專利名稱：一種基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)時(shí)熒光pcr相對標(biāo)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學(xué)和生物技術(shù)交叉領(lǐng)域，涉及一種實(shí)時(shí)熒光PCR的標(biāo)定方法，尤其 是一種基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR相對標(biāo)定方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction簡稱PCR)技術(shù)是一種在體外模擬自 然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，亦稱無細(xì)胞分子克隆技術(shù)，其原理類似于天然DNA的復(fù) 制，是體外酶促反應(yīng)選擇性地合成特異性DNA的一種方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)于1996年由 美國Applied biosystems (ABI)公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用 對熒光信號積累的實(shí)時(shí)檢測來檢測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過校正曲線對未知模板進(jìn)行定量 分析。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光標(biāo)記探針，實(shí)時(shí)檢測檢測PCR產(chǎn)物。一方面提高了 靈敏度，另一方面利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，最后通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)具有較好的優(yōu)勢，操作簡便、快速高效、 高敏感性、重復(fù)性、特異性與多重?cái)U(kuò)增。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR儀中大多采用CCD作為探測器，它最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)掃描 多個(gè)熒光信號，速度較快，但是靈敏度低，而且同時(shí)檢測樣品間的熒光信號存在干擾，使檢 測結(jié)果受到很大的影響。比較了大量的熒光PCR儀的文獻(xiàn)之后發(fā)現(xiàn)，對基于CCD的熒光PCR 儀的標(biāo)定方面的報(bào)道較少，大多集中在如何檢測熒光信號的研究上。這直接影響到生物PCR 產(chǎn)品使用的可靠性、推廣性、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的社會認(rèn)可以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR相對標(biāo)定方 法。該方法利用被標(biāo)定的樣品為實(shí)時(shí)熒光PCR儀提供標(biāo)準(zhǔn)的熒光信號，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR 儀熒光檢測精度的標(biāo)定。因?qū)崟r(shí)熒光PCR儀是一種相對測量的方法，所以本發(fā)明也采用相 對標(biāo)定的方法。本發(fā)明是通過下述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明方法中需要一臺已標(biāo)定的熒光檢測儀、一臺待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀、η 個(gè)樣品試管、熒光粉末和環(huán)氧樹脂膠水。把由熒光粉末和膠水混合凝固制作而成的樣品試 管放入已標(biāo)定的熒光檢測儀中，得到熒光光強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。已標(biāo)定的熒光檢測儀由單色LED 連接積分球作為激發(fā)光源，光電倍增管作為光電探測器，并通過儀器控制系統(tǒng)為儀器供電、 調(diào)制光電倍增管的放大倍率以及RS232串口把結(jié)果輸出到電腦上。本發(fā)明方法的具體步驟為步驟一制作標(biāo)準(zhǔn)樣本1-1將待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀最大量程進(jìn)行η等分，然后取η個(gè)相同的透明樣品 試管，依次編號為1至η，其中η > 10。1-2取一個(gè)燒杯，在燒杯中加入e mg的熒光粉末和f ml的環(huán)氧樹脂膠，攪拌均勻， 使熒光粉末完全溶解在環(huán)氧樹脂膠中，形成膠水混合物；然后取一個(gè)針筒，將s ml (0 < s<f)的膠水混合物注入第η號試管中，則該試管內(nèi)的熒光粉末濃度K為 χ e
權(quán)利要求
一種基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR相對標(biāo)定方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟一、制作標(biāo)準(zhǔn)樣本1 1將待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀最大量程進(jìn)行n等分，然后取n個(gè)相同的透明樣品試管，依次編號為1至n，其中n≥10；1 2取一個(gè)燒杯，在燒杯中加入e mg的熒光粉末和f ml的環(huán)氧樹脂膠，攪拌均勻，使熒光粉末完全溶解在環(huán)氧樹脂膠中，形成膠水混合物；然后取一個(gè)針筒，將s ml的膠水混合物注入第n號試管中，則該試管內(nèi)的熒光粉末濃度δn為 <mrow><msub> <mi>δ</mi> <mi>n</mi></msub><mo>=</mo><mfrac> <mi>e</mi> <mi>f</mi></mfrac> </mrow>為了使這n個(gè)試管的熒光強(qiáng)度依次線性增強(qiáng)，則第i號試管內(nèi)熒光粉末的濃度為 <mrow><msub> <mi>δ</mi> <mi>i</mi></msub><mo>=</mo><mfrac> <mi>i</mi> <mi>n</mi></mfrac><msub> <mi>δ</mi> <mi>n</mi></msub><mo>=</mo><mfrac> <mi>ie</mi> <mi>nf</mi></mfrac><mo>,</mo> </mrow>其中1≤i≤n由此完成第i號試管后，燒杯中應(yīng)加入的膠水體積Δvi 1為 <mrow><mi>Δ</mi><msub> <mi>v</mi> <mrow><mi>i</mi><mo>-</mo><mn>1</mn> </mrow></msub><mo>=</mo><mfrac> <mrow><mi>nf</mi><mo>-</mo><mo>[</mo><mi>i</mi><mo>+</mo><mrow> <mo>(</mo> <mi>i</mi> <mo>+</mo> <mn>1</mn> <mo>)</mo></mrow><mo>+</mo><mo>.</mo><mo>.</mo><mo>.</mo><mo>+</mo><mi>n</mi><mo>]</mo><mi>s</mi> </mrow> <mrow><mi>i</mi><mo>-</mo><mn>1</mn> </mrow></mfrac> </mrow>從而得到熒光強(qiáng)度依次線性增強(qiáng)的n個(gè)試管；1 3把n個(gè)試管靜置直至膠水完全凝固，從而完成第1至n號標(biāo)準(zhǔn)樣本的制作；步驟二、計(jì)算校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)值2 1打開已標(biāo)定的熒光檢測儀，調(diào)整光電倍增管增益，使儀器穩(wěn)定；2 2把步驟一中得到的n個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣本依次放入已標(biāo)定的熒光檢測儀中，得到一組標(biāo)準(zhǔn)熒光光強(qiáng)測量值a1、a2、···、an；再計(jì)算得到一組對應(yīng)的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)值A(chǔ)1、A2···、An，其中A1＝a1/an、A2＝a2/an、···An＝an/an；步驟三、待標(biāo)定儀器數(shù)據(jù)檢測3 1打開待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，等待穩(wěn)定儀器；3 2把步驟一中得到的n個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣本放入待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀中，得到一組測量值b1、b2、···、bn；再計(jì)算得到一組對應(yīng)的待標(biāo)定測量值B1、B2···、Bn，其中B1＝b1/bn、B2＝b2/bn、···Bn＝bn/bn；步驟四、得出標(biāo)定結(jié)果通過校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)值數(shù)據(jù)組與待標(biāo)定測量值數(shù)據(jù)組比對得到待標(biāo)定的實(shí)時(shí)熒光PCR儀的各點(diǎn)偏差Di和平均偏差d，從而完成實(shí)時(shí)熒光PCR相對標(biāo)定；其中Di＝|Ai Bi|，F(xiàn)SA00000330900400021.tif
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR相對標(biāo)定方法。現(xiàn)有技術(shù)中還未見實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)定方法。本發(fā)明方法包括標(biāo)準(zhǔn)樣本的制作步驟、校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)值的計(jì)算步驟、待標(biāo)定儀器數(shù)據(jù)的檢測步驟和確定標(biāo)定結(jié)果步驟。本發(fā)明采用按測量范圍等分的熒光粉末，能使熒光樣本產(chǎn)生的熒光光強(qiáng)覆蓋整個(gè)測量范圍。
文檔編號C12N15/10GK101979544SQ20101053051
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者俞曉平, 葉子弘, 孔明, 崔海峰, 程琦 申請人:中國計(jì)量學(xué)院