專利名稱：一種用作非病毒型基因載體的新型陽離子聚合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型陽離子聚合物及其制備方法和用途，還涉及由該新型陽離子聚合物與核酸所構(gòu)成的納米復(fù)合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
基因治療是指將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定的方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因缺陷或發(fā)揮治療作用，進(jìn)而達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委熞蚓哂兄T多獨特的優(yōu)勢，自問世以來已經(jīng)對人類重大疾病的治療產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。然而，基因治療的核心問題是尚未找到理想的基因載體。迄今研究開發(fā)的基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類，其中，病毒載體，如各種逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒等，雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在著對外源基因的容納量少(約4. 5-30kbp)、穩(wěn)定性差、免疫原性高、毒性大、 靶向特異性差等諸多缺點；而非病毒載體由于容易大規(guī)模制備、成本低、對外源基因無大小限制、具有低免疫原性和相對安全等優(yōu)點已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，并被建議替代病毒載體而成為基因載體研究的主要方向。遺憾的是，迄今為止研究發(fā)現(xiàn)的非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率都不理想或轉(zhuǎn)染效率較高但由于體內(nèi)不降解導(dǎo)致毒性太大。因此，尋找新型的高效、低毒的基因非病毒載體已成為基因治療研究領(lǐng)域最為迫切并具挑戰(zhàn)性的課題之
ο目前，新型陽離子聚合物基因輸送系統(tǒng)已成為基因非病毒載體設(shè)計開發(fā)的主要方向，例如，對多聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯、殼聚糖和聚陽離子環(huán)糊精等進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的各種衍生物，特別是因具有 “質(zhì)子海綿”作用而具有高轉(zhuǎn)染效率的PEI的研究報道最多，但因其不能在體內(nèi)降解，對細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性而導(dǎo)致其體內(nèi)應(yīng)用受到限制。因此，如何在保留PEI高轉(zhuǎn)染效率特性的同時， 又能夠降低其毒性已成為研究熱點之一。迄今為止，有效的策略之一就是在聚合物中引入可水解或酶解的基團(tuán)，合成生物可降解的高分子聚合物從而降低毒性。例如，被廣泛用作生物材料的合成多肽，就因其所含的酰胺鍵而在體內(nèi)降解，還有合成的聚酯也因酯鍵可被水解而廣泛用作藥物控釋的載體。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，新的合成方法是制備新材料的有效途徑之一，聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化對其生物特性產(chǎn)生極大影響。在聚合物的合成工藝中，聚合反應(yīng)又起著極其重要的作用。最近幾年，產(chǎn)生了一種新的聚合物合成方法，即Huisgen環(huán)加成反應(yīng)或 “Click”反應(yīng)。Click反應(yīng)就是將末端帶有炔基和疊氮基團(tuán)的單體通過高選擇性環(huán)合耦聯(lián)后形成帶有三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物，其最早是由Siarpless于2001年提出的。此后，Click 反應(yīng)就被廣泛用于合成各種材料。迄今為止，用Click化學(xué)合成的聚合物用于基因輸送僅有——篇 艮道(S. Srinivasachari，Y. Liu, G. Zhang, et al，Trehalose click polymers inhibitnanoparticle aggregation and promote pDNA delivery in serum. J. Am. Chem. Soc. 128(2006)8176-8184.)，就是將海藻二糖與乙基亞胺分子通過Click反應(yīng)形成聚合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此聚合物比不用Click反應(yīng)直接形成的聚合物轉(zhuǎn)染效率有很大的提高，作者認(rèn)為這可能和聚合物分子中的三唑基團(tuán)能有效結(jié)合DNA并阻止聚合物/DNA納米復(fù)合物的聚集有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述研究背景，本發(fā)明人以多縮乙二醇(例如，一縮二乙二醇(也稱作二乙二醇)或二縮三乙二醇(也稱作三乙二醇))和多乙烯多胺(例如，二乙烯三胺或三乙烯四胺)為原料，通過Click反應(yīng)合成一種具有全新結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物。此聚合物含有的仲胺基團(tuán)帶有正電荷，能有效壓縮核酸，同時能在酸性條件下接受H+,具有類似PEI的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)；而且該聚合物中含有醚氧基結(jié)構(gòu)，這就使該聚合物具有一定的親水性和柔軟性， 具有類似PEG的性質(zhì)，能在一定程度上分散聚合物的正電荷，阻止陽離子聚合物/核酸納米復(fù)合物的聚集，減少聚合物對細(xì)胞的刺激性；并且該聚合物中含有的酰胺鍵可生物降解，因此，與不能降解的PEI相比，該聚合物的毒性大大降低。此外，該聚合物分子中含有的三唑基團(tuán)，能有效結(jié)合核酸，阻止納米復(fù)合物聚集。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效低毒的用作非病毒型基因載體的新型陽離子聚合物及其制備方法和用途。本發(fā)明的另一目的在于提供使用該陽離子聚合物制備的陽離子聚合物/核酸納米復(fù)合物及其制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種用作非病毒型基因載體的陽離子聚合物，所述陽離子聚合物具有式I所示的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種陽離子聚合物，其具有式I所示的結(jié)構(gòu)其中，η為聚合物的重復(fù)單元的個數(shù)；χ為1或2 ;y為1或2 ;R為保護(hù)基，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物，其中，所述陽離子聚合物的重均分子量為 5-50千道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物，其中，所述陽離子聚合物為聚(疊氮基一縮二乙二醇-炔基二乙烯三胺)的Click共聚物、聚(疊氮基一縮二乙二醇-炔基三乙烯四胺) 的Click共聚物、聚(疊氮基二縮三乙二醇-炔基二乙烯三胺)的Click共聚物、聚(疊氮基二縮三乙二醇-炔基三乙烯四胺)的Click共聚物或其混合物。
4.權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物的制備方法，該方法包括以下步驟 步驟1 含有保護(hù)基的炔基化單體的合成
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述炔基化單體的合成具體包括以下步驟
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述疊氮化單體的合成具體包括以下步驟
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚合物的合成具體包括以下步驟
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物/核酸的納米復(fù)合物。
9.權(quán)利要求8所述的納米復(fù)合物的制備方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物和質(zhì)粒DNA分別用去離子水溶解，混合，室溫靜置，陽離子聚合物和質(zhì)粒DNA通過靜電自組裝成納米復(fù)合物。
10.權(quán)利要求8所述的納米復(fù)合物用于將核酸遞送到細(xì)胞中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中，所述核酸為含有編碼遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒DNA序列，所述遺傳標(biāo)記為綠色熒光蛋白基因。
12.權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物用于非病毒型基因載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用作非病毒型基因載體的新型陽離子聚合物及其制備方法和用途。本發(fā)明的陽離子聚合物具有下列式I的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的陽離子聚合物是由末端含有炔基基團(tuán)的單體和末端含有疊氮基團(tuán)的單體通過一價銅離子催化的炔基—疊氮環(huán)加成反應(yīng)聚合并同時脫去保護(hù)基生成帶有1，2，3-三唑基團(tuán)結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物。本發(fā)明的聚合物既保留了與PEI相當(dāng)?shù)母咿D(zhuǎn)染效率，又大大降低了PEI的細(xì)胞毒性，用該聚合物制備的基因非病毒載體具有生物相容性高、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高等特點。式I
文檔編號C12N15/63GK102260376SQ201010183750
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者張志文, 李亞平, 顧王文, 高瑜 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所