專利名稱：一種生物防治菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物防治菌劑。
背景技術(shù)：
研究表明，在Metschnikowia屬酵母發(fā)現(xiàn)的20多個種中，沒有對人體和環(huán)境有不 利影響的菌株。因此，研究人員逐漸對該屬的酵母產(chǎn)生了興趣。國外發(fā)現(xiàn)有生防效果的2個 菌禾中是 Metschnikowia pulcherrima 禾口 Metschnikowia fructicola。Μ· pulcherrima 是從 蘋果表面分離，對蘋果米后病原物 Botrytis cinerea、Penicillium expansum>Alternaria sp.以及Monilia sp.都有一定的抑制效果。該生防菌的懸浮液在蘋果傷口上(in vivo) 能有效抑制病害的發(fā)生，但其過濾液和滅菌液卻沒有效果，推斷該拮抗菌不產(chǎn)生抗生素；在 不同的固體培養(yǎng)基上(in vitro)與病原物不接觸對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該拮抗菌產(chǎn)生了抑制病原 物的代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)基種類不同，其抑菌的效果差異很大，認(rèn)為拮抗菌生境的營養(yǎng)條件影響 了次生代謝物的產(chǎn)生；當(dāng)Metschnikowia pulcherrima在PDB中與病原菌(B. cinerea)共 培養(yǎng)時，該拮抗菌(IXlO8Cfu πιΓ1)完全可以抑制病原菌(IX IO5孢子πιΓ1)的孢子萌發(fā)， 其過濾液和滅菌液則無效果，同時觀測到該拮抗菌的活細(xì)胞能附著在病原物菌絲體上，因 此認(rèn)為生防機制源于拮抗菌與病原物的直接作用。在M. pulcherrima生防機制的研究中也 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腇e+3 (5 μ g Hir1FeCl3)存在時，該菌在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生了有色的帶，病原 物B. cinerea、A. alternate和P. expansum的孢子在有色帶上不能萌發(fā)，菌絲衰退，而在高 濃度Fe+3條件下卻沒有抑制的效果，認(rèn)為拮抗菌與病原物存在Fe+3的競爭。也有研究認(rèn)為， 該生防菌吸收Fe+3的方式是產(chǎn)生一些可以移動的前體酸性物質(zhì)(The pulcherrimaacid), 螯合了周圍環(huán)境中的Fe+3，病原物生長在缺Fe+3的條件下，引起細(xì)胞生理的變化，菌絲裂解。 Metschnikowia屬的另一個生防菌M. fructicola，是從葡萄表面分離，對貯藏期葡萄的灰 霉病(Botrytis rot)有一定的防治效果，采前24h使用該生防菌可以明顯地降低葡萄貯藏 期病原物B. cinerea,Alternaria spp.和Aspergillusniger引發(fā)的病害，該拮抗菌生防機 制的探索未見報道。Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T 已經(jīng)分離獲得(Meng-lin Xue,Li-qun Zhang,Qi—ming Wang,Ji-shuZhang,Feng-yan Bai. Metschnikowia sinensis sp. nov. , Metschnikowia zizyphicola sp. nov., Metschnikowia shanxiensis sp. nov., three novel yeast species from jujube fruit. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006，56 :2245_2250.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]在防治植物病害中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]在防治 植物病害中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov.XY201T]在制備防治植物病害菌劑中的應(yīng)用；或梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用；所述果蔬采后保鮮為在果蔬采后，抑制果蔬感
染病害。本發(fā)明提供了梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]在制 備防治植物病害菌劑中的應(yīng)用；或梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用；所述果蔬采后保鮮為在果蔬采后，抑制果蔬感染病害。所述植物病害為黑斑病害、腐爛病害、褐腐病、青霉病害、軟腐病害、青綠霉病害或 灰霉病害。所述黑斑病害的病原菌為細(xì)交鏈格孢[Alternaria alternate (F r. )Keissler]； 所述腐爛病害的病原菌為多隔鐮孢霉[Fusarium decemcellulare Brick.]；所述褐腐 病害的病原菌為褐腐串珠霉[Monilia fructicola Poll.]；所述青霉病害的病原菌 為擴展青霉[Penicillium expansum(Lk.) Thom]；所述軟腐病害的病原菌為葡枝根霉 [Rhizopusstolonifer (Ehrenb. ex Fr.)Vui 11.]；所述青綠霉病害的病原菌為意大利青霉 [Penicilliumitalicum Wehmer]或指狀青β [Penicillium digitatum Sacc.]。所述黑斑病害為冬棗黑斑病害，所述腐爛病害為冬棗腐爛病害，所述軟腐病害為 蘋果軟腐病害；所述褐腐病害為冬棗褐腐病害，所述青霉病害為冬棗果青霉病害或蘋果青 霉病害，所述青綠霉病害為柑桔青綠霉病害；所述灰霉病害為葡萄灰霉病害。所述菌劑，其活性成分為如下1)、2)或3)或4)所示1)、_胃—胃[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]；2)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的組合 物；3)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因 (Iprodione)的組合物；4)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？?(Sportak)的組合物。所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的 組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化 鈣的配比為(IXlO6Cfu Iiir1-IXlO7Cfu ml—1) (20g F1-IOOg Γ1)，所述梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣的配比具體為 1 X IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfumr1 20gr\50g Γ1 或 IOOg Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組 合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因的 配比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述撲海因的配比具體為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與施保克的組合 物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述施保克的配 比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述施?？说呐浔染唧w為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu
5ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣均 為獨立包裝；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海 因〔3- (3，5- 二氯苯基)-N-異丙基-2，4- 二氧咪唑烷-1-羧酰胺〕均為獨立包裝；所述梅 奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施保克〔N-丙基-Ν_[2_(2，4， 6_三氯苯氧基)乙基]-咪唑-1-甲酰胺〕均為獨立包裝。所述2)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述氯化鈣分別以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]白勺 1 # 巾 _ 胃 Sl ·胃[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量為(1 XlO6Cfu Hir1-I XlO7Cfu πιΓ1)，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量具體為IXlO6Cfu ml—1或IXlO7Cfu ml—1，氯化鈣的液體中氯化鈣的濃度具 體為 SOgF1 或 IOOgr1 ；所述3)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述撲海因分別以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp· nov· XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量為(IX IO6-I X IO7Cfu ml—1)，撲海因的液體中撲海因的濃度為50 μ g πιΓ1 ；梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]的含量具體為 1 X 106cfu πιΓ1 或 1 X 107cfu πιΓ1 ；所述4)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述施?？朔謩e以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量為(IX IO6-I X IO7Cfu ml—1)，施?？说囊后w中施?？说臐舛葹?0 μ g m Γ1 ；梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]的含量具體為 1 X 106cfu πιΓ1 或 1 X 107cfu Ι Γ1，所述1)所示菌劑按照如下方法制備得到將梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp.nov. XY201T]發(fā)酵，收集發(fā)酵容器中的所有物質(zhì)得到菌劑；所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為將蔗糖、牛肉蛋白胨、Na2HPO4, NaH2PO4, MgSO4, NaNO3^ FeCl3和泡敵溶于水中，用水補齊體積；所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 1.5%-2% (質(zhì)量百分含量)，所述牛肉蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1. 3% -1. 6% (質(zhì)量百分含量)，所述Na2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 05% -0. 1 % (質(zhì)量百分 含量)，所述NaH2PO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 05 % -0. 1 % (質(zhì)量百分含量)，所 述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 03% -0. 05% (質(zhì)量百分含量)，所述NaNO3在所 述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 03 % -0. 05 % (質(zhì)量百分含量)，所述FeCl3在所述發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為0. 02% -0. 05% (質(zhì)量百分含量)，所述泡敵在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 0.01% -0. 03% (質(zhì)量百分含量)；所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為1.5%、1.8%或2% (質(zhì)量百分含量)，所述牛肉蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為1.3%、1.5%或1.6% (質(zhì)量百分 含量)，所述Na2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 05 %、0. 08 %或0. 1 % (質(zhì)量百 分含量)，所述NaH2PO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 05 %、0. 08 %或0. 1 % (質(zhì)量 百分含量)，所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 03 %、0. 04 %或0. 05 % (質(zhì)量 百分含量)，所述NaNO3在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 03 %、0. 04 %或0. 05 % (質(zhì)量 百分含量)，所述FeCl3在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 02 %、0. 03 %或0. 05 % (質(zhì)量 百分含量)所述泡敵在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0.01%、0. 02%或0.03% (質(zhì)量百 分含量)；所述發(fā)酵溫度為25V _29°C，所述發(fā)酵溫度具體為27°C、27. 5°C、28°C ；所述發(fā)酵 培養(yǎng)基的初始PH值為5. 0-6. 0，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值具體為5. 5,5. 6,5. 8 ；所述 發(fā)酵時間為3天-4天，所述發(fā)酵時間具體為3天、3. 5天或4天，所述發(fā)酵中的通氣量為 80識021、4-1001111021^^，所述發(fā)酵中的通氣量具體為80福021^^或100福021、人本發(fā)明的第三個目的是提供一種防治植物病害菌劑。本發(fā)明提供的一種防治植物病害菌劑，其活性成分1)或2)或3)如下1)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. ηον· XY201T]與氯化鈣的組合 物；2)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因 (Iprodione)的組合物；3)、梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？?(Sportak)的組合物。所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的 組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯 化鈣的配比為(IXlO6Cfu Iiir1-IXlO7Cfu ml—1) OOgr1-IOOg Γ1)，所述梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣的配比具體為 1 X IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfumr1 20g F\50g Γ1 或 IOOg Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組合 物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因的配 比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述撲海因的配比具體為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？说慕M合 物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述施?？说呐?比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述施?？说呐浔染唧w為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述2)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣均為獨立包裝；所述3)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因均為獨立包裝；
所述4)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？司鶠楠毩b。所述2)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述氯化鈣分別以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]白勺 1 # 巾 _ 胃 Sl ·胃[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量為(1 XlO6Cfu Hir1-I XlO7Cfu πιΓ1)，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量具體為IXlO6Cfu ml—1或IXlO7Cfu ml—1，氯化鈣的液體中氯化鈣的濃度具 體為 20g I-1JOg Γ1 或 IOOg Γ1 ；所述3)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述撲海因分別以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的濃度為(IX IO6-I X IO7Cfu ml—1)，撲海因的液體中撲海因的濃度為50 μ g m Γ1 ；梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]的濃度具體為 1 X 106cfu πιΓ1 或 1 X 107cfu πιΓ1 ；所述4)所示組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]與所述施?？朔謩e以其液體形式存在的，梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]的含量為(IX IO6-I X IO7Cfu ml—1)，施?？说囊后w中施保克的濃度為50 μ g m Γ1 ；梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov. XY201T]的液體中梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]的含量具體為 1 X 106cfu πιΓ1 或 1 X 107cfu Ι Γ1，所述1)所示菌劑按照如下方法制備得到將梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp.nov. XY201T]發(fā)酵，收集發(fā)酵容器中的所有物質(zhì)得到菌劑；所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為將蔗糖、牛肉蛋白胨、Na2HPO4, NaH2PO4, MgSO4, NaNO3^ FeCl3和泡敵溶于水中，用水補齊體積；所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 1.5%-2% (質(zhì)量百分含量)，所述牛肉蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1. 3% -1. 6% (質(zhì)量百分含量)，所述Na2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 05% -0. 1 % (質(zhì)量百分 含量)，所述NaH2PO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 05 % -0. 1 % (質(zhì)量百分含量)，所 述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 03% -0. 05% (質(zhì)量百分含量)，所述NaNO3在所 述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 03 % -0. 05 % (質(zhì)量百分含量)，所述FeCl3在所述發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為0. 02% -0. 05% (質(zhì)量百分含量)，所述泡敵在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 0.01% -0. 03% (質(zhì)量百分含量)；所述蔗糖在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為1.5%、1.8%或2% (質(zhì)量百分含 量)，所述牛肉蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為1.3%、1.5%或1.6% (質(zhì)量百分 含量)，所述Na2HPO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 05 %、0. 08 %或0. 1 % (質(zhì)量百 分含量)，所述NaH2PO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 05 %、0. 08 %或0. 1 % (質(zhì)量 百分含量)，所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 03 %、0. 04 %或0. 05 % (質(zhì)量百分含量)，所述NaNO3在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 03 %、0. 04 %或0. 05 % (質(zhì)量 百分含量)，所述FeCl3在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 02 %、0. 03 %或0. 05 % (質(zhì)量 百分含量)所述泡敵在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為0.01%、0. 02%或0.03% (質(zhì)量百 分含量)；所述發(fā)酵溫度為25V _29°C，所述發(fā)酵溫度具體為27°C、27. 5°C、28°C ；所述發(fā)酵 培養(yǎng)基的初始PH值為5. 0-6. 0，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值具體為5. 5,5. 6,5. 8 ；所述 發(fā)酵時間為3天-4天，所述發(fā)酵時間具體為3天、3. 5天或4天，所述發(fā)酵中的通氣量為 80識021、4-1001111021^^，所述發(fā)酵中的通氣量具體為80福021^^或100福021、人所述的菌劑在防治植物病害中的應(yīng)用；或所述的菌劑在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用； 以上應(yīng)用均為本發(fā)明保護的范圍，所述果蔬采后保鮮為在果蔬采后，抑制果蔬感染植物病 害。本發(fā)明的試驗證明，分離得到梅奇屬新種[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]，生物測定表明該梅奇屬新種對棗果黑斑病及黃瓜和茄子腐爛病具有顯著的防治 作用，而且能有效防治棗果腐爛病害、葡萄灰霉病害、棗果褐腐病害、棗果和蘋果青霉病害、 梨軟腐病害等，對柑桔的青綠霉病也有一定的防治效果。生物安全性測定結(jié)果表明，該菌株 對人體和環(huán)境安全，無副作用。


圖1為基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列和Neighbor-Joining分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖 2 為 M. zizyphicola XY201T (a, b)圖3為梅奇酵母菌XY201在冬棗傷口上的定殖能力圖4為梅奇酵母菌XY201在冬棗果面上的定殖能力圖5為梅奇酵母菌XY201的活細(xì)胞和培養(yǎng)濾液對采后冬棗病害的抑制
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的實驗如無特殊說明，均為重復(fù)三次，取平均值。實施例1、Metschnikowia屬酵母的分離和鑒定細(xì)交鏈格孢[Alternaria alternate (Fr. )Keissler]，是從田間自然發(fā)病的冬棗 表面分離，經(jīng)純化后接種在PDA培養(yǎng)基，在28°C下培養(yǎng)IOd后，借助血球計數(shù)器，用無菌水配 成孢子懸浮液1 X IO6孢子πιΓ1。冬棗采收于中國山東省無棣，駿棗采收于中國山西省交城。選用無病蟲害、無傷、 成熟度和大小一致的果實，預(yù)冷2d后入PVC袋，放-2°C冰箱中冷藏。試驗時，棗果硬度為 12. 53kg/cm2，可溶性固形物含量為36. 8%，總酸為0. 46% 0駿棗硬度12. 65kg/cm2，可溶性 固形物含量為33. 2%，總酸為0. 37%。接種前棗果用2% NaOCl消毒2min，經(jīng)蒸餾水沖洗 后風(fēng)干，待用。1、分離1)從棗果表面分離
取10個上述獲得的棗果放在盛0. 2M磷酸緩沖液容器中，在IOOr · mirT1旋轉(zhuǎn)振 蕩器中洗滌lOmin，丟棄洗液。2次清洗前，棗果進(jìn)行30s超聲處理。2次洗液經(jīng)連續(xù)稀釋 后，涂布在Luria-Bertani (LB)固體培養(yǎng)基上，每皿0. lmL，在28°C下培養(yǎng)24_48h，依據(jù)不同 的菌落特征隨機選取菌落，在LB固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線后，挑取純化的單菌落與鏈格孢在 PDA平皿上做對峙試驗，放棄有清晰抑菌帶的菌落，保留的菌落進(jìn)一步在棗果上試驗。2)從棗果傷口分離取10個上述獲得的棗果浸泡在150mL滅菌去離子水的三角瓶中，在IOOr · mirT1 旋轉(zhuǎn)振蕩器中清洗2次。挑取棗果，每果刺3mmX3mm傷口一個，每處理3個果實。在每個 傷口放1次和2次洗液各20 μ L，2h后接種20 μ 1鏈格孢孢子懸浮液(1 X IO6孢子πιΓ1)，在 25°C下保濕培養(yǎng)7d后，選擇棗果上未顯示病癥的傷口，用滅菌接種針刮取表層，經(jīng)連續(xù)稀 釋后，取此懸浮液100 μ L涂在LB固體培養(yǎng)基上，Id后把具有不同形態(tài)特征的單一菌落，在 LB平皿上劃線，挑取純化后的單菌落與鏈格孢做對峙試驗，放棄有抑菌帶的菌落，在棗果上 試驗。3)從棗果上篩選挑取的棗果試材成熟度一致，無病，大小均勻。經(jīng)表面消毒后，每果刺3mm X 3mm 傷口一個，移入從棗果表面和傷口分離的酵母菌懸浮液(IXlO8Cfu mrOsOyLJh后接種 20 μ L鏈格孢孢子懸浮液(IX IO6孢子πιΓΟ^δ 下保濕培養(yǎng)7d后，統(tǒng)計果實的發(fā)病率和病 斑直徑，以滅菌水作為對照。每個分離菌株處理24個果，每組8個果。試驗重復(fù)3次。隨 后選取拮抗效果比較理想的菌株，進(jìn)一步擴大供試棗果群體量。每菌株取40個果，每組8 個果，分別培養(yǎng)5d、7d、9d后統(tǒng)計棗果的發(fā)病率和病斑直徑，試驗重復(fù)3次。4)分離結(jié)果從棗果面和傷口兩種途徑，分離到138個酵母菌株，其中酵母菌XY201菌株有顯著 拮抗效果，其發(fā)病率和病斑直徑均顯著低于對照(P < 0. 05)，拮抗酵母菌比對照發(fā)病率下 降了 100% (表1)。選擇XY201在棗果上重復(fù)試驗，從表2可知，拮抗酵母菌XY201，在培養(yǎng) 5d、7d時，發(fā)病率和病斑直徑均為0 ；當(dāng)9d時，比對照發(fā)病率下降了 100%。因此，對有顯著 拮抗效果的酵母菌XY201進(jìn)行鑒定。表1棗果實傷口接種拮抗菌和細(xì)交鏈格孢后的發(fā)病率和病斑直徑*
菌株發(fā)病率(％)病斑直徑(mm)XY201ObObControl100a19.8a*同列不同字母表示鄧肯式多重差異范圍檢測在P = 0. 05水平上差異顯著。*表中數(shù)據(jù)是果實在25°C下接種病菌7d后30個傷口的平均值。表2拮抗菌在棗果實傷口上對細(xì)交鏈格孢的抑制效果*
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權(quán)利要求
梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov.XY201T]在防治植物病害中的應(yīng)用。
2.梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]在制備防治植物病害菌 劑中的應(yīng)用；或梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]在果蔬采后保鮮中的應(yīng) 用；所述果蔬采后保鮮為在果蔬采后，抑制果蔬感染植物病害。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物病害為黑斑病害、腐爛病害、褐腐病、青霉病害、軟腐病害、青綠霉病害或灰霉 病害。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述黑斑病害的病原菌為細(xì)交鏈格孢[Alternaria alternate (Fr. )Keissler]； 所述腐爛病害的病原菌為多隔鐮孢霉[Fusarium decemcellulare Brick.]；所述褐腐 病害的病原菌為褐腐串珠霉[Monilia fructicola Poll.]；所述青霉病害的病原菌 為擴展青霉[Penicillium expansum(Lk.)Thom]；所述軟腐病害的病原菌為葡枝根霉 [Rhizopusstolonifer (Ehrenb. ex Fr.)Vui 11.]；所述青綠霉病害的病原菌為意大利青霉 [Penicilliumitalicum Wehmer]或指狀青β [Penicillium digitatum Sacc.]。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述黑斑病害為冬棗黑斑病害，所述腐爛病害為冬棗腐爛病害，所述軟腐病害為蘋果 軟腐病害；所述褐腐病害為冬棗褐腐病害，所述青霉病害為冬棗青霉病害或蘋果青霉病害， 所述青綠霉病害為柑桔青綠霉病害；所述灰霉病害為葡萄灰霉病害。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的應(yīng)用所述菌劑，其活性成分為如下1)、2)或3)或 4)所示1)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]；2)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的組合物；3)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組合物；4)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？说慕M合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的組 合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化 鈣的配比為(IXlO6Cfu Iiir1-IXlO7Cfu ml—1) (20g F1-IOOg Γ1)，所述梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣的配比具體為 1 X IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfumr1 20g F\50g Γ1 或 IOOg Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組合物 中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因的配 比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述撲海因的配比具體為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施保克的組合物 中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述施保克的配比為(IXlO6Cfu IIir1-I X IO7Cfu mr1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述施?？说呐浔染唧w為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；2)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T] 與所述氯化鈣均為獨立包裝；3)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T] 與所述撲海因均為獨立包裝；4)所示的組合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T] 與施?？司鶠楠毩b。
8.一種防治植物病害菌劑，其活性成分如下1)或2)或3)所示1)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的組合物；2)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組合物；3)、梅奇酵母菌[Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？说慕M合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的菌劑，其特征在于所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與氯化鈣的組 合物中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化 鈣的配比為(IXlO6Cfu Iiir1-IXlO7Cfu πιΓ1) (20g F1-IOOg Γ1)，所述梅奇酵母菌 [Metschnikowiazizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣的配比具體為 1 X IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfumr1 20g F\50g Γ1 或 IOOg Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與撲海因的組合物 中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因的配 比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu πιΓ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述撲海因的配比具體為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？说慕M合物 中，所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述施?？说呐?比為(IXlO6Cfu Iiir1-I X IO7Cfu πιΓ1) 50 μ g m Γ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicolasp. nov. XY201T]與所述施?？说呐浔染唧w為(IX IO6Cfu πιΓ1 或 1 X IO7Cfu ι Γ1) 50 μ g πιΓ1 ；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述氯化鈣均為獨 立包裝；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與所述撲海因均為獨 立包裝；所述梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp. nov. XY201T]與施?？司鶠楠毩b。
10.權(quán)利要求8或9所述的菌劑在防治植物病害中的應(yīng)用；或權(quán)利要求8或9所述的菌劑在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用；所述果蔬采后保鮮為在果蔬 采后，抑制果蔬感染植物病害。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物防治菌劑。本發(fā)明提供了梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov.XY201T]在防治植物病害中的應(yīng)用，還提供了梅奇酵母菌[Metschnikowia zizyphicola sp.nov.XY201T]在制備防治植物病害菌劑中的應(yīng)用及在果蔬采后保鮮中的應(yīng)用。所述植物病害為黑斑病害、腐爛病害、灰霉病害、青霉病害、軟腐病害、褐腐病害和青綠霉病害。所述果蔬采后保鮮為水果和蔬菜腐爛病的抑制。本發(fā)明的實驗證明，分離得到梅奇屬新種(Metschnikowia zizyphicola sp.NovXY201T)，對棗果黑斑病及黃瓜和茄子腐爛病等具有顯著的防治作用。
文檔編號C12N1/16GK101946805SQ20101029450
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者薛夢林 申請人:薛夢林