專利名稱：冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取DNA的方法，特別是一種冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體 DNA的方法。
背景技術(shù)：
海膽屬棘皮動物門海膽綱，是一類較常見的海洋無脊椎動物，也是生物科學史上最早被使用的模式生物，它的卵子和胚胎對早期發(fā)育生物學的發(fā)展具有舉足輕重的作用。 海膽受精卵經(jīng)早期胚胎發(fā)育、浮游幼體、匍匐變態(tài)三個主要發(fā)育階段發(fā)育至稚海膽。海參屬棘皮動物門海參綱，是一種經(jīng)濟價值很高的水產(chǎn)動物，海參發(fā)育也經(jīng)由浮游幼體發(fā)育到稚海參。海參、海膽幼體形態(tài)小，一般不超過1mm，另外，在變態(tài)過程中，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、棲息方式、攝食習性等發(fā)面發(fā)生很大變化，因此死亡率也明顯增加，因此提取幼體基因組DNA進行相關(guān)分析研究具有了一定意義。水產(chǎn)動物的DNA提取主要見于成體，幼體DNA的提取較少，目前所見的海洋水產(chǎn)動物幼體DNA的提取方法為DMSO固定法，其方法為將幼體樣品保存在終濃度為20%的DMSO 固定液中，實驗時再從固定液中取出幼體，用純水把固定液沖洗干凈，這一步驟較為麻煩， 而且DMSO為強毒性物質(zhì)，對實驗者傷害很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作過程簡單、無毒副作用、對操作者無傷害的冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體DNA的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體DNA的方法，步驟如下a、在解剖鏡下用微量移液器取棘皮動物幼體放入離心管中，并在_80°C條件下冷凍保存；b、將裝有棘皮動物幼體的離心管取出解凍，并在解凍后10分鐘內(nèi)向離心管中加入15ul裂解液，Iul的0. 3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55°C水浴鍋中裂解3小時，期間每隔半小時振蕩搖勻一次；所述裂解液的組分及終濃度為10mmOl/LTriS-Cl，50mmOl/L KCL, 0. 5% Tween-20, PH8. 0 ；c、裂解完后把水浴鍋溫度升至85°C，水浴15分鐘，以滅活蛋白酶K ；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產(chǎn)物，微衛(wèi)星擴增PCR體系組成如下反應體系需加體積
DNA模板Iul
IOXbuffer2.5ul
引物1.Oul/each
d NTP2.2ul
MgCl 21.5ul
Taq0.35ul
dd H2015. 45ulTotal25uL·本發(fā)明的冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體DNA的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，操作簡單，容易控制，無毒副作用，對操作者沒有任何傷害。
具體實施例方式以海膽為例，步驟如下a、在解剖鏡下用微量移液器取1個海膽幼體放入0. 2ml的離心管中，并在_80°C條件下冷凍保存；b、將冷凍的裝有海膽幼體的離心管取出解凍，并在解凍后10分鐘內(nèi)向離心管中加入15ul裂解液，Iul的0. 3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55°C水浴鍋中裂解3小時，期間每隔半小時振蕩搖勻一次；所述裂解液的組分及終濃度為10mmol/L Tris-Cl, 50mmol/L KCL， 0. 5% Tween-20, PH8. 0 ；c、裂解完后把水浴鍋溫度升至85°C，水浴15分鐘，以滅活蛋白酶K ；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產(chǎn)物，微衛(wèi)星擴增PCR體系組成如下反應體系需加體積
DNA模板Iul
IOXbuffer2. 5ul
引物1. Oul/each
d NTP2. 2ul
MgCl 21. 5ul
Taq0. 35ul
dd H2015. 45ul
Tota25uL·
對于海參采用上述同樣的方法操作。
將擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，取5ul擴增產(chǎn)物混合3ul上樣緩沖
液在瓊脂糖凝膠上點樣進行檢測，檢測結(jié)果顯示通過此方法獲得的DNA質(zhì)量好，能用于進行各種分子生物學實驗分析。
權(quán)利要求
1. 一種冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體DNA的方法，其特征在于步驟如下a、在解剖鏡下用微量移液器取棘皮動物幼體放入離心管中，并在-80°C條件下冷凍保存；b、將裝有棘皮動物幼體的離心管取出解凍，并在解凍后10分鐘內(nèi)向離心管中加入 15ul裂解液，Iul的0. 3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55°C水浴鍋中裂解3小時，期間每隔半小時振蕩搖勻一次；所述裂解液的組分及終濃度為10mmOl/LTriS-Cl，50mmOl/L KCL,0. 5% Tween-20, PH8. 0 ；c、裂解完后把水浴鍋溫度升至85°C，水浴15分鐘，以滅活蛋白酶K；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產(chǎn)物，微衛(wèi)星擴增PCR體系組成如下反應體系需加體積 DNA模板IulIOXbuffer 2. 5ul 引物l.Oul/eachd NTP2. 2ulMgCl21. 5ulTaq0. 35uldd H2015.45ulTotal25ul0
全文摘要
冷凍法提取棘皮動物變態(tài)前幼體DNA的方法，步驟為取棘皮動物幼體放入離心管中，并在-80℃條件下冷凍保存；解凍后10分鐘內(nèi)向離心管中加入15ul裂解液，1ul的0.3mg/ml的蛋白酶K，然后水浴裂解3小時，每隔半小時振蕩搖勻一次；裂解液的組分及終濃度為10mmol/L Tris-Cl，50mmol/LKCL，0.5％Tween-20，pH8.0；溫升至85℃，水浴15分鐘；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產(chǎn)物，微衛(wèi)星擴增PCR體系組成如下DNA模板1ul、10×buffer2.5ul、引物1.0ul/each、d NTP2.2ul、MgCl21.5ul、Taq0.35ul、ddH2O15.45ul、Total25ul。本方法操作簡單，對操作者沒有任何傷害。
文檔編號C12N15/10GK102409038SQ20101029134
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者丁君, 常亞青, 趙新亞 申請人:大連海洋大學