif 基因沉默的慢病毒載體全部完成，此時(shí)得到的是一種試劑，可以理解為一種藥物，可以用來(lái) 注射動(dòng)物，進(jìn)行抑制Ppif基因的功能實(shí)驗(yàn)。、用pGCL-Ppif注射大鼠，檢測(cè)其對(duì)腎缺血再灌注損傷的抑制效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是一種抑制Ppif基因的表達(dá)減輕腎缺血再灌注損傷的試驗(yàn)方法。本發(fā)明所述的試驗(yàn)方法針對(duì)3個(gè)不同干擾靶點(diǎn)，提取大鼠腎細(xì)胞(normal rat kidney cells，NRK)Ppif進(jìn)行抑制試驗(yàn)，體外觀察沉默Ppif基因?qū)Υ笫竽I細(xì)胞(NRK)增值和凋亡的影響，能夠?yàn)獒槍?duì)大鼠Ppif基因的靶向治療提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，本發(fā)明在缺血再灌注損傷機(jī)制和治療2個(gè)方面，將研究的層次上由分子生物學(xué)水平提高到了基因水平，且應(yīng)用的范圍廣，所有與缺血再灌注損傷有關(guān)的疾病，比如應(yīng)用于腎移植，心肌梗死，腦血管意外等均可以使用該項(xiàng)成果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102127593SQ20101056552
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者胡威, 陳志強(qiáng) 申請(qǐng)人:陳志強(qiáng)