專利名稱：南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染宿主的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒物種檢測(cè)技術(shù)，具體涉及南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百 合無(wú)癥病毒是否侵染宿主的快速檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)禾口百合無(wú)癥病毒(Lily symptomless virus,LSV)三種病毒是侵染百 合和唐菖蒲的主要病原物，給種植者帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。南芥菜花葉病毒寄主范圍廣泛， 可以侵染約174屬215種植物，自然侵染并危害多種花卉、瓜類、豆類和果樹，引起花葉、黃 化褪綠、矮化、皺縮甚至壞死等癥狀，為我國(guó)規(guī)定的進(jìn)境植物檢疫性有害生物。BYMV病毒寄 主廣泛，主要寄主為唐菖蒲等觀賞植物和豆科植物。受BYMV侵染的唐菖蒲幼苗生長(zhǎng)勢(shì)減 弱，葉片出現(xiàn)白色碎斑，花雜色，導(dǎo)致切花質(zhì)量下降，種球產(chǎn)量減少，而受BYMV侵染的蠶豆， 種傳率4% 17%，田間發(fā)病率可高達(dá)67% 100%，造成59% 96%的產(chǎn)量損失。百合 受LSV的侵染率高達(dá)73 %，其單獨(dú)侵染時(shí)一股無(wú)明顯癥狀，在自然條件下常與其它病毒復(fù) 合侵染，導(dǎo)致百合葉片嚴(yán)重花葉和整株矮化，影響百合的產(chǎn)量和商業(yè)價(jià)值。南芥菜花葉病毒、百合無(wú)癥病毒和菜豆黃花葉病毒檢測(cè)可采用常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸 附檢測(cè)方法(ELISA)檢測(cè)，但這種檢測(cè)方法靈敏度低，存在偏差；特別是當(dāng)唐菖蒲和百合處 于休眠狀態(tài)時(shí)，種球中病毒濃度較低，采用常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(ELISA)則不能 檢出。鄧叢良等根據(jù)ArMV不同分離物外殼蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物和探 針，建立了檢測(cè)ArMV的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法，例如中國(guó)專利CN1952649A，有效的解決了酶 聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(ELISA)靈敏度低的技術(shù)缺陷。工作人員利用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)侵染百合和唐菖蒲的三種主要病原物(南 芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒)檢測(cè)時(shí)，需要做三次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，速度慢， 因此需要改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的是南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染 宿主的檢測(cè)速度慢的技術(shù)問題。解決上述問題采用如下技術(shù)方案南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥 病毒是否侵染宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟a、從寄主上抽提出待檢測(cè)病毒的總RNA ；b、將總RNA稀釋成RNA溶液；C、以RNA溶液作為模板，進(jìn)行RT-Real time PCR反應(yīng)；在RT-Real time PCR反應(yīng) 體系中包括擴(kuò)增引物、熒光探針；其中擴(kuò)增引物共三組，分別為引物ArMV、引物BYMV和引物 LSV，分別具有如下序列
上游引物ArMV-F 5'-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3‘，
下游引物ArMV-R 5'-TTGCACAACCACTGGCATCT-3‘，
上游引物BYMV-F 5' -GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3‘，
下游引物BYMV-R 5'-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3‘，
上游引物L(fēng)SV-F: 5' -GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3‘，
下游引物L(fēng)SV-R: 5' -GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3‘，
引物ArMV、引物BYMV和引物L(fēng)SV分別根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百 合無(wú)癥病毒的高度保守衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)，并且引物間不互作，其中熒光探針共三種，分別為探針ArMV-P、探針BYMV-P和探針LSV-P ；其中探針ArMV-P是5'端5_羧基熒光素修飾、3‘端5_羧基四甲基羅丹明修飾的序 列5, -FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3'，當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，F(xiàn)AM熒光基團(tuán) 發(fā)射的熒光因與3'端的TAMRA淬滅劑接近而被淬滅，在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切 酶活性將探針切斷，使得FAM熒光基團(tuán)與淬滅劑TAMRA分離，發(fā)射熒光，探針BYMV-P是5'端六氯-6-甲基熒光素修飾、3'端5_羧基四甲基羅丹明修飾 的序列5 ‘ -HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3 ‘，當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，HEX 熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的TAMRA淬滅劑接近而被淬滅，在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶 的5’外切酶活性將探針切斷，使得HEX熒光基團(tuán)與淬滅劑TAMRA分離，發(fā)射熒光，探針LSV-P是5'端5-羧基-X-羅丹明修飾、3'端暗淬滅劑修飾的序列5' -R0 X-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3 ‘，當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，R0X熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光 因與3'端的ECLIPSE淬滅劑接近而被淬滅，在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將 探針切斷，使得FAM熒光基團(tuán)與暗粹滅劑ECLIPSE分離，發(fā)射熒光；d、對(duì)RT-Real time PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光陽(yáng)性檢測(cè)；e、根據(jù)實(shí)時(shí)熒光陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，判斷寄主是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病 毒或百合無(wú)癥病毒侵染，陽(yáng)性表示寄主已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú) 癥病毒侵染，反之陰性表示寄主沒有被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒 侵染。進(jìn)一步的，步驟d還包括采用空白對(duì)照對(duì)RT-PCR反應(yīng)穩(wěn)定性檢測(cè)的步驟；反應(yīng)結(jié) 果為陰性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定正常，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)不穩(wěn)定、可能受到污染，需要重新檢測(cè)。進(jìn)一步的，步驟d還包括采用陰性對(duì)照對(duì)RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定性檢測(cè)的 步驟；反應(yīng)結(jié)果為陰性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定正常，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性則說明 RT-Real time PCR反應(yīng)不穩(wěn)定、可能受到污染，需要重新檢測(cè)。進(jìn)一步的，所述RT-Real time PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為40次。進(jìn)一步的，b步驟中，RNA溶液濃度大于等于總RNA濃度的10_2倍。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的多重RT-Real time PCR檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)寄 主(百合、唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的快速檢 測(cè)。在RT-RealtimePCR體系中加入熒光基團(tuán)，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào) 強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，它是用來確定經(jīng) 過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)段的表達(dá)差異，快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。這種多重檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)侵染百合和唐菖蒲的 三種病毒的一次性同步檢測(cè)，檢測(cè)程序簡(jiǎn)便。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明采用多重RT-Real time PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒的檢測(cè)。根據(jù)南芥 菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒的RNA，設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物和熒光探針， 并借助擴(kuò)增引物和熒光探針對(duì)待鑒定病毒的RNA模板進(jìn)行RT-Real time PCR反應(yīng)，通過對(duì) RT-Realtime PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待鑒定病毒是否包含南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病 毒和百合無(wú)癥病毒三種病毒的快速檢測(cè)。本發(fā)明技術(shù)方案的基本內(nèi)容包括一、建立南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百 合無(wú)癥病毒的多重實(shí)時(shí)RT-Real time PCR檢測(cè)方法；二、設(shè)計(jì)了特異性的擴(kuò)增引物和熒光 探針；三、RT-Realtime PCR 穩(wěn)定性監(jiān)控。一、南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒的多重RT-Real time PCR 檢測(cè)方法反應(yīng)體系總體積為10 μ L反應(yīng)體系。其中IOXOne Step RNA PCR Buffer 1 μ L， 25mmo VLMgCl2 2 μ L, lOmmol/L dNTP Mixture 1 μ L,40U/y L RNase Inhibitor 0. 2 μ L, 5U AMVReverse Transcriptase XL 0. 2μ L,5U AMV-Optimized Taq 0. 2 μ L,10 μ mol/L ArMV,BYMV和LSV的上游引物和下游引物各為0. 4 μ L，5 μ mol/L ArMV,BYMV和LSV探針各 為 0. 4 μ L，ArMV、BYMV 和 LSV 的 RNA 模板各為 0. 2 μ L，RNase Free dH20 1· 2 μ L。反應(yīng)程序50°C反轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性IOmin ；95°C變性15s，60°C退火與延伸 40s, 40個(gè)循環(huán)。二、設(shè)計(jì)了特異性的擴(kuò)增引物和熒光探針根據(jù)ArMV、BYMV和LSV高度保守的衣殼 蛋白基因序列，設(shè)計(jì)檢測(cè)探針和引物。南芥菜花葉病毒序列長(zhǎng)度65bp，其引物和熒光探針序列為上游引物ArMV-F 5 ‘ -TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3 ‘；下游引物ArMV-R 5 ‘ -TTGCACAACCACTGGCATCT-3 ‘；探針ArMV-P :5' -FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3 ‘。BYMV序列長(zhǎng)度90bp，其引物和熒光探針序列為上游引物BYMV-F 5 ‘ -GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3 ‘；
下游弓丨物 BYMV-R 5 ‘ -TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3 ‘；探針BYMV-P :5' -HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3 ‘。LSV序列長(zhǎng)度72bp，其引物和探針序列為上游引物L(fēng)SV-F 5 ‘ -GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3 ‘；下游引物L(fēng)SV-R 5 ‘ -GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3 ‘；探針LSV-P -R0X-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3'。三、RT-Realtime PCR 穩(wěn)定性監(jiān)控以待檢測(cè)病毒抽提出的總RNA為模板，并設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照，驗(yàn)證多重 RT-Realtime PCR方法的穩(wěn)定性。
實(shí)施例1 采用多重RT-Real time PCR對(duì)宿主A(唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃 花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)對(duì)宿主A (唐菖蒲)進(jìn)行檢測(cè)，具體包括如下步驟步驟a、從宿主A (唐菖蒲)中抽提出總RNA ；除去影響RT-Real time PCR反應(yīng)的 多糖、酚類等物質(zhì)；步驟b、將總RNA稀釋成10_2倍的RNA溶液；步驟C、以RNA溶液作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-Real time PCR反應(yīng)；Real time RT-PCR反應(yīng)體系總體積為10 μ L反應(yīng)體系。其中IOXOne Step RNA PCR Bufferl μ L,25mmol/L MgCl2 2 μ L,10mmol/L dNTP Mixture 1 μ L,40U/y L RNase Inhibitor 0.2μ L,5 U AMV Reverse Transcriptase XL 0.2μ L,5U AMV-Optimized Taq 0. 2 μ L，10 μ mol/L引物ArMV、弓丨物BYMV和引物L(fēng)SV的上游弓丨物和下游弓丨物各為0. 4 μ L， 5 μ mol/L探針ArMV、探針BYMV和探針LSV各為0. 4 μ L, ArMV,BYMV和LSV的RNA模板各為 0. 2μ L, RNase Free dH20 1· 2 μ L。RT-Real timePCR 反應(yīng)程序50°C 反轉(zhuǎn)錄 30min ；95 °C 預(yù)變性 IOmin ；95°C 變性 15s，60°C退火與延伸40s，40個(gè)循環(huán)。弓丨物ArMV、引物BYMV和引物L(fēng)SV是分別根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和 百合無(wú)癥病毒的高度保守衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)，并且引物間不互作的三組擴(kuò)增引物，三 組擴(kuò)增引物分別具有如下序列上游引物ArMV-F 5 ‘ -TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3 ‘，下游引物ArMV-R 5 ‘ -TTGCACAACCACTGGCATCT-3 ‘，上游引物BYMV-F 5 ‘ -GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3 ‘，下游引物BYMV-R :5' -TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3 ‘，上游引物L(fēng)SV-F 5' -GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3‘，下游引物L(fēng)SV-R 5' -GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3‘，探針ArMV-P、探針BYMV-P和探針LSV-P是分別根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉 病毒和百合無(wú)癥病毒高度保守的衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)的三種熒光探針，其分別具有如下 序列探針ArMV-P 5 ‘ -FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3 ‘探針BYMV-P 5 ‘ -HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3 ‘探針LSV-P 5 ‘ -R0X-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3 ‘；步驟d、實(shí)時(shí)對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光陽(yáng)性檢測(cè)、穩(wěn)定性檢測(cè)；步驟e、判斷宿主A(唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥 病毒侵染?？瞻讓?duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，表明RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果可以采用。待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性，故宿主A(唐菖蒲)已經(jīng)被 南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染。對(duì)比例1采用DAS-ELISA檢測(cè)方法對(duì)宿主A (唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉 病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)
采用DAS-ELISA檢測(cè)方法、分三次分別對(duì)宿主A(唐菖蒲)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、 菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主A(唐菖蒲)同時(shí)被南芥 菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果相同，但 DAS-ELISA檢測(cè)方法繁瑣復(fù)雜。實(shí)施例2采用多重RT-Real time PCR對(duì)宿主B (東方百合)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆 黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)本檢測(cè)步驟與實(shí)施例1檢測(cè)方法基本相同，不同之處在于步驟a中的宿主不同。最終，空白對(duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 顯示陽(yáng)性，結(jié)果表明，該宿主B (東方百合)已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合 無(wú)癥病毒侵染。對(duì)比例2采用DAS-ELISA方法檢測(cè)對(duì)宿主B (東方百合)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花 葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)采用DAS-ELISA方法、分三次分別對(duì)宿主B(東方百合)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、菜 豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主B (東方百合)被百合無(wú)癥病 毒侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例2檢測(cè)結(jié)果相同。實(shí)施例3采用多重RT-Real time PCR對(duì)宿主C(亞洲百合)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆 黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)本檢測(cè)步驟與實(shí)施例1檢測(cè)方法基本相同，不同之處在于步驟a中的宿主不同。最終，空白對(duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 為陽(yáng)性，結(jié)果表明，該宿主C(亞洲百合)已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú) 癥病毒侵染。對(duì)比例3采用DAS-ELISA方法檢測(cè)，對(duì)宿主C (亞洲百合)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、菜豆黃花 葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)采用DAS-ELISA方法、分三次分別對(duì)宿主C(亞洲百合)是否被南芥菜花葉病毒、 菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主C (亞洲百合)被百合無(wú) 癥病毒侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果相同，但DAS-ELISA方法繁瑣復(fù)雜。實(shí)施例4采用多重RT-Real time PCR對(duì)宿主D (東方百合)是否被南芥菜花葉病 毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)本檢測(cè)步驟與實(shí)施例1檢測(cè)方法基本相同，不同之處在于步驟a中的宿主不同。最終，空白對(duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 顯示陽(yáng)性，結(jié)果表明，該宿主D (東方百合)已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合 無(wú)癥病毒侵染。對(duì)比例4采用DAS-ELISA方法檢測(cè)對(duì)宿主D (東方百合)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花 葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)
采用DAS-ELISA方法、分三次分別對(duì)宿主D(東方百合)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、菜 豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主D (東方百合)被南芥菜花葉 病毒侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例4檢測(cè)結(jié)果相同，但DAS-ELISA方法繁瑣復(fù)雜。實(shí)施例5 采用多重RT-Real time PCR對(duì)宿主E (唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃 花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)本檢測(cè)步驟與實(shí)施例1檢測(cè)方法基本相同，不同之處在于步驟a中的宿主不同。最終，空白對(duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 為陽(yáng)性，結(jié)果表明，該宿主E (唐菖蒲)已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥 病毒侵染。對(duì)比例5采用DAS-ELISA方法檢測(cè)對(duì)宿主E (唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉 病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)采用DAS-ELISA方法、分三次分別對(duì)宿主E(唐菖蒲)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、菜豆 黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主E (唐菖蒲)被菜豆黃花葉病毒 侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例4檢測(cè)結(jié)果相同，但DAS-ELISA方法繁瑣復(fù)雜。實(shí)施例6采用多重Real time RT-PCR對(duì)宿主F(唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃 花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)本檢測(cè)步驟與實(shí)施例1檢測(cè)方法基本相同，不同之處在于步驟a中總RNA從宿主 F(唐菖蒲)、已知病毒ToRSV、已知病毒TRSV、已知病毒LMoV和已知病毒CMV中抽取的。最終，空白對(duì)照、陰性對(duì)照顯示均顯示陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 顯示陽(yáng)性，結(jié)果表明，RNA模板包括病毒南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒， 即該宿主F(唐菖蒲)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染。對(duì)比例6采用DAS-ELISA方法檢測(cè)對(duì)宿主F (唐菖蒲)是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉 病毒和百合無(wú)癥病毒侵染的檢測(cè)采用DAS-ELISA方法、分三次分別對(duì)宿主F(唐菖蒲)進(jìn)行南芥菜花葉病毒、菜豆 黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染檢測(cè)，最終檢測(cè)結(jié)果為宿主F(唐菖蒲)被南芥菜花葉病 毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒侵染，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例5檢測(cè)結(jié)果相同，表明本發(fā)明 的檢測(cè)方法具有特異性，病毒ToRSV、TRSV、LMoV和CMV對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果無(wú)影響，檢測(cè)靈敏度高。
權(quán)利要求
南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟a、從寄主上抽提出待檢測(cè)病毒的總RNA；b、將總RNA稀釋成RNA溶液；c、以RNA溶液作為模板，進(jìn)行RT-Real time PCR反應(yīng)；在RT-Real time PCR反應(yīng)體系中包括擴(kuò)增引物、熒光探針；其中擴(kuò)增引物共三組，分別為引物ArMV、引物BYMV和引物L(fēng)SV，分別具有如下序列上游引物ArMV-F5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，下游引物ArMV-R5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′，上游引物BYMV-F5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′，下游引物BYMV-R5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′，上游引物L(fēng)SV-F5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′，下游引物L(fēng)SV-R5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′，引物ArMV、引物BYMV和引物L(fēng)SV分別根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒的高度保守衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)，并且引物間不互作，其中熒光探針共三種，分別為探針ArMV-P、探針BYMV-P和探針LSV-P；其中探針ArMV-P是5′端5-羧基熒光素修飾、3′端5-羧基四甲基羅丹明修飾的序列5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′，探針BYMV-P是5′端六氯-6-甲基熒光素修飾、3′端5-羧基四甲基羅丹明修飾的序列5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′，探針LSV-P是5′端5-羧基-X-羅丹明修飾、3′端暗粹滅劑修飾的序列5′-ROX-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3′，探針ArMV-P、探針BYMV-P和探針LSV-P分別根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒高度保守的衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)；d、實(shí)時(shí)對(duì)RT-Real time PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光陽(yáng)性檢測(cè)；e、根據(jù)熒光陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，判斷寄主是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染，陽(yáng)性表示寄主已經(jīng)被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染，反之陰性表示寄主沒有被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染 宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟d包括采用空白對(duì)照對(duì)RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定性檢測(cè)的步驟；反應(yīng)結(jié)果為陰性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定正常，反 應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)不穩(wěn)定、可能受到污染，需要重新檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染 宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟d還包括采用陰性對(duì)照對(duì)RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定性檢測(cè)的步驟；反應(yīng)結(jié)果為陰性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)穩(wěn)定正常，反 應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性則說明RT-Real time PCR反應(yīng)不穩(wěn)定、可能受到污染，需要重新檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染 宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述RT-Real time PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為40次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染 宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于b步驟中的RNA溶液濃度大于等于總RNA濃 度的10_2倍。
6.南芥菜花葉病毒的擴(kuò)增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分別具有如下序列上游引物5 ‘ -TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3 ‘， 下游引物5 ‘ -TTGCACAACCACTGGCATCT-3 ‘。
7.菜豆黃花葉病毒的擴(kuò)增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分別具有如下序列上游引物5 ‘ -GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3 ‘， 下游引物5 ‘ -TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3 ‘。
8.百合無(wú)癥病毒的擴(kuò)增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分別具有如下序列 上游引物5 ‘ -GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3 ‘，下游引物5 ‘ -GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3 ‘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒是否侵染宿主的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明根據(jù)南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和百合無(wú)癥病毒的RNA，設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物和熒光探針，并借助擴(kuò)增引物和熒光探針對(duì)待鑒定病毒的RNA模板進(jìn)行RT-Realt time PCR反應(yīng)，通過實(shí)時(shí)對(duì)RT-Real time PCR產(chǎn)物的熒光檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主是否被南芥菜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒或百合無(wú)癥病毒侵染的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101871018SQ20101020886
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者李一農(nóng), 楊偉東, 鄭耘, 陳富華, 陳枝楠 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 被以下專利引用 (1),