專利名稱：與番茄苗期耐鹽主效qtl緊密連鎖的分子標記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種番茄苗期耐鹽主效 QTL(Quantitative Tratit Loci，數(shù)量性狀位點)緊密連鎖的分子標記及其獲得方法和應(yīng) 用的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番茄(Solanum lycopersicum)屬茄科番茄屬，廣泛栽培于世界各地，不僅可用于 鮮食，而且可加工成不同類型的番茄制品。然而，隨著復(fù)種指數(shù)的提高，水、肥、農(nóng)藥尤其 是長期氮肥施用量的大幅度增加，無論是露地還是保護地均已出現(xiàn)不同程度的次生鹽漬 化現(xiàn)象，嚴重影響了番茄的正常生長與發(fā)育(李廷軒，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2001，14(SUppl.) 103-107)。與硬粒小麥、玉米、馬鈴薯、甜菜和向日葵等作物相比，番茄為中度鹽敏感植物 (Katerji N, Agricultural WaterManage (農(nóng)業(yè)灌溉水管理)，2001，47 :1_8)，而且番茄與其 它作物一樣，耐鹽性受生長發(fā)育不同階段的調(diào)控，每一個生長發(fā)育階段的耐鹽性和其它階 段基本不相關(guān)，每一個生長發(fā)育階段都受多基因控制，而且受環(huán)境影響較大。芽期和苗期對 鹽更敏感，隨著株齡的增加，耐鹽性呈現(xiàn)增加的趨勢，開花和座果期可以忍受使苗期致死的 鹽濃度(Mittova V，Journal of Experimental Botany (植物試驗學(xué)報)，2004，55 (3") 1105-1113)。鹽害不僅影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重時可導(dǎo)致植株死亡。目前，無論是保護 地還是露地番茄生產(chǎn)，主要采用育苗移栽；另外，鹽脅迫下番茄植株營養(yǎng)生長與產(chǎn)量呈正相 關(guān)，良好的營養(yǎng)生長是后期產(chǎn)量形成的重要基礎(chǔ)。因此，在鹽堿含量較高的土壤栽培番茄， 幼苗期耐鹽不僅可提高番茄移栽的成活率，而且是未來形成產(chǎn)量的重要基礎(chǔ)。耐鹽性鑒定是番茄耐鹽育種的重要環(huán)節(jié)。只有對育種材料的耐鹽性進行客觀準 確的評價，才能進行有效的選擇。目前育種工作者普遍采用的耐鹽性鑒定指標有形態(tài)指 標、生理生化指標。大量前人工作(吳運榮，浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，1999， 25(6) :645-649 ；費偉，上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2005，23 (1) 5-9 ；Foolad MR, HortSciene (園藝作物科學(xué))，1997，32 (2) :296_300)已表明。番茄耐鹽的遺傳機理復(fù)雜； 常規(guī)育種實踐中，對于耐鹽材料的選擇是十分困難的一方面選育周期長，需要經(jīng)歷雜交和 回交復(fù)雜的選擇程序，另一方面鹽害的發(fā)生受很多因素的綜合影響，例如空氣溫度、空氣 濕度和土壤含水量等，致使鑒定耐鹽材料的過程不易控制。這些都是導(dǎo)致番茄耐鹽育種進 展緩慢的重要原因。為了豐富我國番茄品種的遺傳資源，改良番茄的耐鹽性，選育耐鹽性強、品味好的 品種一直是番茄育種的重要目標。目前番茄主要是以育苗移栽為主，因此番茄苗期耐鹽就 顯的尤為重要，近幾年發(fā)展起來的分子標記輔助育種技術(shù)，通過構(gòu)建重要番茄耐鹽品種的 遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(Quantitative TratitLoci, QTL)分析，對于找到與番茄耐鹽主 效QTL緊密連鎖(或共分離)的分子標記具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連 鎖的分子標記。比現(xiàn)有技術(shù)在鑒定結(jié)果與田間耐鹽吻合率明顯提高，不受環(huán)境條件的影響， 節(jié)約了成本，提高了育種和選擇效率。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的通過構(gòu)建重要番茄耐鹽品種的遺傳圖譜和數(shù)量 性狀位點(Quantitative Tratit Loci, QTL)分析，找到與番茄耐鹽主效QTL緊密連鎖(或 共分離)的分子標記。使用與某一特定番茄耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，實現(xiàn)對番茄 種質(zhì)材料在幼苗期進行早代篩選，淘汰鹽敏感的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率。本發(fā)明具體提供了一種番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，包括以 下步驟(1)以野生番茄S.permellii LA716的76個漸滲系中苗期耐鹽漸滲系IL7-5為 材料，此漸滲系群體是以鹽敏感普通番茄S. Iycopersicum M82為遺傳背景，耐鹽漸滲系 IL7-5的亞漸滲系IL7-5-5與IL7-5含有相同的耐鹽QTL。(2)番茄苗期鹽敏感品種M82 (母本)和番茄苗期耐鹽漸滲系IL7-5 (父本)雜交， 得到雜種F1。(3)由雜種F1自花授粉獲得1338株F2單株，提取每個F2單株的基因組DNA。(3)苗期耐鹽鑒定，鹽脅迫處理12d后開始調(diào)查鹽害情況，根據(jù)鹽害的萎黃、壞疽、 枯萎不同程度，將鹽害劃分為0-10個等級，并根據(jù)耐鹽分級情況，將分級數(shù)轉(zhuǎn)換為耐鹽成 活百分率。(4)選取在耐鹽亞漸滲系IL7-5-5與鹽敏感品種M82之間具有擴增多態(tài)性的SSR、 CAPS和AFLP引物組合；擴增產(chǎn)物SSR、AFLP或經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后的擴增產(chǎn)物CAPS，在6 % 變性聚丙烯酞胺凝膠SSR、AFLP和1. 5%瓊脂糖凝膠CAPS上電泳分離后，獲得多態(tài)性分子 標記。(5)以已獲得的IL7-5-5上的側(cè)翼標記SSR285篩選1338株F2單株，根據(jù)差異性 標記建立了一個255株的F2重組群體。(6)根據(jù)已獲得的在IL7-5-5與M82之間具有多態(tài)性的4個特異性標記U231219、 C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49，對255個F2重組群體進行遺傳分析，獲得分子標記資 料。(7)將255株F2重組單株的耐鹽成活率與遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖 和QTL分析，以3. 0為LOD閥值，確定與番茄苗期耐鹽主效QTL連鎖的分子標記SSR285、 U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49。本發(fā)明中，根據(jù)已獲得的在IL7-5-5與M82之間具有多態(tài)性的5個特異性標記 SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49中，所述的多態(tài)性分子標記，其引物序 列為SSR285上游引物為5 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219上游引物為5 ‘ 5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2-At4g30580 上游引物為 5
AGTGGCTCTCACCTACTGCG ‘ 3，下游引物為 AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG ‘ 3，下游引物為 TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物為 5' TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ； AFLP弓丨物E35/M49組合上游引物E35為5 ‘ GACTGCGTACCAATTCACA ‘ 3，下游弓丨物 為 M49 為 5' GATGAGTCCTGAGTAACAG‘ 3 ； AFLP弓丨物E39/M50組合上游引物E39為5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA ‘ 3，下游弓丨物 為 M50 為 5' GATGAGTCCTGAGTAACAT‘ 3。本發(fā)明中，由于IL7-5-5片段很短，僅為0. 9cM,在第7條染色體2. 0-2. 9cM片段之 間，在雜交組合中其發(fā)生交換的幾率很小，而且構(gòu)建F2臨時性群體時，往往容易遺失耐鹽 QTL所在的片段，所以以重疊但片段較長的耐鹽漸滲系IL7-5與鹽敏感遺傳背景材料M82為 親本材料。本發(fā)明中，在鹽脅迫處理后進行調(diào)查鹽害情況中，根據(jù)鹽害的萎黃、壞疽、枯萎不 同程度，將鹽害劃分為0-10個等級，具體分級標準如下0級完全致死，10級植株健康， 沒有任何鹽害癥狀。根據(jù)耐鹽分級情況，將分級數(shù)轉(zhuǎn)換為耐鹽成活百分率，即耐鹽成活率％ =級數(shù)/11 X 100。耐鹽成活率(SP)用于統(tǒng)計分析和QTL定位，為遺傳分析的需要，劃定 耐鹽(SP彡45% )，耐敏感(SP < 45% )0本發(fā)明中，將255株的F2重組單株的耐鹽成活率與遺傳連鎖圖中的分子標記進行 連鎖和QTL分析，以3. 0為LOD閥值，大于3. 0說明存在一個QTL位點，確定與番茄苗期耐 鹽主效 QTL 連鎖的分子標記 SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49。本發(fā)明所涉及的與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記及其應(yīng)用，將分子 標記SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49用于番茄品種或品系的基因型 檢測，以判斷該品種或品系在苗期是否具有耐鹽性，包括以下步驟(1)以耐鹽漸滲系IL7-5或亞漸滲系IL7_5_5為父本或母本與其他番茄雜交并繁 衍至F2代以上；(2)對通過步驟(1)獲得的番茄單個植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否 存在與耐鹽主效QTL相連鎖的分子標記；如有苗期耐鹽主效QTL異側(cè)的3個以上分子標記 同時出現(xiàn)，預(yù)測番茄苗期達到耐鹽水平。本發(fā)明中，將SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50 和 E39/M49 分子標記用于 番茄種質(zhì)材料的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有耐鹽性。本發(fā)明中所選用的野生番茄S. pennellii LA716的76個漸滲系(IL)材料，來源 于美國番茄遺傳中心(TGRC)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過引進途徑可以獲得。本發(fā)明中所選用的番茄S. Iycopersicum M82，來源于普通栽培番茄，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通過購買或贈予途徑可以獲得。本發(fā)明中所選用的F1,來源于M82XIL7-5，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)雜交途
徑可以獲得。本發(fā)明中所選用的F2，來源于F1自交產(chǎn)生，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過常規(guī)自交途 徑可以獲得。本發(fā)明以IL7-5-5及其衍生品種或品系為父本或母本與其它番茄雜交并繁衍至F2 代以上。所述IL7-5-5及其衍生品種或品系，是指以IL7-5-5為親本，通過常規(guī)雜交、或采 用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或用別的物理或化學(xué)方法雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加 倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的番茄品種或品系。
本發(fā)明篩選的SSR標記與CAPS標記的序列信息，都可以通過Cornell大學(xué)網(wǎng)站 (http//www. SRn. Cornell, edu/)免費獲得。本發(fā)明篩選的AFLP標記的序列信息，可以通過一般生物網(wǎng)站或已公開發(fā)表的論 文文獻免費獲得。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下效果1.本發(fā)明能克服常規(guī)育種中番茄苗期耐鹽性鑒定易受環(huán)境影響，在幼苗期就可通 過檢測分子標記對番茄植株的耐鹽性進行預(yù)測和篩選，淘汰鹽敏感植株，而利用常規(guī)耐鹽 育種方法選育一個新品種或新品系，往往需要6-8年，甚至更長時間，同時每代都需要對群 體進行耐鹽性鑒定，工作量很大。此外，耐鹽性鑒定又往往受環(huán)境條件的影響，而分子標記 輔助選擇不受環(huán)境條件的影響，在低世代就可以對耐鹽性進行選擇，將大大減少育種家的 工作量，提高選擇的準確性和育種效率。本發(fā)明對耐鹽漸滲系IL7-5和鹽敏感品種M82雜 交獲得的重組F2代每個單株的基因型和耐鹽性表型數(shù)據(jù)進行QTL和遺傳連鎖分析，獲得與 番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和 E39/M49。通過檢測番茄種質(zhì)材料的DNA中是否有分子標記，可預(yù)測其耐鹽水平，從而可加 快至少50%的選擇進度，減少至少80%的工作量，選擇的準確率由85%提高到100%。2.本發(fā)明是一種多基因控制的耐鹽性的技術(shù)，本發(fā)明使用的IL7-5是耐鹽漸滲 系，在國際上已經(jīng)廣泛被育種家使用作為耐鹽的親本，其苗期耐鹽性主效QTL相連鎖的分 子標記為首次報道，利用與苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以不受環(huán)境條件的 影響，番茄種質(zhì)材料在早代苗期進行篩選，節(jié)約成本，提高育種和選擇效率。


圖1為6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；樣 本從左到右第2、3泳道為IL7-5-5，第4、5泳道為M82。圖2為1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；樣本從左 到右第2、3泳道為IL7-5-5，第4、5泳道為M82。圖3為1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖，M是IOObp plus DNA Ladder marker ；樣本從左 到右第2、6泳道為IL7-5-5，第3、7泳道為M82。圖4為6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，樣本從左到右第1泳道為IL7-5-5，第2、 3泳道為M82。圖5為6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，樣本從左到右第1、2、3、4泳道為I L7-5-5，第 5、6、7、8 泳道為 M82。圖6為番茄苗期耐鹽主效QTL(Stq7b)連鎖片段定位分析示意圖。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中設(shè)備和材料有PCR儀選用MJ PTC-200熱循環(huán)儀；引物由上海生物工程責(zé)任有限公司提供；Taq酶 采用上海生工Promega進口分裝；緩沖液采用上海生工Promega進口分裝；dNTPs中dATP， dCTP，dGTP，dTTP各取IOmM組成混合液均購于大連寶生物責(zé)任有限公司和Promega進口原裝；限制性內(nèi)切酶選用 TaqI，EcoRI，EcoRV, PstI，HindIII，XbaI，DraI，HinfIII, HaeII， PvuII, BamHI, AluI, MspI, Seal, HhaI, RsaI均購于大連寶生物責(zé)任有限公司；其他試劑購 于北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心。栽培種S. Iycopersicum M82及來自S. pennellii LA716的76個漸滲系。漸滲系 群體是基于普通番茄S. Iycopersicum M82遺傳背景，利用側(cè)翼標記，將野生種S. pennellii LA716片段滲入構(gòu)建，包括初始含有較長染色體片段的50個品系，及含有的較短片段的26 個品系，這些含有較短片斷的品系與50個品系中的一些品系基本完全重疊，為精細定位提 供了基礎(chǔ)。全套漸滲系基本覆蓋了野生種LA716的整個基因組，片段平均長度約12. 3cM。 上述材料均由美國番茄遺傳資源中心(Tomato Genetic Resource Center, TGRC)提供，種 子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所繁殖。1. 5%瓊脂糖凝膠采用IOOml TBE溶液中含1. 5g瓊脂糖；6%變性聚丙烯酰胺凝膠 采用IOOml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含42. Og尿素、5. 7g丙烯酰胺和0. 3g甲叉雙丙烯酰胺。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實 施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖分子標記的獲得(1)采用耐鹽漸滲系IL7-5與番茄鹽敏感品種M82雜交產(chǎn)生F1雜種。(2)F1自交產(chǎn)生1338個F2單株，分離每個F2單株的基因組DNA，利用耐鹽亞漸滲 系IL7-5-5上的側(cè)翼標記SSR285篩選1338株F2單株，根據(jù)差異性標記建立了一個255株 的F2重組群體。(3)根據(jù)已有方法(宋建，上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2006，24(6) 524-528 ；吳玉輝，中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24(4) :80_84 ；雷娜，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008， 39(3) :29-33)，分離親本IL7-5-5與M82的DNA，利用微衛(wèi)星(SSR)、酶切擴增多態(tài)性序列 (CAPS)和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)引物對倆親本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物(SSR、AFLP) 或經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后的擴增產(chǎn)物(CAPS)，在6%變性聚丙烯酞胺凝膠(SSR、AFLP)和 1.5%瓊脂糖凝膠(CAPS)上電泳分離。結(jié)果從2對SSR引物中獲得了 1對具有多態(tài)性標記 的引物，即SSR285，參見附圖1。從4對CAPS引物中獲得了 2對具有多態(tài)性標記的引物，即 U231219和C2_At4g30580，參見附圖2和附圖3，相應(yīng)的消化內(nèi)切酶分別為Cfo I和RsaI。 從10對AFLP引物中獲得了 2對具有多態(tài)性標記的引物，即E35/M49和E39/M50，參見附圖 4和附圖5。利用這些在兩個親本IL7-5-5與M82之間具有擴增多態(tài)性的引物，對255個F2 重組單株進行分析，獲得分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)。(4)基于遺傳連鎖交換定律，用分子標記分析資料構(gòu)建番茄遺傳圖譜，將獲得的多 態(tài)性數(shù)據(jù)采用軟件Joinmap4. 0，設(shè)定LOD ^ 3.0,使用Kosambi函數(shù)構(gòu)建IL7-5-5的遺傳連 鎖圖譜。(5)苗期耐鹽鑒定2009年春天在溫室進行，將1338個F2單株的種子播種在按體 積比計的草炭、珍珠巖、蛭石以1 1 1的混合基質(zhì)中，按常規(guī)溫室管理。待幼苗長到4片 真葉時，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛭石清洗干凈，然后移栽到盛有1/2濃度的Hoagland 標準營養(yǎng)液。每一個塑料容器15株，每一個塑料容器包括至少1株M82作為對照，日補充空 氣三次、每次30分鐘，并每隔兩天將蒸發(fā)掉的水分用無離子水補充到原體積，一周后開始 加鹽。每天按50mM NaCl+5mM CaC12增加鹽濃度，直至終鹽濃度達到700mM NaCl+70mMCaC12為止。當鹽濃度達到終濃度后第12天調(diào)查耐鹽級數(shù)，根據(jù)鹽害的萎黃、壞疽、枯萎不同癥 狀，按照耐鹽程度分為0-10個等級。具體分級標準如下；0級完全致死。1級植株葉枯萎， 莖干直立。2級植株葉枯萎，莖干直立且綠色。3級植株葉一半萎黃，一半枯萎。4級植 株葉大部分萎黃，有少許萎縮綠葉。5級植株葉1/3綠色、2/3萎黃，綠葉萎縮嚴重。6級 植株葉一半綠，一半萎黃，綠葉有萎縮。7級植株葉2/3葉綠色、1/3萎黃，綠葉有萎縮。8 級葉全綠色，有萎縮。9級葉全綠色，有輕微萎縮。10級植株健康，沒有任何鹽害癥狀。根據(jù)耐鹽分級結(jié)果，計算每個單株的耐鹽成活率(SP)，其值用于統(tǒng)計分析和QTL 定位。耐鹽成活率公式如下耐鹽成活率％ (SP)=級數(shù)/IlX 100為遺傳分析的需要，劃定耐鹽(SP彡45% )，耐敏感(SP < 45% )0(6)綜合遺傳圖譜數(shù)據(jù)和耐鹽性鑒定資料，QTL分析采用MapQTL 4. 0軟件，選擇單 區(qū)間作圖法(Single interval mapping, SIM)找到確定的QTL及與其緊密連鎖的分子標 記。利用“Permutation Test”命令，估計連鎖片段在α = 0. 05水平上的LOD閾值。以連 鎖片段上LOD值最高的位置作為QTL的位置。估計QTL的貢獻率和可解釋的表型變異率。 分析發(fā)現(xiàn)在連鎖片段上標記U231219和SSR285之間存在一個QTL位點，與標記U231219、 Ε35/Μ49、Ε39/Μ50 和 SSR285 之間的連鎖距離分別為 0. 36cM、0. 46cM、0. 48cM 和 0. 54cM，而 與標記C2_At4g30580共分離，參見附圖6。其LOD值為8. 1，解釋了 22%的遺傳變異率，見 表1，表明SSR285、U231219、E35/M50和E39/M49標記與IL7-5-5的苗期主效耐鹽QTL緊密 連鎖，且C2_At4g30580標記與IL7-5-5的苗期主效耐鹽QTL共分離。可用于番茄苗期耐鹽 品種和品系的耐鹽性預(yù)測。表1 IL7-5-5片段上苗期耐鹽主效QTL分析
染色體QTL片段LOD連鎖區(qū)間貢獻率％Stq7b7-5-58.1U231219- SSR28522.0實施例二 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，采用宋建，上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2006，24(6) 524-528 ；吳玉輝，中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24 (4) :80_84 ；雷娜，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008， 39(3) :29-33，選取在兩個親本IL7-5-5與M82之間具有擴增多態(tài)性的SSR、CAPS和AFLP引 物組合。經(jīng)PCR擴增后，擴增產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠和6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分 離后，獲得的多態(tài)性標記，分別獲得的多態(tài)性標記為SSR引物SSR285，CAPS標記U231219和 C2-At4g30580, AFLP 標記 E35/M49 和 E39/M50。采用的引物序列分別為SSR285 上游引物為 5 ‘ AGTGGCTCTCACCTACTGCG ‘ 3，下游引物為 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219 上游引物為 5 ‘ AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG ‘ 3，下游引物為5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2-At4g30580 上游引物為 5' TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物為 5' TGA TGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ；AFLP 引物 E35/M49 組合上游引物 E35 為 5' GACTGCGTACCAATTCACA‘ 3，下游引物 為 M49 為 5' GATGAGTCCTGAGTAACAG‘ 3 ；E39/M50 組合上游引物 E39 為 5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA‘ 3，下游引物為 M50 為 5' GATGAGTCCTGAGTAACAT‘ 3。擴增產(chǎn)物SSR和AFLP或經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后的擴增產(chǎn)物CAPS，在6%變性聚丙烯 酞胺凝膠SSR、AFLP和1. 5%瓊脂糖凝膠CAPS上電泳分離后，獲得分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)。結(jié) 果從2對SSR引物中獲得了 1對具有多態(tài)性標記的引物，即SSR285。從4對CAPS引物中 獲得了 2對具有多態(tài)性標記的引物，即U231219和C2_At4g30580，相應(yīng)的消化內(nèi)切酶分別 為Cfo I和Rsa I。從10對AFLP引物中獲得了 2對具有多態(tài)性標記的引物，即E35/M49和 E39/M50。實施例三與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記在F2分離群體中的驗證將獲得的與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記，在IL7-5-5與M82雜 交的F2代的部分植株進行了苗期耐鹽性預(yù)測，先從它們的葉片中分離DNA，然后利用標記 SSR285、C2_At4g30580、U231219、E35/M49 和 E39/M50 的引物對這些 DNA 進行 PCR 擴增，并 通過評判圖譜來確定是否存在相應(yīng)的標記，存在耐鹽主效QTL異側(cè)的3個以上分子標記，說 明該株系是屬于苗期耐鹽的株系，不存在則是鹽敏感的材料。然后基于這些判斷準則對每 個番茄植株的苗期耐鹽性進行預(yù)測。隨后利用加鹽水培的方法測定受測樣品的苗期實際耐 鹽性并與預(yù)測結(jié)果進行對比。結(jié)果見表2，預(yù)測結(jié)果與實測結(jié)果吻合度達到100%。表2 用與苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記預(yù)測分離后代(F2)的苗期耐鹽 性
林系 名稱
ST-03 ST-07
預(yù)測結(jié)果
SSR285
ST IQ
C2_At4g 30580
U231219
E35/M49
E39/M50
苗期耐
鹽性
鹽敏感 鹽敏感
鹽敏感
實際結(jié)果
耐鹽成
活率
9.09 18.18
權(quán)利要求
一種與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得方法，其特征在于，所述的獲得方法包括以下步驟(1)以野生番茄S.pennellii LA716的76個漸滲系中苗期耐鹽漸滲系IL7 5為材料，此漸滲系群體是以鹽敏感普通番茄S.lycopersicum M82為遺傳背景，耐鹽漸滲系IL7 5的亞漸滲系IL7 5 5與IL7 5含有相同的耐鹽QTL；(2)番茄苗期鹽敏感品種M82(母本)和番茄苗期耐鹽漸滲系IL7 5(父本)雜交，得到雜種F1；(3)由雜種F1自花授粉獲得1338株F2單株，提取每個F2單株的基因組DNA；(3)苗期耐鹽鑒定，鹽脅迫處理12d后開始調(diào)查鹽害情況，根據(jù)鹽害的萎黃、壞疽、枯萎不同程度，將鹽害劃分為0 10個等級，并根據(jù)耐鹽分級情況，將分級數(shù)轉(zhuǎn)換為耐鹽成活百分率；(4)選取在耐鹽亞漸滲系IL7 5 5與鹽敏感品種M82之間具有擴增多態(tài)性的SSR、CAPS和AFLP引物組合；擴增產(chǎn)物SSR、AFLP或經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后的擴增產(chǎn)物CAPS，在6％變性聚丙烯酞胺凝膠SSR、AFLP和1.5％瓊脂糖凝膠CAPS上電泳分離后，獲得多態(tài)性分子標記；(5)以已獲得的IL7 5 5上的側(cè)翼標記SSR285篩選1338株F2單株，根據(jù)差異性標記建立了一個255株的F2重組群體；(6)根據(jù)已獲得的在IL7 5 5與M82之間具有多態(tài)性的4個特異性標記U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49，對255個F2重組群體進行遺傳分析，獲得分子標記資料；(7)將255株的F2重組單株的耐鹽成活率與番茄遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以3.0為LOD閥值，確定與番茄苗期耐鹽主效QTL連鎖的分子標記SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49。
2.如權(quán)利要求1所述的與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得方法，其 特征在于，所述的多態(tài)性分子標記中，引物序列分別為SSR285 上游引物為 5' AGTGGCTCTCACCTACTGCG‘ 3，下游引物為 5' CAATTCTCAGGCATGAAACG‘ 3 ；U231219 上游引物為 5' AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG‘ 3，下游引物為 5' TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG‘ 3 ；C2_At4g30580 上游引物為 5' TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC‘ 3，下游引物為 5' TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG‘ 3 ；AFLP 引物 E35/M49 組合上游引物 E35 為 5' GACTGCGTACCAATTCACA‘ 3，下游引物為 M49 為 5 ‘ GATGAGTCCTGAGTAACAG ‘ 3 ；E39/M50 組合上游引物 E39 為 5 ‘ GACTGCGTACCAATTCAGA ‘ 3，下游引物為 M50 為 5 ‘ GATGAGTCCTGAGTAACAT ‘ 3。
3.如權(quán)利要求1所述的與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得方法，其 特征在于，所述的多態(tài)性分子標記中，CAPS標記U231219和C2_At4g30580相應(yīng)的消化內(nèi)切 酶分別為Cfo I和Rsa I。
全文摘要
本發(fā)明公開了與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲得方法。通過番茄苗期耐鹽主效QTL定位；選擇番茄苗期的M82和耐鹽漸滲系IL7-5雜交，得到雜種F1自花授粉獲得群體F2，通過鹽脅迫處理，篩選耐鹽亞漸滲系7-5-5和鹽敏感品種M82之間具有多態(tài)性的分子標記；利用已篩選的IL7-5-5上的側(cè)翼標記對F2群體進行篩選，建立重組F2群體和遺傳分析；通過耐鹽成活率與遺傳連鎖圖中的標記檢測，確定了與番茄苗期耐鹽主效QTL緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明不受環(huán)境條件的影響，對特定苗期耐鹽材料的后代及衍生品系在早代進行篩選，節(jié)約成本，提高育種和選擇效率。
文檔編號C12N15/10GK101974511SQ20101027444
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者余慶輝, 帕提古麗, 楊濤, 楊生保, 王柏柯 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所