專利名稱：抗-干擾素α的抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及中和性抗-IFN-α單克隆抗體的產生和特性鑒定，這些抗體對 各種IFN-α亞型具有廣譜反應性。本發(fā)明還涉及這些抗-IFN-α抗體在診斷與治療與 IFN-α的表達增加相關疾病，特別是自身免疫病如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性 紅斑狼瘡(SLE)中的應用。
相關技術的描述干擾素_ α (IFN- α )雖然干擾素最初發(fā)現(xiàn)的是它們的抗病毒活性，但隨后的研究闡明了與這些強力細 胞因子有關的多種調節(jié)活性。I型干擾素形成了一個細胞因子的古老家族，包括IFN-a， IFN-β，IFN- δ，IFN-ω 以及 IFN- τ (Roberts 等人，J. Interferon Cytokine Res. 18 805-816 [1998])。他們由無內含子的基因編碼并且廣泛分布于脊椎動物中。其中IFN-β在 靈長類和嚙齒類動物中由單一基因編碼，在小鼠和人體中各發(fā)現(xiàn)了 10種和15種以上的不 同的IFN-α亞型。其他I型干擾素更有限，比如，豬的IFN- δ，牛和羊的IFN- τ，牛和人的 IFN-ω。因此，人I型干擾素包括IFN-α家族中的多個成員，以及IFN-β和IFN-ω家族 的單個成員。所有I型IFN看來都只結合一個受體，該受體含有至少兩個跨膜蛋白質。另 一方面，II型干擾素由一個成員IFN-Y代表，并且結合一個獨特的受體。盡管所有的I型IFN，包括IFN-α，都顯示出抗病毒和抗增殖活性而因此有助 于控制病毒感染和腫瘤(Lefevre等人，Biochimie 80 :779_788 [1998] ；Horton等人， Cancer Res. 59 :4064_4068[1999] ;Alexenko 等 A, J.InterferonCytokine Res. 17 769-779[1997] ；Gresser, J. Leukoc. Biol. 61 :567_574[1997])，但也有幾種自身免疫疾 病與IFNa的表達增加有關，最顯著的是胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性紅斑狼瘡 (SLE)。I型糖尿病，也就是自身免疫性糖尿病或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，是一種自 身免疫疾病，該疾病的特征是自身反應性T淋巴細胞所引起的胰腺β細胞的選擇性破壞 (Bach, Endocr. Rev. 15 :516_542[1994] ；Castano 禾口 Eisenbarth, Annu. Rev. Immunol. 8 647-679 [1990] ；Shehadeh 和 Lafferty, DiabetesRev. 1 141-151 [1993])。IDDM 的病理 學非常復雜，涉及遺傳易感性宿主中的后生事件(可能是病毒感染)，胰腺β細胞和免 疫系統(tǒng)之間的相互反應。許多細胞因子，包括IFN-α和IFN-Y，參與了人體與此病動物 模型中的 IDDM 病理過程(Campbell 等人，J.Clin. Invest. 87 :739_742 [1991] ； Huang 等 人，Diabetes44 :658_664[1995] ；Rhodes 和 Taylor, Diabetologia 27 :601_603[1984])。 例如，已有報告說患IDDM病人的β細胞內存在胰Ifn-amRNA表達和免疫反應性 IFN-a (Foulis 等人，Lancet 2 1423-1427 [1987] ；Huang 等人，[1995]同上；Somoza 等人，J. Immunol. 153 :1360-1377 [1994])。IFN-α表達與人胰島內主要組織相容性復合物(MHC) Ia類抗原的高表達有關(Foulis等人[1987]同上；Somoza等人[1994]同上)。在自身免疫 性糖尿病的兩種嚙齒動物模型(易于患糖尿病的DPBB大鼠和鏈唑霉素處理的小鼠)中，胰 島內Ifn-α mRNA的表達先于胰島炎和糖尿病(Huang等人，Immunity 1 :469_478[1994])。 此外攜帶雜合性人胰島素啟動子-Ifn-α構建物的轉基因小鼠發(fā)生了伴有胰島炎的低胰 島素血癥型糖尿病(Stewart 等人，Science 260 1942-1946 [1993])?？磥硪葝u細胞在對潛在的致糖尿病性刺激如病毒的反應中局部表達的IFN-α可激發(fā)胰島炎過程。與IFN-α作為始動因素的作用相一致，已顯示它能誘導人胰島內皮 細胞產生細胞間粘附分子-I(ICAM-I)和HLAIa類分子，這會導致胰島炎時白細胞的滲入 (Chakrabarti等，J. Immunol. 157 :522_528[1996])。此外，通過誘導胰島內抗原呈遞細胞 上的共刺激分子ICAM-I和B7. 2，IFN-α促進了 T細胞的激活(Chakrabarti等人，Diabetes 45 :1336-1343[1996])。這些研究集合在一起表明β細胞早期表達IFN-α在自身免疫性 糖尿病的啟動中可能是關鍵性的。雖然有許多報告提示IFN-γ涉及嚙齒動物模型中IDDM 的發(fā)生，但是該細胞因子的表達與人IDDM之間相關性很差。只是在所選出的具有明顯淋巴 細胞滲入胰島的一組患者的胰島中，可能發(fā)現(xiàn)表達IFN-Y的細胞。而在不按此標準所選的 患者組中沒有發(fā)現(xiàn)IFN-Y表達與人IDDM之間的明顯關系。根據(jù)全身性紅斑狼瘡(SLE)病人IFN-α表達水平的增加，IFN-α也涉及SLE 的病理過程(Ytterberg 和 Schnitzer, Arthritis Rheum. 25 401-406[1982] ；Shi 等人， Br. J. Dermatol. 117 155-159 [1987]) 令人感興趣的是目前IFN-α正用于治療癌癥與 病毒感染，如乙肝或丙肝病毒感染引起的慢性肝炎。與IFN-α水平增高激發(fā)自身免疫性 的觀察相一致，已報道接受IFN-α治療的病人中自身免疫失調(如IDDM，SLE以及自身 免疫性甲狀腺炎)的出現(xiàn)明顯增加。例如，研究表明長期使用IFN-α作為抗病毒療法 會引起 IDDM(ffaguri 等人，Diabetes Res. Clin. Pract. 23 :33_36[1994] ；Fabris 等人， J. Hepatol. 28 :514_517[1998])或 SLE(Garcia-Porrua 等人，Clin. Exp. Rheumatol. 16 107-108 [1998])。用IFN-α療法治療柯薩奇病毒B (CBV)感染，也與IDDM的引起相 關(Chehadeh 等人，J. Infect. Dis. 181 1929-1939 [2000])。類似地，在用 IFN-α 治 療的癌癥患者中有多個病例報告發(fā)現(xiàn)IDDM或SLE(Ronnblom等人，J. Intern. Med. 227 207-210[1990])ο抗體療法隨著一些單克隆抗體(mAb)被批準于人體或者作后期臨床試驗考核，使用單克隆 抗體作為治療劑已獲得了越來越多的接受。1986年美國食品和藥品署(FDA)第一個批準的 mAb是用于治療同種異體移植物排斥的抗_CD3(0KT3)。此后，mAb領域的前進步伐大為加 速，尤其是1994年起，導致另外7個mAb被批準用于人體治療。這些包括1994年用于治療冠 狀血管成形術并發(fā)癥的keoPro ，1997年用于預防同種異體移植物排斥反應的Zenapax (抗-⑶25)，1997年用于治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的Rituxan (抗-⑶20)，1998年 最初用于治療克羅恩氏病并且隨后在1999年用于治療類風濕性關節(jié)炎的Infliximab (抗-TNF-α )，1998年用于預防同種異體移植物排斥反應的Simulect (抗-⑶25)，1998 年用于治療呼吸道感染的Synagis (抗呼吸道合胞病毒的F蛋白)，以及1998年用于治療HER2過度表達性轉移性乳腺癌的Herceptin (抗-HER2/neu) (Glennie和Johnson， Immunol. Today 21 :403_410 [2000])?？?IFN-α抗體 經單克隆抗體治療干預能得以緩解的疾病狀態(tài)包括所有那些具有病理性靶抗 原水平的疾病。例如，能中和SLE患者血清中存在的和在IDDM中胰島表達的IFN-α的 抗體，是治療性干預這些疾病的潛在候選物。這也可用于IFN-a表達潛在性增加和起 病因作用的其它自身免疫性疾病的治療性干涉。在人IDDM(Foulis等人，Lancet 2 1423-1427 [1987] ；Huang 等人，Diabetes44 658-664 [1995] ；Somoza 等人，J. Immunol. 153 1360-1377[1994])和人 SLE(Hooks 等人，Arthritis & Rheumatism 25 396-400[1982]； Kim 等人，Clin. Exp. Immunol. 70 :562_569 [1987] ；Lacki 等人，J. Med. 28 :99_107 [1997]； Robak等人,Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 46 :375_380[1998]； Shiozawa φ A, Arthritis & Rheumatism 35 417-422[1992] ；vonffussow φ 人， Rheumatology International 8 :225_230 [1988]) 二者中，看起來疾病都與 IFN-α 有關， 但與IFN-β或IFN-γ無關。因而，抗干擾素mAb在IDDM或SLE中的干預要求對大多數(shù) (如果不是所有的)IFN-α亞型產生特異性中和而不引起IFN-β或IFN-γ的任何明顯性 中和。保留后兩種干擾素的活性完整也可能有利于保留明顯的抗病毒活性。雖然已有描述說一些mAb對一定范圍的重組人IFN-α亞型顯示了反應活性，但 發(fā)現(xiàn)只能中和所分析的重組IFN-α亞型的有限亞組或者對激活的外周血白細胞產生的 IFN-α 亞型混合物無中和能力(Tsukui 等人，Microbiol. Immunol. 30 1129-1139[1986]； Berg, J.Interferon Res. 4 481-491[1984] ；Meager 禾口 Berg, J.Interferon Res. 6 729-736[1986] ；US PatentNo. 4，902，618 ；和 EP publication No. 0，139，676 Bi)。因此對不僅能結合大多數(shù)，優(yōu)選所有的IFN-α亞型而且能中和這些亞型同時不 干擾其它干擾素生物功能的抗-IFN-α抗體有很大需要。發(fā)明簡述本發(fā)明以一種單克隆抗體的開發(fā)為基礎，該單克隆抗體在實驗中發(fā)現(xiàn)能中和所有 7種受測試的不同的重組人IFN-α亞型和兩種天然人IFN-α亞型的獨立的合并物。一方面，本發(fā)明提供了一種抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體能結合至少人IFN-α 亞型IFN-α 1，IFN-α 2，IFN-α 4，IFN-α 5，IFN-α 8，IFN-α 10 以及 IFN-α 21 并中和其生 物活性。另一方面，本發(fā)明提供了一種能結合所有人IFN-α亞型并中和其生物活性的抗人 IFNa單克隆抗體。本發(fā)明的抗體能顯著降低或者消除所討論人IFN-a的生物活性。在 一個實例中，本發(fā)明的抗體能中和目標人IFN- α的生物活性的至少60 %或至少70 %，較佳 至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少 99%。在另一實例中，這種中和人IFN-a生物活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的相應 生物活性。目標人IFN-α的生物活性可以是IFNAR2結合活性。在一具體實施例中，本發(fā)明提 供的抗人IFN-α單克隆抗體能夠結合所有的或基本上所有的人IFN-α亞型并阻斷IFNAR2 結合活性的至少60 %或至少70 %，較佳至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至 少90%，還要更佳至少95%，最佳至少99%。在另一實施例中本發(fā)明提供一種抗人IFN-a 單克隆抗體，它能結合每種人IFN- α亞型1、2、4、5、8、10和21并阻斷IFNAR2結合活性的至少60 %或至少70 %，較佳至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要 更佳至少95%，最佳至少99%。在另一實施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體不與人IFN-β 交叉反應。目標人IFN-α的生物活性可以是抗病毒活性。在一個實施例中，抗人IFN-α單 克隆抗體能與所有的或基本上所有的人IFN-α亞型結合并中和其抗病毒活性。在另一實 施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體能結合每種人IFN-α亞型1、2、4、5、8、10和21并中和 其抗病毒活性。在一具體實施例中，本發(fā)明提供的抗人IFN-a單克隆抗體能夠結合所有 的或基本上所有的人IFN-α亞型并中和其抗病毒活性的至少60%或至少70%，較佳至少 75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少99 %。 在還有另一實施例中，本發(fā)明提供的抗人IFN-a單克隆抗體能結合每種人IFN-α亞型1、 2、4、5、8、10和21并中和其抗病毒活性的至少60%或至少70%，較佳至少75%，更佳至少 80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少99 %。在還有另一實 施例中，這種中和人IFN-α的抗病毒活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的抗病毒活性。 此抗體可以是小鼠的、人源化的或人的抗體。此抗體可以是小鼠抗人IFN-a單克 隆抗體9F3或它的人源化版本如版本13(V13)或其嵌合形式。本發(fā)明的范圍還包括能與小 鼠抗人IFN-α單抗9F3或其人源化或嵌合形式結合基本上相同的IFN-α表位的抗體。例 如，用于這一目的的參考抗體是2001年1月18日存放在ATCC的登錄號No. PTA-2917的小 鼠雜交瘤細胞系9F3. 18. 5產生的抗-IFN-α抗體。在另一實施例中，本發(fā)明提供了小鼠 或鼠/人嵌合性抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體含有如圖5A (SEQ ID N0:1)所示的小鼠 輕鏈可變結構域氨基酸序列和/或圖5B(SEQ ID NO :2)所示的小鼠重鏈可變結構域氨基 酸序列。在另一實施例中，本發(fā)明提供了人源化抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體含有如圖 5A(SEQ ID NO 3)所示的人源化輕鏈可變結構域氨基酸序列和/或圖5B (SEQ ID NO 5)所 示的人源化重鏈可變結構域氨基酸序列。還提供了一種抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體能與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體 9F3或其人源化或嵌合形式結合基本上相同的人IFN-a亞型1，2，4，5，8，10和21上的表 位。本文還提供了抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體能與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3 競爭與每種人IFN-α亞型1，2，4，5，8，10和21相結合。也提供了編碼本文所述任一抗體的分離的核酸分子，含有該分離的核酸分子的載 體，被該核酸分子轉化的宿主細胞和產生此抗體的方法，該方法包括在該核酸分子表達的 條件下培養(yǎng)此宿主細胞以產生此抗體并任選地從此宿主細胞回收此抗體。此抗體可以是 IgG類和亞型如IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。本發(fā)明的范圍也包括抗體片段如Fv，scFv，F(xiàn)ab， F(ab，)2和 Fab，片段。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈或其片段，它們包含以下 CDR(如 Kabat 等人所定義，Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第五版， NIH Publication 91-3242，Bethesda MD[1991]，第 1-3 卷)(a)式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 Ll ； (b)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；以及(C)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的L3。本發(fā)明的范圍也包括抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈片段的輕鏈可變結構域。本發(fā) 明的范圍還包括抗人IFN- α單克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性輕鏈可變結 構域氨基酸序列或整個嵌合性輕鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為N0.PTA-2880的XAIFN-CHLpDRl載體所編碼。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單 克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有人源化輕鏈可變結構域氨基酸序列或整個人源化輕鏈多肽 氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2882的VLV30_IgG載體 所編碼。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-a單克隆抗體重鏈或其片段，它們含有下述 CDR (a)式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ； (b)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO: 11) 的H2;以及(c)式WISDFFDY(SEQID NO 12)的H3。本發(fā)明的范圍也包括抗人IFN-a單 克隆抗體重鏈片段的重鏈可變結構域。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單克隆抗體重鏈 多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個嵌合性重鏈多肽氨基酸序 列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2883的XAIFN_ChHpDR2載體所編 碼。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單克隆抗體重鏈多肽，該多肽含有人源化重鏈可變區(qū) 氨基酸序列或整個人源化重鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號 為 NO. PTA-2881 的 VHV30-IgG2 載體所編碼。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體包含(A)至少一條輕 鏈或其片段，它們含有如下CDR: (a)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQID NO 7)的LI ； (b)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；以及(C)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ； (B)至少 一條重鏈或其片段，它們含有如下CDR: (a)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的HI ； (b)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2;以及(c)式 WISDFFDY (SEQID NO 12)的 H3。此 抗體可以是由兩對由二硫鍵鍵合的抗體重鏈-輕鏈構成的同型四聚體結構。本發(fā)明的范圍 具體包括線形抗體，小鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。還提供了一種嵌合性抗 體，該抗體包含(1)小鼠/人嵌合性輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個嵌合性輕鏈多肽氨基酸 序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2880的XAIFN-ChLpDRl載體所 編碼；和(2)小鼠/人嵌合性重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個嵌合性重鏈多肽氨基酸序列， 其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2883的XAIFN_ChLpDR2載體所編碼。 本文還提供了一種人源化抗體，該抗體包含(1)人源化的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個 人源化輕鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2882的 VLV30-IgG載體所編碼；和(2)人源化的重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個人源化重鏈多肽氨 基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO. PTA-2881的VHV30_IgG2載體所 編碼。還有一方面，本發(fā)明提供了含有有效量的本發(fā)明抗體與藥學上可接受運載體相混 合的藥物組合物。還有一方面，本發(fā)明提供了診斷與細胞中IFN-a表達相關狀態(tài)的方法，該方法包 括使抗-IFN-a抗體接觸細胞并檢測IFN-a的存在。還有一方面，本發(fā)明提供了治療患者與IFN-a表達相關的疾病或狀態(tài)的方法，該 方法包括給予患者有效量的抗-IFN-a抗體。該患者是哺乳動物患者，優(yōu)選人類患者。該 疾病是自身免疫性疾病，如胰島素依賴性糖尿糖(IDDM)；全身性紅斑狼瘡(SLE)；或自身免 疫性甲狀腺炎。本發(fā)明還涉及54. 一種抗IFN-a單克隆抗體，該抗體與至少IFN-a亞型IFN_a 1，IFN-a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10 和 IFN_ a 21 結合并中和 其生物活性。55.如項1所述的抗體，該抗體為鼠抗體。56.如項1所述的抗體，該抗體為人源化抗體。57.如項1所述的抗體，該抗體為人抗體。58.如項1所述的抗體，其中所述生物活性為抗病毒活性。59.如項5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少70%的抗病 毒活性。60.如項5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少80%的抗病
毒活性。61.如項5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少90%的抗病
毒活性。62.如項5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少99%的抗病
毒活性。63.如項1所述的抗體，該抗體能與鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化或 嵌合形式結合基本上相同的IFN-a表位。64.如項1所述的抗體，該抗體是鼠抗人IFN- a單克隆抗體9F3或其人源化或嵌 合形式。65.如項11所述的抗體，該抗體是人源化的抗人IFN- a單克隆抗體9F3的版本 13(V13)。66.如項1所述的抗體，該抗體能與2001年1月18日保藏于ATCC的、保藏號為 PTA-2917的雜交瘤細胞系所產生的抗IFN-a抗體結合基本上相同的IFN-a表位。67.如項1所述的抗體，該抗體為IgG類。68.如項14.所述抗體，該抗體有IgGi，IgG2，IgG3，或IgG4同種型。69.如項1所述的抗體，該抗體為抗體片段。70.如項16所述的抗體，該抗體為Fab片段。71.如項16所述的抗體，該抗體為F(ab，)2片段。72.如項16所述的抗體，該抗體為Fab，片段。73. 一種抗IFN- a抗體輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3。74.如項20所述的抗IFN- a抗體輕鏈片段，該輕鏈片段為輕鏈可變結構域。75. 一種抗IFN- a抗體重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ；(b)化學式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；(c)化學式 WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。76.如項22所述的抗IFN- a抗體重鏈片段，該重鏈片段為重鏈可變結構域。77. 一種抗IFN-a抗體，該抗體含有(A)至少一條輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列⑶R
(a)化學式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；和
(c)化學式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ；和(B)至少一條重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ；(b)化學式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；和(c)化學式 WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。78.如要求24所述的抗體，該抗體具有同質四聚體結構，該結構含有兩個由二硫 鍵聯(lián)接的抗體重鏈-輕鏈對。79.如項24所述的抗體，該抗體為線形抗體。80.如項24所述的抗體，該抗體為鼠抗體。81.如項24所述的抗體，該抗體為嵌合抗體。82.如項24所述的抗體，該抗體為人源化抗體。83.如項24所述的抗體，該抗體為人抗體。84. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項1所述的抗體。85. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項11所述的抗體。86. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項12所述的抗體。87. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項24所述的抗體。88. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項20所述的抗體輕鏈或其輕鏈片段。89. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項22所述的抗體重鏈或其重鏈片段。90. 一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子含有于2001年1月9日在ATCC保存 的登錄號PTA-2882的載體中編碼輕鏈多肽的核酸序列。91. 一種分離的核酸分子，該分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登錄號 PTA-2881的載體中編碼重鏈多肽的核酸序列。92. 一種載體，該載體含有項31至38任何一項所述的核酸分子。93. 一種宿主細胞，該細胞是用項31至38任何一項所述的核酸分子轉化的宿主細 胞。94.產生如項1，11，12和24任何一項所述的抗體的方法，該方法包括，在使編碼該 抗體的核酸序列表達從而產生抗體的條件下，培養(yǎng)含有該核酸序列的宿主細胞。95. 一種雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系含有項31至38任何一項所述的核酸分子。96. 一種雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系由ATCC于2001年1月18日保存，登錄號 為 PTA-2917。97. 一種項42所述的雜交瘤細胞系產生的抗體。98. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的載體混合的有效量的 項1所述的抗體。99. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量 的項11所述的抗體。100. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的項12所述的抗體。101. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量 的項24所述的抗體。102. 一種診斷與細胞內IFN-a表達有關的疾病的方法，該方法包括使所述細胞 與項1所述的抗IFN-a抗體接觸，并檢測IFN-a的存在。103. 一種治療與患者體內IFN-a表達有關的疾病的方法，該方法包括給予所述 患者有效量的如項1所述的抗IFN-a抗體。104.如項50所述方法，其中所述患者為哺乳動物患者。105.如項51所述方法，其中所述患者為人。106.如項52所述方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。54.如項53所述方法，其中所述疾病選自于胰島素依賴性糖尿病(IDDM)；和全身 性紅斑狼瘡(SLE)；和自身免疫性甲狀腺炎。圖表簡述

圖1表示用于產生抗人IFN-a單克隆抗體的策略的簡圖。圖2表示小鼠抗人IFN- a mAb (9F3)能中和重組IFN_ a亞型譜系但不能中和重組 IFN-日。測試了在mAb 9F3濃度增加時所示IFN對腦心肌炎(EMC)病毒在A549細胞內生 長的抑制。所述數(shù)據(jù)為在mAb 9F3缺乏時用所示IFN獲得的病毒生長抑制活性的百分比。圖3A-3B顯示了白細胞干擾素(Sigma)(圖3A)和類淋巴母細胞干擾素(NIH參考 品Ga23-901-532)(圖3B)的中和作用。在圖3A中，將20000IU/ml (實心柱)或5000IU/ ml (空白柱)的白細胞干擾素(Sigma Product No. 1-2396)與空白對照物(只有緩沖液) (以“_”表示)，10 :g/ml 小鼠 IgG 對照物(以“mlgG”表示)，或 10 :g/ml mAb 9F3 (以“9F3” 表示)一起培育。測試諸稀釋液并顯示殘余活性的量。所示結果為一式二份測定的平均值。 在圖3B中，測定了在所示濃度的mAb 9F3存在或不存在下，類淋巴母細胞干擾素在10 (實 心柱)或3(空白柱)IU/ml時的作用。較高的細胞病變效應表明干擾素活性下降。所示結 果為一式二份測定的平均值。圖4描述了電泳遷移率變化試驗(EMSA)的結果，表明IFN- a誘生了 ISGF3/ISRE 復合物以及9F3 mAb能阻止該復合物的形成。在存在或缺乏25ng/ml濃度的人IFN- a 2 (以 “a 2”表示)或IFN-3 (以“3 ”表示)時用10 :g/ml濃度的9F3mAb(以“9F3”表示)或 小鼠IgG對照抗體(以“IgG”表示)進行了 EMSA。圖5A 顯示了小鼠 9F3(小鼠 SEQ ID NO 1)、人源化 9F3 版本 13 (V13，SEQ ID NO: 3)和共有的人可變區(qū)輕鏈k I亞族(huK I，SEQ ID NO ；4)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的 排列對比。CDR(L1，SEQ ID NO 7 ；L2,SEQ ID NO :8 ；以及 L3，SEQ ID NO 9)以下劃線突出 顯示。殘基編號按照Kabat等人，(1991)同上。用星號標明小鼠9F3和V13序列之間的差 異，以及9F3和HuKI序列之間的差異。圖5B 顯示了小鼠 9F3(小鼠 SEQ ID NO :2)、人源化 9F3 版本 13 (V13，SEQ ID NO: 5)和共有的人可變區(qū)重鏈III亞族(huIII，SEQ ID NO ；6)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的 排列對比。CDR(H1，SEQ ID NO 10 ；H2,SEQ IDN0 :11 ；以及 H3，SEQ ID NO 12)以下劃線突 出顯示。殘基編號按照Kabat等人，(1991)同上。用星號標明小鼠9F3和V13序列之間的 差異，以及9F3和huIII序列之間的差異。
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圖6顯示初始mAb 9F3 (左圖)和嵌合蛋白質CH8-2 (右圖)對受腦心肌炎(EMC) 病毒攻擊的A549細胞中重組IFN- a亞型抑制病毒生長的中和活性。圖7描述了人源化9F3版本13的模型。VL和VH結構域的骨架顯示為緞帶。⑶R 以白色表示并作標記(Ll，L2，L3，HI, H2，H3)?？蚣軅孺湉娜说叫∈蟮霓D換以白色表示并 標記了殘基編號。優(yōu)詵實施例的詳細描述A.定義除非另有說明，本文所用的技術與科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人 員共同理解的相同含義。見，例如Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 第二版，J. Wiley & Sons 出版(NewYork，NY 1994) ；Sambrook 等人， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)。為了本發(fā)明的目的，下述術語定義如下。如本文所用，術語“I型干擾素”定義為包括任何哺乳動物的自然序列的I型干擾 素的所有亞型，包括干擾素_ a，干擾素_ 0，干擾素_ S，干擾素_ (0和干擾素_ t。類似的， 術語“人I型干擾素”定義為包括自然序列的I型人干擾素的所有亞型，包括人干擾素-a， 干擾素和干擾素種類并且它們能結合一共同的細胞受體。除非另外提供解釋，本文所用術語“干擾素-a "IFN-a ”，“人干擾素-a ”， “人IFN-a”以及“hlFN-a”是指自然序列的人a干擾素的所有種類，包括自然序列的 人干擾素-a的所有亞型。自然的(自然序列)人干擾素-a包含23種或更多密切相 關的蛋白質，這些蛋白質由具有高度結構同源性的不同基因所編碼(Weissmarm和Weber， Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol, 33 251 [1986] ;J.Interferon Res.，13 :443_444[1993]； Roberts 等人 J. Interferon CytokineRes. 18 :805_816 [1998]).人 IFN-a 基因座包含兩個 亞家族。第一亞家族包括至少14個有功能的非等位基因，包括編碼IFN-a A，(IFN- a 2)， IFN- a B (IFN- a 8)，IFN- a C (IFN- a 10) , IFN- a D (IFN- a 1) , IFN- a E (IFN_a22)， IFN-a F (IFN-a 21)，IFN-a G (IFN-a 5)禾口 IFN—a H (IFN—a 14)的基因，以及至少具有 80%同源性的擬基因。第二亞家族，a工工或！"，至少包含5個擬基因和1個功能性基因(本 文以“IFN-a n 1”或“IFN-T”表示)，該功能性基因表現(xiàn)出與IFN-a基因70%的同源性 (Weissmann 和 Weber [1986]同上)。本文所用術語“第一種人干擾素-a (hIFN-a)受體”，“ IFN_ a R”，“hlFNARl”、 “IFNARI”和“Uze鏈”是指由Uze等人，位U，60 =225-234(1990)所克隆的557個氨基酸的 受體蛋白質，包括409個殘基的胞外結構域，21個殘基的跨膜結構域，以及100個殘基的胞 內結構域，如Uze等人的229頁圖5所示。上述術語還包括含有IFNAR1胞外結構域(EOT) (或ECD的片段)的IFNAR1片段。本文所用術語“第二種人干擾素-a (hIFN-a)受體，，，“IFN_a旦R”，“hIFNAR2”， "IFNAR2”和“Novick 鏈”是指由 Domanski 等人，J. Biol. Chen, 37 21606-21611 (1995)所克 隆的515個氨基酸的受體蛋白質，包含217個殘基的胞外結構域，21個殘基的跨膜結構域， 和250個殘基的胞內結構域，如Domanski等人在21608頁圖1所示。上述術語還包括含有 IFNAR2胞外結構域(EOT)(或EOT的片段)的IFNAR2片段，以及IFNAR2的可溶形式，如與 免疫球蛋白序列融合的IFNAR2 E⑶，例如下述的IFNAR2 E⑶-IgG Fc。
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與I型干擾素，IFN-a或任何其它多肽相連的術語“自然序列”，是指與相應的自然 衍生的多肽具有相同氨基酸序列的多肽，不論它的制備方式如何。這樣的自然序列多肽可 從自然中分離得到或通過重組和/或合成方法或其任意組合產生。術語“自然序列”具體 包含該全長多肽的自然產生的截短或分泌形式(如，胞外結構域序列)，自然產生的變體形 式(如可變剪接形式)和自然產生的等位變體。“聚合酶鏈反應”或“PCR”指一種過程或技術，在其中微量的核酸RNA和/或DNA的 特定片段，如1987年7月28日公開的美國專利號NO. 4，683，195中所述那樣被擴增。通常 地，需要獲得感興趣的區(qū)域兩端或之外的序列信息，這樣可設計出寡核苷酸引物；這些引物 的序列與待擴增模板的相反鏈相同或相似。兩種引物的5 ‘末端核苷酸可與所擴增材料的 兩末端重合。PCR可用于擴增特定的RNA序列，整個基因組DNA的特定DNA序列，全細胞RNA 轉錄的cDNA，噬菌體或質粒序列，等等。見Mullis等人，Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol. 51 :263 (1987) ；Erlich，編，PCR Technology (StocktonPress, NY, 1989).本文所用的 PCR是一種(但不是僅有的)核酸聚合酶反應方法的例子，用于擴增測試的核酸樣品，其包 括用已知核酸作為引物和核酸聚合酶來擴增或產生核酸的特定片段?！翱贵w” (Ab)和“免疫球蛋白(Ig)”是具有相同結構特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對 特定抗原的結合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。例 如，后一種多肽由淋巴系統(tǒng)低水平產生，在骨髓瘤中則水平升高?！白匀豢贵w和免疫球蛋白”通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，包含兩 條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈相 連，而且不同的免疫球蛋白同種型重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也具有有 規(guī)律相間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈一端為可變區(qū)(VH)，隨后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈 一端為可變區(qū)(VL)，另一端為一恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)相對，輕鏈的 可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。認為特殊的氨基酸殘基形成了輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界 面(Chothia 等人，J. Mol. Biol. 186 651 [1985] ；Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 4592[1985] ；Chothia 等人，Nature342 :877_883 [1989])。術語“可變”指如下情況抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上極其不同，用于各個 特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻分布于抗體的整個可變區(qū) 中。它集中存在于輕鏈和重鏈可變區(qū)內稱謂互補決定域(CDR)或高變區(qū)的3個區(qū)段中?？?變區(qū)中具有較高保守性的部分稱為框架區(qū)(FR)。每條天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)都含有4個 FR區(qū)，大部分采取0折疊構型，通過3個⑶R相連；3個⑶R形成環(huán)狀連接，有時形成3折 疊結構的一部分。每條鏈的⑶R通過FR區(qū)緊密靠近，并與另一鏈的⑶R—起構成抗體的抗 原結合位點(見Kabat等人，[1991]同上)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但表現(xiàn) 出各種效應器功能，如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性?？贵w的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段(稱為“Fab”片段，各具有 一個抗原結合位點)和一殘余的“Fc”片段(其名稱反映其易于結晶的能力)。胃蛋白酶處 理產生F(ab’)2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能交聯(lián)抗原?！癋v”是含有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv中，該區(qū)域由 非共價鍵緊密聯(lián)接的輕鏈和重鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv中，重鏈和輕鏈可變區(qū)可 通過一柔性肽接頭共價連接，因而輕鏈和重鏈能以類似于雙鏈Fv中的“二聚體”結構相連。正是在這種構型中每個可變區(qū)的3個CDR互相作用確定了 VH-VL 二聚體表面的抗原結合位 點。6個CDR共同賦予了抗體的抗原結合特異性。然而，盡管親和力低于完整的結合位點， 一個可變區(qū)(或只含有對抗原特異的3個CDR的半個Fv)仍然能識別并結合抗原。Fab片段也含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHI)。Fab ‘片段不同于Fab 段之處在于其在重鏈CH1結構域羧基未端添加了幾個殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個 半胱氨酸。Fab，-SH指恒定區(qū)的半胱氨酸具有自由巰基的Fab，。F (ab，)2抗體片段最初產 生為成對的Fab’片段，此成對Fab’段之間有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其他化學偶聯(lián)也 是已知的。任何脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列分入兩 個明顯不同的型之一，稱為K和入。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類。有五大類免疫球蛋白 IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，這些類中的幾種可進一步分成亞類(同種型)，如IgGpIgGpIgG^ IgG4、IgAi和IgA2。對應不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為a、S、￡、Y和y。免 疫球蛋白不同類的亞基結構和三維構型是眾所周知的。術語“抗體”包括完整的免疫球蛋白的所有類和亞類。術語“抗體”也包括抗體片 段。術語“抗體”明確包括單克隆抗體，包括抗體片段克隆。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，其含有完整抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)。抗 體片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab', F(ab')和Fv片段；雙抗體(diabodies)；單鏈抗體分子，包 括單鏈Fv(SCFv)分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本文所用術語“單克隆抗體”指從基本上同質的抗體群獲得的抗體(或抗體片 段)，即，構成該群體的抗體個體除了可能的自然產生的極少量突變外其他都相同。單克 隆抗體具有高度特異性，只針對一個抗原位點。另外，與通常包括針對不同決定簇(表 位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品相反，每種單克隆抗體只針對于抗原上的一 個決定簇。除了它們的特異性，單克隆抗體的優(yōu)點是可通過雜交瘤培養(yǎng)來合成，而且不 會污染有其它免疫球蛋白。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特征是從基本上的同質的抗 體群獲得的，而不應解釋為需要通過任何特別方法來生成。例如，可通過Kohler等人， Nature, 256 =495(1975)最先描述的雜交瘤方法制備或用重組DNA方法(見，如美國專利號 NO. 4，816，567)制備用于本發(fā)明的單克隆抗體?！皢慰寺】贵w”還包括含有抗原識別和結合 位點的抗體片段的克隆(Fv克隆)，例如采用Clackson等人，Nature, 352 =624-628(1991) 和Marks等人J. Mol. Biol，222 :581_597 (1991)中所述技術從噬菌體抗體文庫中分離獲得。本文單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這些抗體的片段， 此抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與一種特定動物所衍生的或屬于某特定類或亞類抗 體的抗體中相應序列相同或相似，而該鏈的其余部分與另一種動物所衍生的或屬于另一 類或亞類抗體的抗體中相應序列相同或相似，只要他們表現(xiàn)出所需的生物活性(授于 Cabilly 等人的美國專利號 N0. 4，816，567 ；Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 6851-6855[1984])。非人(如小鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合性的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或 其片段(如FV，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或抗體的其它抗原結合子序列)，其中含有從非人免疫 球蛋白衍生的最小序列。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(受者抗體)；其中部分或全部的受者互補決定區(qū)(CDR)的殘基，被來自非人動物(供者抗體)(如大鼠、小鼠或家兔) 的具有所需特異性、親和性和活性的殘基所取代。有些情況中，人免疫球蛋白的Fv構架區(qū) (FR)殘基被相應的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可含有在受者抗體中或輸入的CDR 或框架序列中都沒有的殘基?？蛇M行這些修飾以進一步精細化和優(yōu)化抗體的性能?？傊?， 人源化抗體含有至少1個，典型地2個基本上整個這樣的可變區(qū)，其中CDR區(qū)全部或基本 全部對應于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而FR區(qū)全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的FR 區(qū)。較佳地，人源化抗體還至少含有免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分(Fc)，通常為人免疫球蛋 白的。更多細節(jié)見 Jones 等人，Nature，321 :522_525 (1986) ；Reichmann 等人 Nature，332 323-329(1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992) ；and Clark, Immunol. Today 21 =397-402 (2000).人源化抗體包括Primatized ，其中該抗體的抗原結合區(qū)域衍 生自用感興趣抗原免疫的獼猴產生的抗體衍生?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)域以單一多肽 鏈存在。通常，scFv多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，這使scFv形成抗原結合的所 需結構° 對于 scFv 的綜述可見 Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg 禾口 Moore 編.Springer-Verlag, New York,269-315 頁(1994), Dair Acqua 禾口 Carter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8 :443_450 (1998)和 Hudson, Curr. Op in, Immunol. 11 :548_557(1999)。術語“雙抗體”指具有2個抗原結合位點的小抗體片段，該片段含有在同一多肽 鏈(VH-VL)中的相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。采用的接頭短至不允許同 一鏈上的兩個區(qū)域之間形成配對，而迫使此二結構域與另一條鏈的互補結構域配對從而產 生兩個抗原結合位點。關于雙抗體的有更多描述，例如，見EP 404, 097 ；W0 93/11161 ；和 Hoi linger 等人，Proc. Natl. AcadSci, USA, 90 =6444-6448 (1993)?！胺蛛x的”抗體是已經鑒定且與其天然環(huán)境成分相分離的和/或回收的抗體。其天 然環(huán)境的污染成分是可能會干擾該抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶，激素以及其 它蛋白質或非蛋白質溶質。在優(yōu)選實施例中，可提純該抗體至(1)純度用Lowry方法測定 抗體重量在95%以上，最好在重量99%以上，(2)提純至足夠獲得N-未端或內部氨基酸序 列的至少15個殘基的水平(使用轉杯式測序儀)，或(3)用考馬斯藍，或優(yōu)選銀染色在還原 或非還原條件下，用SDS-PAGE測定為均一性。由于沒有抗體天然環(huán)境的至少一種成分，分 離的抗體包括重組細胞中原位產生的抗體。然而一般情況下，分離的抗體將經過至少一步 純化步驟制備?！爸泻托钥贵w”指一種抗體分子，該抗體分子能消除或顯著降低其所結合的靶抗原 的效應器功能。因此，“中和性”抗IFN-a抗體能消除或顯著降低效應器的功能，如IFN-a 的受體結合功能和/或對細胞反應的誘導。對于本發(fā)明的目的，可監(jiān)測抗-IFN-a抗體中和IFN_a的受體活化活性的能力， 例如，在1995年6月1日公開的W095/14930中所述的激酶受體活化(KIRA)試驗中，測定 候選抗體降低IFNAR1/R2受體復合物的酪氨酸磷酸化(由于配體結合而致)的能力。對于本發(fā)明的目的，優(yōu)選通過監(jiān)測對IFN-a抗病毒活性的中和作用，測試 抗-IFN- a抗體中和IFN- a的細胞應答誘導能力，如Kawade，J. InterferonRes. 1 61-70 (1980)，或 Kawade 和 Watanabe，J. Interferon Res. 4 :571_584 (1984)，或 Yousef i 等人，Am，J，Clin, Pathol. 83 735-740 (1985)所述，或通過在電泳遷移率變化試驗中，測試抗 IFN-a抗體中和IFN-a激活信號分子，干擾素-刺激因子3 (ISGF3)，結合于干擾素刺激 反應元件(ISRE)衍生的寡酸苷酸的能力的能力，如Kurabayashi等人Mol.Cell Biol. 15 6386(1995)所述?！帮@著”降低指降低靶抗原(如IFN- a )的效應器功能(如受體(IFNAR2)結合和/ 或誘導細胞應答)至少約60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，更佳至少約80 %，再佳至 少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約99 %。優(yōu)選本文所定義的 “中和性”抗體能中和IFN-a抗病毒活性的至少約60%，或至少約70%，較佳至少約75%， 更佳至少約80 %，再佳至少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約 99%，如Kawade (1980)，同上或Yousefi (1985)，同上的抗病毒試驗所測定的那樣。在另一 優(yōu)選實施例中，本文所用“中和性”抗體由于與IFN-a結合，能降低IFNAR1/IFNAR2受體復 合物的酪氨酸磷酸化至少約60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，更佳至少約80 %，再佳 至少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約99 %，如上述參考文獻 KIRA試驗所測定的那樣。在一個特別優(yōu)選實施例中，本文所用的中和性抗IFN-a抗體能中 和全部，或基本全部的IFN-a亞型而不能中和IFN-日。在本文中，術語“基本上全部”指中 和性抗 IFN- a 抗體能至少中和 IFN- a 1，IFN- a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10， 以及 IFN-a 21。對于本發(fā)明的目的，抗IFN-a抗體阻斷IFN_a與受體結合的能力，定義為在競爭 結合試驗中某濃度的抗體降低或消除IFN-a與IFNAR2結合的特性或能力，與此試驗中同 等濃度的無關對照抗體對IFN-a結合IFNAR2的效果相比較。優(yōu)選，與無關對照抗體相比， 阻斷性抗IFN- a抗體降低IFN- a與IFNAR2的結合至少約50%，或至少約55%，或至少約 60 %，或至少約65 %，或至少約70 %，或至少約75 %，或至少約80 %，或至少約85 %，或至少 約90 %，或至少約95 %，或至少約99 %。對于本發(fā)明的目的，可用常規(guī)競爭試驗測定抗IFN-a抗體阻斷IFN_a結合 IFNAR2 白勺能力，如 Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow和David Lane (1988)所述。例如，可改進下述例2所述IFN-a結合ELISA試 驗以采用在抗IFN-a抗體和可溶性IFNAR2之間的競爭結合。這一試驗按以下步驟進行 在微量滴定板上包被IFN- a，將該包被板與混合了所選濃度的標記的IFNAR2 EOT-人IgG Fc融合蛋白質的未標記抗IFN-a抗體或未標記對照抗體的連續(xù)的稀釋液一起培育，檢測 并測量各培育混合液中的信號，然后比較各抗體稀釋液顯示的信號測量結果。在一特別優(yōu)選實施例中，本文所用的阻斷性抗IFN-a抗體能阻斷全部或基本全 部IFN-a亞型的IFNAR2-結合而不與IFN-0交叉反應。在本文中，術語“基本全部”指阻 斷性抗 IFN- a 抗體將至少阻斷 IFN- a 1，IFN- a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10， 以及IFN-a 21的IFNAR2結合。在一特別優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的阻斷性抗IFN-a抗體將 阻斷所有已知的IFN-a亞型與IFNAR2的結合。術語“表位”用于指蛋白質抗原上的(單可隆或多可隆)抗體結合位點。可通過“表位作圖”鑒定與特定表位結合的抗體。本領域有許多已知方法可用 于作圖和特征鑒定蛋白質上表位的位置，包括分辨抗體-抗原復合物的晶體結構，競爭試 驗，基因片段表達試驗，和合成肽為基礎的試驗，例如，見Harlow和Lane的第11章，UsingAntibodies, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York，1999所述。競爭試驗本文上下文都有討論。根據(jù)基因片段表達試驗，將 編碼該蛋白質的開放可讀框隨機地或通過特定的遺傳構建而片段化，并測定該蛋白質的表 達片段與所測抗體的反應活性。例如，可用PCR產生基因片段然后在體外轉錄并在放射性 氨基酸存在下翻譯為蛋白質。再用免疫沉淀和凝膠電泳測定該抗體與放射性標記的蛋白質 片段的結合。采用展示在噬菌顆粒表面的隨機肽序列大文庫(噬菌體文庫)也可鑒定某些 表位?；蛘?，可在簡單結合試驗中測試結合于測試抗體的重疊肽片段的確定文庫。后一種 方法適合于確定大約5到15個氨基酸的線形表位。若一種抗體與參比抗體識別相同或空間重疊的表位，則這兩種抗體結合“基本上 相同的表位”。測定兩抗體是否結合相同或空間重疊的表位的應用最廣泛和快速的方法，是 競爭試驗，該試驗可有各種不同形式的布局，使用標記抗原或標記抗體。通常，將抗原固定 在96孔平板上，用放射性或酶標記測量未標記抗體阻斷標記抗體結合的能力。本文所用術語氨基酸或氨基酸殘基，指天然存在的L氨基酸或指下文在變體方面 所述的D氨基酸。本文使用通常所用的表示氨基酸的1字母和3字母縮寫(Bruce Alberts 等人，Molecular Biology of The Cell, GarlandPublishing, Inc. , New York(第三版 1994)。本文所用關于多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”，定義為在排列序列 和導入缺口(如需要)，以獲得最大百分比的序列同一性而不將任何保守性替代看作部分 序列同一性后候選序列中的氨基酸殘基與某序列中的氨基酸殘基相同的百分比?？梢员?領域技術之內的各種方法獲得排列對比以測定氨基酸序列同一性的百分比，例如，可采用 公眾可獲得的計算機軟件如BLAST，BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。 本領域那些技術人員可確定測量排列對比的適當參數(shù)，包括需要獲得被比較序列全長的最 大排列對比的任何算法。為此目的，如下文所述使用序列對比計算機程序ALIGN-2，可獲得 氨基酸序列同一性的百分比。ALIGN-2序列對比計算機程序由Genentech公司制作，其原 代碼與使用者文件已在美國版權辦公室，華盛頓特區(qū)，20559登記備案，它在美國版權登記 處登記號為NO. TXU510087。ALIGN-2程序可通過Genentech公司(舊金山南部，加利佛尼 亞)公開獲得，而ALIGN-2程序的原代碼和其使用指南在國際專利申請出版物2000年7月 6日的W02000/39297中公布。ALIGN-2程序應編制為在UNIX操作系統(tǒng)上使用，較佳地是數(shù) 字UNIX V4. 0 D。所有的序列對比參數(shù)由ALIGN-2程序設置且不變。用于本文目的，某給定氨基酸序列A對某給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性 百分比(或者描述為某給定氨基酸序列A具有或含有與某給定氨基酸序列B的氨基酸序列 同一性百分比)計算如下100乘以分數(shù)X/Y其中X是在A和b的程序性對比中，經序列排列對比程序ALIGN-2評價為同一性匹 配的氨基酸殘基數(shù)目，而Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢岳斫獍被嵝蛄蠥的長度不等同 于氨基酸序列B的長度時，A對B的氨基酸序列同一性百分比并不等于B對A的氨基酸序列 同一性百分比。除非另有特別說明，本文所用的所有氨基酸序列同一性百分比數(shù)值均如上 所述采用ALIGN-2序列對比的算機程序獲得。然而，氨基酸序列同一性百分比也可采用序 列對比程序NCBI-BLAST2 測定(Altschul 等人，Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402 (1997))。
18NCBI-BLAST2 序列對比程序可從 http //www, ncbi. mlm. nih. gov 下載。NCBI-BLAST2 使 用一些檢索參數(shù)，其中所有的這些檢索參數(shù)設置為缺省值，包括，例如，無屏蔽(unmask) =是，鏈(strand)=全部，期望的事物出現(xiàn)(expected occurrences) = 10，最低復雜性 長度(minimum low complexity length) = 15/5，多遍 e 值(multi-pass e-value)= 0.01，多遍常數(shù)(constant for multi-pass) = 25，最終空格排列對比落選(dropoff for finalgapped alignment) = 25 以及評分矩陣(scoring matrix) = BL0SUM62。在采用NCBI-BLAST2作氨基酸序列對比的情況下，某給定氨基酸序列A對某給定 氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者描述為給定氨基酸序列A具有或含有與給 定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比)計算如下100乘以分數(shù)X/Y其中X是在A和B的程序性對比中，經序列排列對比程序NCBI-BLAST2評價為同 一性匹配的氨基酸殘基數(shù)目，而Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢岳斫獍被嵝蛄蠥的長 度不等同于氨基酸序列B的長度時，A對B的氨基酸序列同一性百分比并不等于B對A的 氨基酸序列同一性百分比。當核酸被放置在與另一核酸序列功能性相關的位置上時，是“操作性相連接”的。 例如，如果前序列或分泌前導序列的DNA表達為參與某多肽分泌的前蛋白，則其與該多肽 的DNA操作性相連接；如果啟動子或增強子影響某序列的轉錄，則其與該編碼序列操作性 相連接；或者如果核糖體結合位點的定位易于翻譯，則其與該編碼序列操作性相連接。通常 “操作性連接”指所連接的DNA序列是毗鄰的，如果是分泌性前導序列，應是毗鄰且在讀碼 框內。然而，增強子不需要毗鄰?？稍诜奖愕南拗菩晕稽c上通過連接反應即實現(xiàn)此種連接。 如果沒有這樣的位點，可按常規(guī)方法采用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。術語“疾病狀態(tài)”指細胞或整個哺乳動物的一種生理狀態(tài)，該狀態(tài)中發(fā)生了細胞或 身體功能，系統(tǒng)或器官功能的中斷，停止或失調。術語“有效量”指有效治療(包括預防)哺乳動物的疾病，失調或有害生理狀態(tài)的 藥物量。在本發(fā)明中，“有效量”的抗IFN-a抗體可以降低、減緩或延遲自身免疫失調癥如 IDDM或SLE ；降低，防止或抑制(即，某種程度的減緩優(yōu)選停止)自身免疫失調癥如IDDM或 SLE的發(fā)生；和/或某種程度上減輕一種或多種與自身免疫失調癥如IDDM或SLE有關的癥 狀。在本發(fā)明方法中，術語“控制”和其語法異體詞，是指對有害狀態(tài)(即生理狀態(tài)，如 自反應性T細胞的產生和自身免疫性的發(fā)生)的防止，部分或完全抑制，降低，延遲或減緩。“治療”指治療性處理和預防或防止措施。需要治療者包括那些已患有疾病和那些 易患疾病或那些必須預防疾病者。對于本發(fā)明的目的，有益的或所需的臨床結果包括，但不 限于，緩解癥狀，減輕疾病程度，穩(wěn)定(即不惡化)疾病狀態(tài)，延遲或減緩疾病的發(fā)展，好轉 或減輕疾病狀態(tài)，減輕(無論部分或全部)，無論是可檢測或不可檢測?！爸委煛边€指與不接 受治療的預期存活相比的延長存活。需要治療者包括那些已患疾病或失調癥和那些易患疾 病或那些必須預防疾病者?！八幬飳W上可接受的”運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在所用的劑量和濃度下對接觸其 的細胞或哺乳動物無毒的那些。生理上可接受的運載體常常是水性的PH緩沖溶液。生理 上可接受的運載體的實例包括緩沖液，如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗
19壞血酸；小分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白； 親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸，或賴氨 酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑，如EDTA ；糖醇，如 甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如Tween ，聚乙二醇 (PEG)，和 Pluronics 。治療對象“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家養(yǎng)動物和家畜，和動物 園，競賽或寵物動物，如狗，馬，貓，牛等。優(yōu)選的哺乳動物是人。B.講行本發(fā)明的方法1抗體的產生⑴多克隆抗體制備多克隆抗體的方法是本領域已知的?？稍诓溉閯游矬w中產生多克隆抗體，例 如，一次或多次注射某免疫制劑和(如果需要)佐劑。通常，可通過多處皮下或腹膜內注射 將該免疫制劑和/或佐劑注射入哺乳動物體內?？赡苡杏玫氖菍⒃撁庖咧苿┡c已知在被免 疫接種的動物體中具有免疫原性的蛋白質偶聯(lián)，諸如血清清蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。 可采用的佐劑例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM。在另一優(yōu)選實施例中，可用各種，優(yōu)選所有的IFN-a亞型的混合物免疫接種動 物，以產生對IFN-a諸亞型具有廣泛反應活性的抗IFN-a抗體。在另一優(yōu)選實施例中，用 人IFN-a諸亞型的混合物免疫接種動物，這些亞型存在于仙臺病毒所誘導的伯基特淋巴 瘤細胞(Namalva細胞)分泌的人類淋巴母細胞干擾素中，如下文例1所述那樣。該人類淋 巴母細胞干擾素的合適制品可從Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo)購得(產品號 No.1-9887)。(ii)單克隆抗體單克隆抗體可用雜交瘤方法(最初由Kohler等人，Nature 256 :495 (1975)所述) 制備，或用重組DNA法(美國專利號N0 4，816，567)制備。在雜交瘤方法中，將小鼠或其他合適的宿主動物，如倉鼠或獼猴，按如上所述進行 免疫接種以誘導產生或能產生抗體的淋巴細胞，該抗體能與免疫接種所用的蛋白質特異性 結合?；蛘?，體外進行淋巴細胞免疫接種。然后以合適的融合劑(如聚乙二醇)將淋巴細 胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice,59-103 頁[AcademicPress,1996]。將如此制得的雜交瘤細胞接種在合適的培養(yǎng)基中培育，培養(yǎng)基優(yōu)選含有1種或多 種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，該雜交瘤細胞的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌 呤，氨基蝶呤，和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，其中的物質能阻止HGPRT缺陷性細胞的生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些能有效融合，能支持選出的抗體生成細胞穩(wěn)定性高水平 產生抗體，且對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨 髓瘤系，如由M0P-21和MC-11小鼠腫瘤衍生的骨髓瘤細胞(可從美國加利福尼亞圣地亞 哥 Salk Institute Cell Distribution 中心購得)和 SP-2 或 X63_Ag8_653 細胞(可從 the American Type CultureCollection, Rockcville, Maryland USA 購得)。也J艮道了人 骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系來產生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. 133 =3001.
20(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 頁，Marcel Dekker, Inc.，New York, [1987])。測定有雜交瘤細胞生長的培育液是否產生了針對該抗原的單克隆抗體。優(yōu)選用免 疫沉淀法或體外結合試驗(如放射免疫試驗(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA))測定雜 交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性。例如單克隆抗體的結合親和力可用Scatchard分析法(Mimson等人 AnalBiochem. 107 220(1980))測定。鑒定到產生具有所需特異性，親和力，和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可將該 細胞用有限稀釋法亞克隆并用標準方法培養(yǎng)(Goding，MonoclonalAntibodies principles and Practice，59-103頁Academic Press，1996)。為此目的的合適培育基包括，如DMEM或 RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞也可在動物體內作為腹水瘤生長。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，如A蛋白瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法，凝膠 電泳，透析或親和層析法，可將亞克隆分泌的單克隆抗體適當?shù)貜呐嘤?，腹水中，或?清中分離出來。用常規(guī)方法(如，采用能與單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因特異性結合的寡核 苷酸探針)，不難將編碼單克隆抗體的DNA分離出來并測序。雜交瘤細胞可作為此種DNA的 優(yōu)選來源。一旦分離出來，可將該DNA置入表達載體中，然后轉染入宿主細胞如大腸桿菌細 胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CH0)細胞，或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞中，以獲 得在重組宿主細胞中的單克隆抗體的合成。也可修飾此DNA，例如，用人重鏈和輕鏈恒定區(qū) 的編碼序列取代同源小鼠序列(Morrison等人，Proc. Nat. Acad，Sci. 81 6851[1984])或者 將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。按此方式制 備具有本文抗IFN-a單克隆抗體的結合特異性的“嵌合性”或“雜合”抗體。通常用這種非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)或取代本發(fā)明抗體的一 個抗原結合位點的可變區(qū)，以產生一種嵌合性二價抗體，該抗體含有一個對IFN-a特異性 的抗原結合位點和對一個不同抗原有特異性的另一抗原結合位點。也可采用已知的合成蛋白質化學方法(包括那些涉及交聯(lián)劑的方法)體外制備嵌 合性或雜合抗體。例如，采用二硫化物交換反應或形成硫醚鍵來構建免疫毒素。用于此目 的的適合試劑包括亞胺硫醇鹽和4巰基丁酰亞氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidat e)?？贵w的重組制備將在下文更詳細描述。(iii)人源化抗體人源化抗體通常具有從非人類來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人 氨基酸殘基常稱作“輸入”殘基，該殘基通常取自“輸入”的可變區(qū)。人源化可用Winter及 其同事的方法通過用嚙齒動物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列來進行(Jones等 人，Nature 321 :522_525 [1986] ；Riechmann 等人，Nature 332 :323_327 [1988] ；Verhoeyen 等人，Science239 1534-1536 [1988]；綜述 Clark, Immunol. Today 21 :397_402 [2000])。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合性抗體(Cabilly,同上)，其中基本上不到一個 完整的人可變區(qū)被非人動物的相應序列所取代。實踐中，人源化抗體通常是人抗體中的一 些CDR殘基和可能一些FR殘基被嚙齒動物抗體的類似位點的殘基所取代。
重要的是待人源化的抗體保留了對抗原的高度親和力以及其它有利的生物特性。 為了達到這一目標，根據(jù)優(yōu)選的方法，利用親本與人源化序列的三維模型通過分析親本序 列和不同概念人源化產物的過程，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通?？少彽们覟?本領域技術人員所熟悉。闡述并演示所選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構型結構的 計算機程序市場有售。視查這些演示得以分析候選免疫球蛋白序列的殘基在功能中的可能 作用，如，分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合能力的殘基。這樣，可從共有序列和輸 入序列中選出FR殘基并組合從而獲得所需的抗體特性，如對靶抗原的親和力增加?？傊?CDR殘基直接并最根本地參與了對抗原結合的影響。進一步詳述見美國專利No. 5821337。(iv)人抗體由于缺乏合適的人骨髓瘤細胞系，使用相同技術產生人mAb的嘗試受到阻礙。用 異源骨髓瘤(小鼠*人雜交骨髓瘤)作為融合伴侶(Kozbor，J. Immuno. 133 3001 (1984)； Brodeur 等人，Monoclonal Production Techniques andApplications, 51-63 Jjt, Marcel Dekker，Inc.，New York, 1987)獲得了最好結果?；蛘?，可用 Epstein-Barr 病毒(EBV)感 染使人抗體分泌細胞永生化。然而，EBV感染細胞難于克隆而且通常只產生相對低得率的 免疫球蛋白(James 和 Bell，J. Immunol. Methods 100 5-40[1987]) 將來，通過導入轉化 基因的確定組合，有可能獲得人B細胞的永生化。最近證明端粒酶催化亞基與SV40大T癌 蛋白和H-ras致癌等位基因一起表達導致正常人上皮細胞和成纖維細胞的致癌性轉變突 出 了這種可能性(Hahn 等人，Nature 400 464-468[1999])現(xiàn)在，已能夠產生轉基因動物(如小鼠)，這些動物(經免疫接種)產生沒有內源 免疫球蛋白產物的人類抗體全集(Jakobovits等人，NATURE362 :255_258[1993] ；Lonberg 禾口 Huszar， Int. Rev. Immunol. 13 :65_93[1995] ；Fishwild 等人，Nat. Biotechnol. 14 845-851[1996] ；Mendez 等 Nat. Genet, 15 146-156[1997] ；Green, J Immunol Methods 231 11-23[1999] ；Tomizuka 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722_727[2000]；綜述見 Little等人，Immunol. Today 21 =364-370 [2000]) 0例如，已有描述說在嵌合性和種系突變 小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導致完全抑制內源抗體的產生(Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551_2555 [1993])。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉 移到這類種系突變小鼠中導致了抗原攻擊后人抗體的產生(Jakobovits等Nature，362 255-258[1993])。Mendez 等人(Nature Genetics 15 146-156[1997])已制備了一種轉基因小鼠， 命名為“XenoMouse II”，當受到抗原攻擊時，它會產生高親和力的完全人的抗體。這可 通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座種系整合引入上述缺失內源JH區(qū)段的小鼠體內而獲 得。XenoMouse II含有1，020Kb的人重鏈基因座(約含有66個VH基因，完整的DH和JH 區(qū)以及3個不同的恒定區(qū)ii，5，Y)，還含有800Kb的人K基因座(含有32fVK基因，JK 區(qū)段，和CK基因)。這些小鼠產生的抗體與人抗體在所有方面看都極為相似，包括基因重 排，組裝，以及全集。由于缺失內源JH區(qū)段阻止了小鼠基因座的基因重排，人抗體優(yōu)先于內 源抗體而表達。Tomizuka 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722_727 [2000])最近描述了通 過在一種內源性IgH和IgK基因座被滅活的小鼠品種中導入兩個獨立的人染色體片段 (hCFs)一個含有整個Ig重鏈基因座(IgH，約1.5Mb)而另一個含有整個K輕鏈基因座(IgK，約2Mb)，產生了一種雙轉移染色體(Tc)小鼠。這些小鼠產生了抗原特異性的人抗體 應答反應而無小鼠抗體。此Tc技術使得能夠在小鼠或其他動物中進行兆堿基的復雜的基 因座或基因簇(如編碼T細胞受體，主要組織相容性復合體，P450簇等)的人源化。該方 法的另一優(yōu)點是不需要克隆大的基因座。這是重大進步，因為即使使用酵母人工染色體仍 然難以進行含有整個Ig基因座的兆堿基大小的DNA片段的克隆(Peterson等人.Trends Genat. 13 :61-66[1997] ； Jacobovits, Cvrr Biol. 4 :761_763 [1994])。此外，已知人 IgH 基 因座的恒定區(qū)含有難于克隆的序列(Kang和Cox，Genomics35 189-195 [1996])。另外，可采用噬菌體展示技術從未免疫接種供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因 全集體外產生人抗體和抗體片段(McCafferty等人，Nature 348 :552_553[1990]；綜述 見 Kipriyanov 禾P Litlle, Mol. Biotechnol. 12 173-201[1999] ；Hoogenboom 禾P Chames, Immunlo. Today 21 :371_378[2000])。根據(jù)這一技術，可將抗體V區(qū)基因框內克隆入絲狀噬 菌體如M13或fd的主要或次要包膜蛋白質基因中，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體 片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導致 了顯示這些特性的抗體的編碼基因的選擇。因而，噬菌體模擬了B細胞的有些特性。噬菌 體展示可以多種形式進行(綜述見Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3 564-571[1993] ；Winter 等人’ Annu. Rev. Immunol. 12 433-455[1994]； Dair Acqua 禾口 Carter，Curr. Opin. Struct. Biol. 8 443-450 [1998] ；Hoogenboom 禾口 Chames, Immunol. Today 21 :371_378 [2000])。V基因區(qū)段的一些來源可用于噬菌體展示。 Clackson等(Nature 352 =624-628,1991)從免疫小鼠脾臟獲得的V基因小隨機組合文庫 中分離得到抗唑酮抗體的多樣性陣列。按照Marks等人，J. Mol. Biol. 222 :581_597 [1991] 或Griffiths等人，EMB0 J. 12 :725_734 (1993)所述技術可構建未經免疫的人供體的V基 因全集和分離得到針對抗原(包括自身抗原)的多樣性陣列的抗體。在天然免疫應答中， 抗體基因高速積聚突變(體細胞超突變)。導入的某些變化將賦予更高的親和力，在隨后 的抗原攻擊期間展示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞優(yōu)先復制和分化。采用稱為“鏈改 組”的技術可以模擬這一自然過程(Marks等人，Bio/Technol. 10 :779_783 [1992])。在該 方法中，噬菌體展示獲得的“原代”人抗體的親和力可通過隨后用未經免疫供體的V區(qū)基 因的天然存在的變體(文庫)置換重鏈和輕鏈V區(qū)基因而改進。這一技術得以產生具有 nM范圍親和力的抗體和抗體片段。制備極大噬菌體抗體全集的方法(也稱為“母體全文 庫，，)已由 Waterhouse 等人 Nucl. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993)所描述，而且已報道了 從此種大噬菌體文庫中直接分離得到高親和力的人抗體，見Griffiths等人，EMB0 J. 13 3245-3260(1994)?；蚋慕M也可用于從嚙齒動物抗體中衍生出人抗體，其中該人抗體具有 與起始嚙齒動物抗體類似的親和力和特異性。根據(jù)這一方法，也稱為“表位印記法”，用人V 區(qū)基因全集取代通過噬菌體展示技術獲得的嚙齒動物抗體的重鏈或輕鏈V區(qū)基團，產生了 嚙齒動物_人嵌合體。經抗原選擇導致分離得到能恢復功能性抗原結合位點的人可變區(qū)， 即，表位控制(印記)伴侶選擇。重復這一過程以取代其余的嚙齒動物V區(qū)，獲得了人抗體 (見PCT專利申請W0 93/06213，公布于1993年4月1日)。與通過⑶R移植進行的嚙齒動 物抗體傳統(tǒng)人源化不同的是，該技術提供了完全人的抗體，該抗體沒有嚙齒動物來源的框 架或⑶R殘基。( V )雙特異性抗體
雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體(優(yōu)選人或 人源化抗體)。在本例中，結合特異性的其中一種是對IFN- a的而提供了中和抗體，而另一 種是對其它任何抗原。本領域已知制備雙特異性抗體的方法。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組產生基于 兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Millstein和 Cuello, Nature 305 :537_539[1983])。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分類，這些雜交 瘤(四源雜交瘤(quadroma))產生了 10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具 有正確的雙特異性結構。此種正確分子的純化(通常以親和層析法進行)相當麻煩且產 量低。類似方法公開于PCT申請出版物NO. W0 93/08829中(1993年5月13日出版)，和 Traunecker 等人，EMB0J. 10 :3655_3659 (1991)。根據(jù)一種不同而且更優(yōu)選的方法，將具有所需結合特異性(抗體_抗原結合位點) 的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選與至少含有部分鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū) 的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選在至少一個融合物中存在含有輕鏈結合必需位點的重 鏈第一恒定區(qū)(CH1)?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和如果需要的話編碼免疫球 蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體中，共轉染入合適的宿主生物中。在所用三條多肽鏈 以不相等比率用于構建時提供最大產量的實施例中，該方法為調節(jié)此三條多肽片段的互相 比例提供了很大靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相同比例表達以產生高得率或此比例 沒有特別意義時，可以將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。在該方 法的一個優(yōu)選實施例中，構成該雙特異性抗體的兩臂中，一臂上為具有第一種結合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，而另一臂上為雜合免疫球蛋白重鏈_輕鏈對(提供第二種結合特 異性)。已發(fā)現(xiàn)，由于免疫球蛋白輕鏈只存在于該雙特異性分子的一半中，這提供了容易的 分離方法，這種不對稱結構有利于從不需要的免疫球蛋白鏈混合物中分離所需的雙特異性 組合物。產生雙特異性抗體的更多細節(jié)見，例如Suresh等人，Methods inEnzymology 121， 210(1986)。(VI)異質偶聯(lián)抗體異質偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明范圍之內。異質偶聯(lián)抗體含有兩個共價連接的抗體。例 如，已提出這樣的抗體可將免疫系統(tǒng)細胞靶向不良細胞(美國專利號N0. 4，676，980)，和治 療HIV感染(PCT申請出版物W0 91/00360和W0 92/200373 ；EP 03089)。可用方便的交聯(lián) 方法制備異質偶聯(lián)抗體。適合的交聯(lián)劑是本領域所熟知并與一些交聯(lián)技術一起公開于美國 專利號 N0. 4，676，980 中。(vn)抗體片段在某些實施例中，中和性抗IFN-a抗體(包括小鼠，人和人源化抗體，以及抗體變 體)是一種抗體片段。已發(fā)展了各種技術來制備抗體片段。傳統(tǒng)上通過完整抗體的蛋白水 解消化衍生這些片段(見，Morimoto 等人 J.Biochem.Biophys. Methods 24 107-117 [1992] 和Brerman等人，Science 229 :81 [1985])。然而，這些片段現(xiàn)在可用重組宿主細胞直接 生產(綜述見 Hudson，Curr. Opin. Immunol. 11 :548_557 [1999] ；Little 等人 Immunol. Today21 =364-370[2000]) 0例如，可從大腸桿菌直接回收Fab，-SH片段并化學偶聯(lián)形成 F(ab，)2 片段(Carter 等人.，Bio/Technology 10 163-167 [1992])。在另一實施例中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進F(ab，)2分子的裝配來形成F(ab，)2。根據(jù)另一方法，F(xiàn)v, Fab或 F(ab' )2片段可從重組宿主細胞培育物中直接分離得到。熟練從業(yè)者知道制備抗體片段的 其它技術。(通)抗體的氨基酸序列變體考慮了本文所述抗IFN-a抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體的結 合親和力和/或其他生物特性。通過在編碼抗IFN-a抗體鏈的核酸中導入合適的核苷酸 變化或通過肽合成，制備抗IFN-a抗體的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，缺失， 和/或插入和/或取代抗IFN-a抗體的氨基酸序列內的一些殘基。制作缺失、插入，和取 代的任何組合以獲得最終結構，只要該最終結構具有所需特性。氨基酸變化也可能改變抗 IFN- a抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。中和性抗IFN-a抗體作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的常用鑒定方法稱為 “丙氨酸掃描誘變法”，如 Cunningham and Wells, Science, 244 1081-1085 (1989)所述。鑒 定殘基或靶殘基組(如帶電荷的殘基，精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，和谷氨酸)并用 中性或帶負電荷的氨基酸替代(最優(yōu)選是丙氨酸或聚丙氨酸)以影響氨基酸與抗原的相互 作用。然后那些對于取代表現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置通過在取代位點進一步導入其它 突變而細化。這樣，雖然預先確定了導入氨基酸序列突變的位點，但不需要預先確定突變本 身的性質。例如為了分析某給定位點的突變性能，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨 機誘變并篩選具有所需活性的表達的抗IFN-a抗體變體。氨基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端的融合(長度范圍從一個殘基到包 含100個或更多殘基的多肽)以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。未端插入的例子 包括具有N末端甲硫氨酰殘基的抗IFN-d中和性抗體，或與一表位標簽融合的抗體?？?IFN-a抗體分子的其他插入性變體包括在抗體的N或C末端融合能增加抗體的血清半衰期 的多肽或酶。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體在中和性抗IFN-a抗體分子中至少有 一個氨基酸殘基被去除并在其位置插入了 一個不同的殘基。取代誘變的最關注位置包括高 變區(qū)，但也考慮FR的改變。保守性取代見表1題頭為“優(yōu)選的取代”。如果這些取代導致生 物活性改變，那么可，見表1中稱為“示范性取代”，或如下文所述參見氨基酸分類導入更多 的實質性變化并篩選產物。表一
原殘基示范性取代優(yōu)選的取代丙氨酸(A)纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸纈氨酸精氨酸(R)賴氨酸，谷氨酰胺；天冬酰胺賴氨酸天冬酰胺(N)谷氨酰胺；組氨酸；天冬氨酸；賴氨酸；精氨酸谷氨酰胺天冬氨酸(D)谷氨酸；天冬酰胺谷氨酸
25 選擇在維持(a)取代區(qū)多肽主鏈的結構，例如片層或螺旋構型，(b)靶位點上分子 的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小方面的作用明顯不同的取代，進行抗體生物特性的實 質性修飾。根據(jù)共同的側鏈性質，將天然存在的殘基分成以下幾組(1)疏水的正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；
(2)中性、疏水的半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸；(4)堿性的天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族的色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守性取代需要將這些類別之一的一個成員換成另一類別的成員不參與維持中和性抗IFN- a抗體正確構型的任何半胱氨酸殘基也可被取代(通 常用絲氨酸)以改善該分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體加入半胱氨酸 鍵以改善其穩(wěn)定性(尤其當抗體是如FV片段的抗體片段時)。特別優(yōu)選的取代變體類型包括取代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個 高變區(qū)殘基。通常，為進一步發(fā)展選擇的所得變體將具有改進的生物活性(相對于產生它 們的親本抗體而言)。產生這樣的取代變體的方便方法是通過噬菌體展示的親和力成熟。 簡單而言，可進行幾個高變區(qū)位點(如6-7位點)的突變以在各個位點產生所有可能的氨 基酸取代。如此產生的抗體變體作為與包裹在每個顆粒中的M13基因III產物的融合物， 以單價形式從絲狀噬菌體顆粒中展示。然后如本文所述篩選噬菌體展示的變體的生物活性 (如，拮抗劑活性)。為了鑒定進行修飾的候選高變區(qū)位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒定 對抗原結合有明顯貢獻的高變區(qū)殘基。或者，或另外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以 鑒定抗體和IFN-a之間的接觸點可能是有利的。根據(jù)本文所述技術，這種接觸殘基和相鄰 殘基是取代的候選者。一旦產生這樣的變體，如本文所述篩選變體組并在一個或多個相關 試驗中選出具有優(yōu)良特性的抗體來進一步開發(fā)。(IX)糖基化變體抗體在它們的恒定區(qū)保守位置上糖基化(Jefferis和Lund，Chem. Immunol. 65 111-128[1997] ；Wright 和 Morrison，TrendsBiotechnol. 15 :26_32[1997])。免疫球蛋白 的寡糖側鏈影響蛋白質的功能(Boyd等人，Mol. Immunol. 32 1311-1318[1996] ；ffittwe 和Howard, Biochem. 29 :4175_4180[1990])，和能影響糖蛋白構型和所呈現(xiàn)三維表面的 糖蛋白部分之間分子內相互作用(Jefferis和Lund，同上，；Wyss和Wagner，Current Opin. Biotech. 7 409-416[1996]) 寡糖也能基于特導性識別結構將給定的糖蛋白靶向 某些分子。例如，已有報導說在未半乳糖基化的IgG中，其寡糖部分翻轉出CH2之間間 隔，使末端N-乙酰葡糖胺殘基可結合甘露糖結合蛋白質(Malhotra等人，Nature Med. 1 237-243[1995])。用糖肽酶從中國倉鼠卵巢(CH0)細胞產生的CAMPATH-1H(識別人淋巴 細胞的CDw52抗原的重組人源化鼠單克隆IgGl抗體)中去除寡糖，導致補體介導的裂解 (CMCL)完全減低(Boyd等人Mol. Immunol. 32 1311-1318 [1996])，而使用神經氨酸酶選擇 性去除唾液酸殘基不會引起DMCL的損失。也已報道抗體的糖基化會影響依賴于抗體的細 胞的細胞毒性(ADCC)。特別地，根據(jù)報道，具有四環(huán)素調節(jié)的0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺轉移 酶III (GnTIII)( 一種催化等分GlcNAc形成的糖基轉移酶)表達的CH0細胞，具有改進的 ADCC 活性(Umana 等 Meture Biotech, 17 176-180，1999)。通?？贵w的糖基化是N連接或0連接。N連接指糖部分結合于天冬酰胺殘基的側 鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何 氨基酸)是糖部分與天冬酰胺側鏈的酶促結合的識別序列。這樣，在多肽中存在這些三肽序列之一產生了潛在的糖基化位點。0連接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖 之一結合于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨 酸?？贵w的糖基化變體是抗體的糖基化模式被改變的變體。改變意味著抗體中缺失一 個或多個原有的糖部分，在抗體中加入一個或多個糖部分，改變糖基化組成(糖基化模式) 和糖基化程度，等等。通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述的三肽序列可方便地實現(xiàn)將糖基 化位點加入抗體中(對于N連接糖基化位點)。也可在原抗體序列中加入或取代一個或多 個絲氨酸或蘇氨酸殘基進行這種改變(對于0連接糖基化位點)。類似地，改變抗體的天然 糖基化位點內的氨基酸也可實現(xiàn)糖基化的消除。通過改變核酸序列通常可改變氨基酸序列。用本領域已知的各種方法制備 抗-IFNa抗體的氨基酸序列變體的編碼核酸分子。這些方法包括但不限于，從天然來源中 分離(就天然存在的氨基酸序列變體而言)，或通過對抗-IFN抗體的先前制備的變體或非 變體的寡酸苷酸介導(或定點)的誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。也可不改變氨基酸序列或核苷酸序列而改變抗體的糖基化(包括糖基化模式)。 糖基化主要取決于用于表達抗體的宿主細胞。由于用于表達作為潛在治療劑的重組糖蛋白 (如抗體)的細胞類型極少為天然細胞，可以預見抗體糖基化模式的明顯變異(見Hse等人 J Biol. Chem, 272 =9062-9070. 1997)。除了選擇宿主細胞外，在抗體重組產生過程中影響糖 基化作用的因素包括生長方式，培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)密度，氧合作用，PH值，純化方案等。業(yè)已 提出各種方法在具體宿主生物體中獲得糖基化模式的改變，包括導入或過度表達參與寡糖 產生的某些酶(美國專利No. 5，047，335 ；5, 510，261 ；和5，278，229)。糖基化，或某些類型 的糖基化，可從糖蛋白中經過酶促反應而消除，例如使用內切糖苷酶H(EndoH)。此外，可以 基因改造重組宿主細胞，如，制造某些類型多糖加工的缺陷。這些以及類似技術是本領域熟 知的。 可采用常規(guī)的糖類分析技術(包括凝集素層析，NMR,質譜，HPLC，GPC，單糖組分分 析，順序酶消化，以及使用高PH陰離子交換層析根據(jù)電荷分離寡糖的HPAEC-PAD)不難分 析抗體的糖基化結構。為了分析目的而釋放寡糖的方法也是已知的，包括但不限于酶處理 (通常用肽-N-糖苷酶F/內切-0 -半乳糖苷酶進行)，用強堿性環(huán)境消除以主要釋放0連 接結構，以及用無水胼釋放N連接和0連接寡糖的化學方法。( X )抗體的其它修飾本文所公開的中和性抗IFN-a抗體也可配制成免疫脂質體。含此抗體的脂質體 可用本領域已知的方法制備，如 Epstein 等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 3688[1985]； Hwang 等人，.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；以及美國專利 No. 4，485，045 和 4，544，545.所述。具有增加的血循環(huán)期的脂質體公開于美國專利NO 5，013，556中。用含有磷脂酰膽堿，膽固醇和磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物(PEG-PE)的脂質組 合物進行反相蒸發(fā)方法可產生特別有用的脂質體。將脂質體擠壓通過確定孔徑的濾器以產 生具有所需直徑的脂質體。如Martin等人 ，J. Biol. Chem. 257 =286-288 (1982)所述通過 鏈間二硫鍵反應，可將本發(fā)明抗體的Fab’片段與脂質體偶聯(lián)。可任選地在該脂質體中含有 化療劑(如多柔比星)。見 Gabizon 等人 J. National Cancer Inst. 81(19) ；1484(1989)。
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通過將抗體與一種前藥活化酶偶聯(lián)，此酶能將前藥(如肽基化療劑，見 W081/01145)轉變成活性藥物，也可在ADEPT中應用本發(fā)明的抗體。見，例如，W088/07378 和美國專利NO 4，975，278?？捎糜贏DEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能作用于前藥的任何酶，此酶能將前藥 轉變成顯示所需生物特性的更活躍形式。本發(fā)明方法中使用的酶包括但不限于，用于將含磷酸鹽的前藥轉變成游離藥物的 堿性磷酸酶；用于將含硫酸鹽前藥轉變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酶；用于將無毒5-氟胞嘧啶 轉變成抗癌藥物(5_氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽的前藥轉變?yōu)橛坞x藥物的蛋 白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋 白酶B和L)；用于轉變含D-氨基酸取代前藥的D-丙氨酰羧肽酶；用于將糖基化的前藥轉變 為游離藥物的糖類裂解酶，如半乳糖苷酶和神經氨酸酶；用于轉變內酰胺衍生藥物 為游離藥物的3內酰胺酶；青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在 其氨基氮分別用苯氧乙?；虮揭阴；鶊F衍生的藥物轉變?yōu)橛坞x藥物。另外，具有酶活性的 抗體，在本領域稱為“抗體酶”，可用于將本發(fā)明的前藥轉變?yōu)橛坞x藥物(見Massey，Nature 328 :457-458(1987))?？贵w-酶偶聯(lián)物可按本文所述方法制備，將抗體酶輸送給所需的細 胞群?？捎帽绢I域熟知的技術將酶與中和性抗IFN-a抗體共價結合，如使用上述的異 質雙功能交聯(lián)劑。另外，用本領域熟知的重組DNA技術可構建融合蛋白質，該蛋白質至少 含有與本發(fā)明酶的功能活性部分相連的本發(fā)明抗體的抗原結合區(qū)(見Neuberger等人， Nature 312 :604_608[1984])。在本發(fā)明的某些實施例中，可能需要采用抗體片段而不是完整的抗體。在此情況 下，可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。例如這可通過在抗體片段中摻入一補救 性受體結合表位(如，通過在抗體片段內合適區(qū)域的突變，或在肽標簽中摻入該表位，然后 與抗體片段末端之一或中間融合，如，通過DNA或肽合成)而實現(xiàn)。見1996年10月17日 公布的 W0 96/32478。通常，補救性受體結合表位構成一個區(qū)域，其中Fc區(qū)的一個或二個環(huán)上的任一個 或多個氨基酸殘基被轉移到該抗體片段的類似位置。甚至更優(yōu)選Fc區(qū)的一個或二個環(huán)上 的3個或多個殘基被轉移。更優(yōu)選此表位取自Fc區(qū)(如IgG)的CH2結構域并且轉移到此 抗體的CH1，CH3或VH區(qū)或1個以上的這些區(qū)域中?；蛘?，此表位取自Fc區(qū)的CH2結構域 并且轉移到該抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或這二個區(qū)。中和性抗IFN-a抗體的共價修飾也包括在本發(fā)明范圍之內。如果需要，可通過 化學合成或抗體的酶促裂解或化學裂解制備。用能夠與所選側鏈或N端或C端殘基反應 的有機衍生試劑與此抗體的靶氨基酸殘基反應，將其它類型的抗體共價修飾引入此分子 中。典型的多肽共價修飾在美國專利5，534，615中有描述，參考文獻中?？贵w共價修飾的 優(yōu)選類型包括以美國專利 4，640, 835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ；4, 670, 417 ；4, 791，192 或 4，179，337中所述方式將抗體與各種非蛋白性聚合物之一相連，如聚乙二醇，聚丙二醇，或 聚氧化烯。2、篩選具有所需特性的抗體產生抗體的技術上文已有描述。具有所需的廣泛的中和特性的抗IFN-a抗體可
29用本領域已知方法來鑒定。⑴結合試驗例如，將候選抗體與一種或多種IFN- a亞型，或各種IFN_ a亞型的陣列或混合物 一起培育，并監(jiān)測結合和IFN-a生物活性的中和，可在IFN-a結合試驗中鑒定本發(fā)明的中 和性抗IFN-a抗體?？刹捎眉兓腎FN-a多肽進行此結合試驗。在一實施例中，該結合 試驗是競爭性結合試驗，其中評價在IFN-a結合方面候選抗體與一個已知抗IFN-a抗體 競爭的能力。此試驗可以不同方式進行，包括ELISA形式，也在下列實施例中闡述。如下所 述，也可用BIAcore 生物傳感器試驗監(jiān)測候選抗體的IFN-a結合?？刹捎帽绢I已知的任何合適的競爭結合試驗來特征鑒定候選抗IFN-a單克隆抗 體與小鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3競爭結合某具體IFN-a種類的能力。常規(guī)競爭試 驗在 Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow 禾口 David Lane (1988)中有所描述。在另一實施例中，可改進如下例2所述的IFN_ a結合性 ELISA試驗以利用候選抗體與9F3抗體之間的IFN- a結合競爭。該試驗按如下方法進行 在微量滴定板上包被IFN- a，用與所選濃度的標記9F3抗體相混合的未標記抗IFN- a抗 體或未標記對照抗體的系列稀釋液溫育已包被的滴定板，檢測并測量9F3抗體標記物的信 號，然后比較抗體的不同稀釋液所顯示的信號測量結果。(ii)抗病毒試驗例如，如 Kawade，J. Interferon Res. 1 :61_70(1980)或 Kawade 禾口 Watanabe， J. Interferon Res. 4 =571-584(1984)所述，通過監(jiān)測IFN_a的抗病毒活性的中和，可測定 候選抗體中和IFN-a生物活性的能力。簡而言之，將與候選抗體的不同稀釋液預先混合的 固定濃度的IFN-a加入到人羊膜衍生FL細胞中，并用適當?shù)牟《?如新培斯病毒)測定 候選抗體中和IFN-a的抗病毒活性的能力。用國際參考品人IFN-a (NIH Ga23-901_527) 測定，以國際單位(IU)表示滴定度。如果某一濃度的抗體比在同等濃度對照抗體存在下所測定的抗病毒活性抑制基 線水平抑制了更多的抗病毒活性，那么認為該候選抗IFN-a抗體能夠抑制所選IFN-a亞 型的抗病毒活性。任選地，在抗病毒活性試驗中與在同等濃度對照抗體存在下所測的基線 活性相比，某一濃度候選抗IFN-a抗體將抑制所選IFN-a亞型的抗病毒活性的至少約 60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，或更佳至少約80 %，或再佳至少約85 %，或還要佳 至少約90 %，或還要更佳至少約95 %，或最佳至少約99 %。如果候選抗體的任何濃度不顯 示比在同等濃度對照抗體存在下所測抗病毒活性抑制基線水平更多的抗病毒活性抑制度， 那么認為該候選抗IFN-a抗體不能抑制所選IFN-a亞型的抗病毒活性。在一個優(yōu)選實施例中，滴定在病毒感染性試驗中所用的每種干擾素至一濃度，該 濃度提供與IFN-a標準品預選單位數(shù)所誘導的相同水平的病毒生長抑制。該濃度的作用 是提供受測試干擾素的標準化單位。為了評價抗IFN-a抗體抑制不同IFN-a亞型的抗病 毒活性的能力，對每種待測試IFN-a亞型測定了抗IFNa抗體抑制具體IFN_a亞型抗病 毒活性(滴定至提供標準化活性單位的濃度)50%的有效濃度(EC50)。在一個實施例中，如下例1所述進行抗病毒活性中和試驗。簡而言之，在96孔微 量滴定板上培養(yǎng)A549細胞至密度5X105個A549細胞/孔。在37°C以100 1的總體 積將0. 2單位/ : 1的所選IFN- a亞型(標準化至0. 2單位/ : 1的NIH參考標準品重組人
30IFN-ci2)與候選抗IFN-a抗體的系列稀釋液培育1小時。然后將各100 1體積的抗體 /干擾素培育混合物加入到微量滴定板的各孔的5X105A549細胞和100 1的培育基中， 各孔中獲得最終100單位/ml的IFN-a濃度。37°C培育該細胞培養(yǎng)混合物24小時。然后 將細胞用2X 105pfu的腦心肌炎(EMC)病毒攻擊并37c再培育24小時。培育后，用可見光 顯微鏡檢或結晶紫染色測定細胞活力。對每個待檢測的IFN-a亞型測定候選抗IFN-a抗 體在試驗中抑制具體IFN-a亞型抗病毒活性50%的有效濃度(EC50)。在本發(fā)明的一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN_ a 亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN-a亞型的EC50 高達約20 :g/ml，或高達約10 :g/ml，或高達約5 :g/ml，或高達約4 :g/ml，或高達約3 :g/ ml，或高達約2 :g/ml，或高達約1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 1 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 2 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 3 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 4 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 5 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 1 :g/ml 的。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 6 :g/ml 至約 20 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 10 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 2 :g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 7 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 8 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 9 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對各受測試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 1 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 5 :g/ml， 從約 1 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 2 :g/ml。(iii)交叉阻斷試驗為了篩選能與感興趣抗體所結合的IFN-a表位相結合的抗體，可進行如 "Antibodies, A Laboratory Manual，，，Cold Spring Habor Laboratory, Ed Harlow 禾口 David Lane，1988所述的常規(guī)交叉阻斷試驗?；蛘?，或此外，可用本領域已知的方法進行表 位作圖。例如，可用Fendly等人.，Cancer Research50 1550-1558 (1990)所述的競爭結 合分析測定受本發(fā)明單克隆抗體結合的IFN-a表位。在另一個例子中，在微量滴定板上用 直接熒光進行交叉阻斷研究。此方法中，使用已建立的方法(Wofsy等人.Select Methods in CellularImmunology, 287 頁，Mishel 禾口 Schiigi 編 San Francisco :ff.J. Freeman Co. (1980))，將感興趣的單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。微量滴定板的孔用所 選IFN-a包被，將包被孔與(l)FITC標記的感興趣單克隆抗體和(2)未標記的受試單克隆 抗體的混合物一起培育，并且定量測定各孔的熒光以確定此抗體所顯示的交叉阻斷水平。 如果與無關單克隆抗體對照相比各單克隆抗體彼此阻斷了 50%或更多的結合，那么認為這 些單克隆抗體針對一共同表位。在細胞為基礎的生物試驗中所獲結果然后可在動物中測試，如小鼠模型，和人臨 床實驗。若需要，可將已鑒定具有所需特性的鼠單克隆抗體轉變成嵌合抗體，或用本領域所 熟知的技術人源化，包括“基因轉變誘變”方法，如美國專利N0. 5，821，337中所述，本文參 考引用該完整專利。本文的特定抗IFN-a抗體的人源化也在下列實例中描述。(iv)噬菌體展示方法可利用組合文庫鑒定本發(fā)明抗IFN-a抗體，以篩選具有所需活性的合成性抗體克隆。原則上，篩選含有展示與噬菌體包膜蛋白融合的抗體可變區(qū)(Fv)的各種片段(如， Fab，F(xiàn)(ab’)2等)的噬菌體的噬菌體文庫，選出合成性抗體克隆。用所需抗原的親和層析 淘選這樣的噬菌體文庫。表達能與所需抗原結合的Fv片段的克隆被抗原吸附并因而與文 庫中的非結合性克隆相分離。然后從抗原上洗脫結合性克隆，可另加幾輪抗原吸附/洗脫 循環(huán)進一步富集。通過設計合適的抗原篩選方法以選出感興趣的噬菌體克隆，然后采用此 感興趣噬菌體克隆的Fv序列和如Kabat等人(1991)，同上所述的合適恒定區(qū)(Fc)序列構 建全長的抗IFN-a抗體克隆，可獲得本發(fā)明任何IFN-a抗體。噬菌體展示文庫的構建抗體的抗原結合結構域由輕(VL)鏈和重(VH)鏈的兩個各含有約110個氨基酸 的可變(V)結區(qū)構成，二者都有三個高變環(huán)或互補決定區(qū)(⑶R)。如Winter等人.，Ann. Rev. Immunol, 12 =433-455(1994)所述，可變區(qū)可在噬菌體上功能性展示；或者作為單鏈 Fv(scFv)片段，其中VH和VL通過一條短而柔性的肽共價相連，或者作為D(ab’)2片段，其 中二片段分別與恒定區(qū)融合并且非共價互相作用。如本文所用，scFv編碼噬菌體克隆和 Fab或F(ab’)2編碼噬菌體克隆都稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”。動物的原初文庫(抗原攻擊前的文庫)提供了能與基本上任何非自身分子以中等 親和力0V1約為Kf-lOl1)結合的抗體。抗體結合位點的序列多樣性在種系中不直接編 碼但以組合方式由V基因區(qū)段組裝。在人重鏈中，從不到50個VH基因區(qū)段中取得前兩個 高變環(huán)(HI和H2)，與D區(qū)段和JH區(qū)段聯(lián)合產生第三個高變環(huán)(H3)。在人輕鏈中，從不到 約30個V8和不到約30個V6區(qū)段中取得前兩個高變環(huán)(L1和L2)和第三個(L3)的大部 分以完成第三個高變環(huán)(L3)。干細胞中V基因區(qū)段的每種組合性重排產生了表達單個VH-VL組合的B細胞。免 疫接種引發(fā)了制造結合免疫原的組合的B細胞增值(克隆擴增)并分泌相應抗體。然后通 過誘變和選擇(稱為親和力成熟)過程這些天然抗體成熟至高度親和力(KZ為109-10M-1)。 此后，通常取出這些細胞以制備雜交瘤并產生高親和力的單克隆抗體。如Winter 等人 Ann. Rev. Immunol, 12 :433_455 (1994)所述，在此法三步中，VH 和 VL基因文庫可通過聚合酶鏈反應(PCR)分別克隆并在噬菌體文庫中隨機重組，然后搜尋 抗原結合克隆。免疫接種來源的文庫提供了對免疫原的高親和力抗體，而不需要構建雜交 瘤。另外，如Griffiths等人EMB0J. 12 :725-734 (1993)所述，可將該原初文庫克隆以在無 需免疫接種的前提下提供對廣泛范圍的非自身和自身抗原的人抗體的一種來源。最后，如 Hoogenboom 和 Winter. J. Mol. Biol.，227 :381_388 (1992)所述，通過克隆自干細胞的未經 重排的V或VIII基因區(qū)段，并采用含有隨機序列的PCR引物以在體外編碼CDR3高變區(qū)并完成 重排，也可合成制得原初文庫。噬菌體展示模仿了 B細胞。通過與次要包膜蛋白p III融合使用絲狀噬菌體來展示 抗體片段。如Marks等人J. Mol. Biol. 222 =581-597 (1991)所述，抗體片段可作為單鏈Fv 片段展示，其中VH和VL區(qū)通過一柔性的多肽接頭連接在同一多肽鏈上，或如Hoogenboom 等人，Nucl. AcidsRes. ,19 :4133_4137 (1991)所述，作為 Fab (包括 F (ab，)2)片段展示，其 中一條鏈與PIII融合而另一條分泌入細菌宿主細胞周質中，在那兒組裝成Fab-包膜蛋白質 結構，通過取代一些野生型包膜蛋白在噬菌體表面展示。當抗體片段與P III的N端融合時， 此噬菌體有傳染性。然而，如果切下P III的N末端結構域并與第二結構域形成融合，此噬菌體無傳染性，而野生型P III必須通過輔助噬菌體提供。可將噬菌體的p III融合物和其它蛋白質全部編碼在同一噬菌體復制子中或不同 復制子上。使用兩個復制子時，在噬菌粒(含有噬菌體復制起點的質粒)上編碼P III融合 物。如，Vieira和Messing，Meth. Enzymol, 153 :3_11 (1987)所述，用提供所有噬菌體蛋白質 (包括pill)但由于缺乏起點在與噬菌粒競爭中自身難以被包裝的輔助噬菌體(如M13K07) 通過“挽救”，將噬菌體包入噬菌體顆粒中。在一優(yōu)選方法中，如Bass等人Proteins，8 309-314(1990)和 W092/09690 (PCT/US91/09133 公布于 1992 年 6 月 11 曰)所述，設計噬菌 體展示系統(tǒng)，使得重組噬菌體可在允許不多于微量的噬菌體顆粒在顆粒表面展示一個以上 拷貝的FV —包膜蛋白融合物的條件下在宿主細胞中培養(yǎng)。一般，從人或動物收獲的免疫細胞中獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果需要偏 性選擇抗IFN-a克隆的文庫，可用IFN-a免疫接種該對象以產生抗體應答，并回收脾細胞 和/或循環(huán)性B細胞外周血淋巴細胞(PBL)用于文庫構建。在一優(yōu)選實施例中，在具有功 能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內源抗體產生系統(tǒng))的轉基因小鼠中產生抗人 IFN-a抗體應答而獲得偏性選擇抗人IFN-a克隆的人抗體基因片段文庫，因而IFN_ a免 疫接種產生的B細胞可產生抗IFN- a的人序列抗體。在另一優(yōu)選實施例中，為了產生(包括生成對IFN-a諸亞型具有廣泛反應活性的 抗IFN-a抗體的B細胞)抗體應答用不同的優(yōu)選所有的IFN-a亞型的混合物免疫接種動 物。在另一優(yōu)選實施例中，如下例1所述，用存在于人類淋巴母細胞干擾素(由仙臺病毒誘 生的伯基特淋巴瘤細胞(Namalva細胞)分泌)中的人IFN_a諸亞型混合物免疫接種動物。 此種人類淋巴母細胞干擾素的適用制品可從Sigma Chemical Compay, St. Louis, MO購得。用適當?shù)暮Y選方法分離表達IFN-a特異性膜結合抗體的B細胞，如用IFN_ a 親和層析分離細胞或使細胞吸附于熒光色素標記的IFN-a，然后用熒光激活細胞分選法 (FACS)，可獲得抗IFN-a反應活性細胞群的進一步富集?；蛘?，使用未免疫供體的脾細胞和/或B細胞或其它PBL，提供可能的抗體文庫的 更好提呈，并且也得以使用IFN-a無抗原性的動物(人或非人)構建抗體文庫。為了體 外摻入抗體基因構建物的文庫，收獲該對象的干細胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核 酸。感興趣的免疫細胞可從各種動物獲得，如人、小鼠、大鼠、兔、luprine、犬、貓、豬、牛、馬、
鳥類等?？蓮母信d趣的細胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴 增。如 Orlandi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86 :3833_3837 (1989)所述，在重排 VH 和VL基因文庫的情況中，分離淋巴細胞的基因組DNA或mRNA然后用匹配于重排VH和VL 基因的5’和3’端的引物進行聚合酶鏈反應(PCR)，可獲得所需的DNA，然后制得用于表達 的多樣性 V 基因文庫。如 Orlandi 等人，(1989)和 Ward 等人，Nature，341 :544_546 (1989) 所述，用編碼成熟V結構域的外顯子5’端上的后引物和基于J區(qū)段內的前引物，可從cDNA 和基因組DNA中擴增此V基因。然而，如Jones等人，Biotechnol，9 =88-89(1991)所述，對 于cDNA擴增，后引物也可基于前導外顯子，而如Sastry等人，Proc. Natl. Acad. Sci, (USA)， 86 =5728-5732 (1989)所述，前引物也可基于恒定區(qū)。如Orlandi等人，(1989)或者Sastry 等人(1989)所述，為了將互補性最大化，可在引物中摻入簡并性。優(yōu)選地，如Marks等 人，J. Mol.Biol，222 :581-597(1991)中方法所述或如 Orum 等人，Nucleic AcidsRes. ,21 4491-4498(1993)方法所述，采用針對各V基因家族的PCR引物以擴增存在于免疫細胞核酸 樣品中所有可得的VH和VL排列，使該文庫多樣性最大化。如Orlandi等人(1989)所述， 為了將擴增的DNA克隆入表達載體，可將稀有的限制性位點引入PCR引物一端中作為標記， 或如Clackson等人Nature，352 :624_628 (1991)所述，用標記的引物進行進一步PCR擴增。合成性重排的V基因文庫可在體外由V基因區(qū)段衍生。大部分的人VH基因區(qū)段 已被克隆與測序(Tomlinson等人，J.Mol.，Biol.，227 :776_798 (1992)所報導)，以及作圖 (Matsuda等人，Nature Genet. ,3 =88-94(1993)所報導)；這些克隆的區(qū)段(包括HI和H2 環(huán)的所有主要構象)用編碼不同序列和長度的H3環(huán)的PCR引物可產生多樣性VH基因文庫 (如 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227 :381_388 (1992)所述)。用位于單個長度的 長H3環(huán)中的所有序列多樣性也可制備VH文庫(Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457-4461(1992)所述)。人 V6 和 V8 區(qū)段已被克隆和測序(Williams 和 Winter，Eur. J. Immunol. ,23 :1456_1461 (1993)報導)并可用于制取合成性輕鏈文庫。以一系列VH和 VL折疊和L3以及H3長度為基礎的合成性V基因文庫，將編碼大量的結構多樣性的抗體。V 基因編碼DNA經擴增之后，種系V基因區(qū)段可按照Hoogenboom和Winter，J. Mol. Biol227 381-388(1992)所述方法體外重排。以幾種方法將VH和VL基因文庫聯(lián)合在一起，可構建抗體片段的文庫。每一種文 庫可構建在不同載體中，在體外重組這些載體，如Hogrefe等人，Gene, 128 119-126 (1993) 所述，或體內組合感染，例如 Waterhouse 等人，Nucl. Acids Res. ,21 :2265_2266 (1993)所 述的loxP系統(tǒng)。體內重組法利用Fab片段的二鏈性質來克服大腸桿菌轉化效率所帶來的 文庫大小限制。分別克隆原初VH和VL文庫，一個克隆入噬菌粒而另一個克隆入噬菌體載 體。然后用噬菌體感染含噬菌粒的細菌，將兩文庫聯(lián)合，使得每個細胞都含有不同的組合而 且文庫大小只受所存在細胞數(shù)目的限制(約1012克隆)。兩載體都含有體內重組的信號， 使得VH和VL基因被重組于一個復制子上而且共同包裝入噬菌體毒粒中。這些巨大文庫提 供了大量有良好親和力0V1為約10_8M)的多樣性抗體。另外，可將這些文庫依次克隆至同一載體中，如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 =7978-7982 (1991)所述，或用PCR組裝起來，然后克隆，如Clackson等人， Nature 352:624-628(1991)所述。PCR組裝也可用于將VH和VL DNA與編碼一柔性肽間隔 物的DNA相連接以形成一個單鏈Fv(SCFv)文庫。在另一技術中，“細胞內PCR組裝”用于在 淋巴細胞中通過PCR組合VH和VL基因，然后克隆所連接的基因文庫(如Embleton等人， Nucl. Acids Res. ,20 3831-3837 (1992)所述)。原初文庫(或者天然或者合成的)所產生的抗體可能具有中度親和力0V1為 約10_6 lCTM—1)，但通過構建和重選擇次級文庫也可在體外模仿親和力成熟(如Winter 等人(1994)，同上所述)。例如使用易錯聚合酶(Leung等人，Technique, 1 11-15 (1989) 報導)以 Hawkins 等人，J. Mol. Biol.，226 :889_896 (1992)的方法或以 Gram 等人，Proc. Natl. Acad, SciUSA. 89 =3576-3580 (1992)的方法可在體外隨機引入突變。此外，通過在 所選個體的Fv克隆中隨機突變一個或多個CDR，如采用帶有跨越感興趣CDR的隨機序列 的引物作PCR，并篩選更高親和力的克隆可進行親和成熟過程。W0 9607754 (公開于1996 年3月14日)描述了在免疫球蛋白輕鏈的互補決定區(qū)中誘導突變產生輕鏈基因文庫的方 法。另一有效方法是重組通過噬菌體展示對得自非免疫供體的天然存在V區(qū)變體文庫選出
35的VH或VL結構域，并通過幾輪鏈改組篩選更高的親和力(如Marks等人，BiotechnollO 779-786(1992)所述)。這一技術產生了具有10_9M范圍親和力的抗體和抗體片段。膽 謝本廳雅輸IFN-ci械a^IFN- a 的合成利用已公布的干擾素的氨基酸和核酸序列(如見J. InterferonRes.，13 443-444(1993)、含有各種I型干擾素基因組和cDNA序列的匯編參考文獻和該文引用的 參考文獻)可設計本文所用的IFN-a亞型的編碼核酸序列。對于IFN-aA(IFN-a2)、 IFN- a B (I FN- a 8)、I FN- a C (IFN_ a 10)、I FN- a D (IFN_ a 1)、IFN_ a E (IFN_ a 22)、 IFN-a F(IFN-a 21)、IFN-a G (IFN-a 5)、IFN-a H (IFN-a 14)氨基酸序列或 cDNA 序 列，見Goeddel等人，Nature, 290 :20_26 (1981) 23-24頁的圖3和圖4。對于編碼 IFN- a 7 (IFN- a J)的氨基酸序列的 cDNA,見 Cohen 等人，Dev. Biol. Standard, 60 111-112(1985)。用本領域已知的各種方法可制備編碼感興趣的干擾素的DNA。這些方法 包括但不限于 Engels 等人 Agnew. Chem. Int. Ed. Eghl. ,28 :716_734 (1989)中所述任何一種 化學合成方法，如三酯，亞磷酸酯，亞磷酰胺和H膦酸酯方法。在一個實施例中，在干擾素編 碼DNA的設計中采用表達宿主細胞優(yōu)選的密碼子。另外，編碼干擾素的DNA也可從基因組 或cDNA文庫中分離得到。構建了編碼感興趣干擾素的DNA分子之后，將該DNA分子操作性連接于表達載體 如質粒中的表達調控序列，其中調控序列可為用此載體轉化的宿主細胞所識別?？傊|粒 載體包含有復制和調控序列，這些序列衍生于與宿主細胞相容的物種。此載體通常帶有一 個復制位點以及編碼蛋白質(能夠提供在轉化細胞中的表型選擇)的序列。對于原核宿主的表達，合適的載體包括pBR322(ATCC No. 37017)、phGH107 (ATCC No. 40011)、PB0475、pS0132、pRIT5、PRIT20 或 pRIT30 系列中的任何載體(Nilsson 禾口 Abrahmsen，Meth. Enzymol.，185 144—161 (1990))、pRIT2T、pKK233_2、pDR540 禾口 pPL-lambda。本文所適用的含有表達載體的原核宿主細胞包括大腸桿菌K12株294(ATCC NO. 31446)，大腸桿菌株 JM101 (Messing 等人，Nucl. Acid Res. ,9 309 (1981))，大腸桿 菌株 B,大腸桿菌株 II1776(ATCC No. 31537)，大腸桿菌株 c600 (Appleyard, Genetics, 39 =440(1954)),大腸桿菌株W3110 (F-、、-、原養(yǎng)型，ATCC編號27325)，大腸桿菌株 27C7 (W3110, tonA, phoA E15, (argF-lac) 169，ptr3, degP41, ompT, kanr)(美國專利 No. 5288931，ATCC No. 55244)，枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌和假單胞菌 jM o除原核生物之外，真核生物如酵母菌，或多細胞生物衍生的細胞可用作宿主細胞。 對于酵母宿主細胞的表達，如普通的面包酵母或釀酒酵母，合適的載體包括基于2微米的 質粒，整合載體和酵母人工染色體(YAC)載體的附加型復制性載體。對于昆蟲宿主細胞的 表達，如Sf9細胞，合適的載體包括桿狀病毒載體。對于植物宿主細胞的表達，特別是雙子 葉植物宿主如煙草，合適的表達載體包括衍生自根瘤農桿菌Ti質粒的載體。然而，最關注脊椎動物宿主細胞。有用的哺乳動物宿主細胞包括受SV40轉化的猴 腎CV1系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(293或為生長于懸浮培養(yǎng)中而亞克隆293 細胞，Graham等人，J. Gen Virol.，36 :59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國 倉鼠卵巢細胞 /-DHFR (CH0, Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980))；小鼠塞托利細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23 :243_251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2)； 犬腎細胞(MDCK，QTCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺 細胞(W138 ATCC CCL 75)；人肝細胞(HepG2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤 _ 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 細胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 44-68 (1982)) ；MRC5 細胞； FS4細胞；以及人肝癌細胞系Ofep G2)。對于哺乳動物宿主細胞表達，有用的載體包括SV40 衍生的載體，巨細胞病毒衍生的載體如PRK載體，包括pRK5和pRK7 (Suva等人，Science, 237:893-896(1987)，EP 307, 247(3/15/89), EP 278776 (8/17/88))，痘苗病毒或其它痘病 毒衍生的載體，以及逆轉錄病毒載體如莫落尼鼠白血病病毒(MoMLV)衍生的載體。任選地，將編碼感興趣干擾素的DNA操作性連接于一分泌性前導序列，導致宿主 細胞將表達產物分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導序列的例子包括stll，ecotin, lamB，皰疹⑶， lpp，堿性磷酸酶，轉化酶，以及a因子。也適用于本文的是蛋白質A的36氨基酸前導序列 (Abrahmsen 等人，EMB0J.，4 3901 (1985))。轉染宿主細胞并優(yōu)選用本發(fā)明上述表達或克隆載體轉化，并在已改進適合于誘導 啟動子，選擇轉化體，或擴增編碼所需序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育。轉染指宿主細胞攝入表達載體，不論編碼序列實際上是否表達。許多轉染方法是 本領域普通技術人員所已知的，例如磷酸鈣沉淀和電穿孔。當表明該載體操縱已在宿主細 胞中發(fā)生時，一般認為轉染成功。轉化指將DNA引入生物體使得DNA可復制(作為染色體外元件或通過染色體整 合)。取決于所用的宿主細胞，采用適合該細胞的標準方法進行轉化。使用氯化鈣作鈣處 理(如 Sambrook 等人，Molecular Cloning (第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory, NY(1989) 1.82節(jié)所述)通常用于含有大量細胞壁屏蔽的原核生物或其他細胞。根瘤農桿 菌感染用于某些植物細胞的轉化，如Shaw等人，Gene, 23 =315(1983)和1989年6月29號 公開的W089/05859所述。對于沒有細胞壁的哺乳細胞，優(yōu)選如Sambrook等人(同上第 16. 30-16. 37節(jié))所述的磷酸鈣沉淀方法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉化的總體方面內容在 Axel的1983年8月16日公布的美國專利4，399，216中有所描述。通常根據(jù)Van Solingen 等人，J. Bact.，130 946 (1977)和 Hsiao 等人，Proc. Natl. Acad. Scia (USA)，76 3829 (1979) 的方法進行酵母轉化。然而，也可采用將DNA引入細胞的其它方法，如核注射，電穿孔，或原 生質體融合。如Sambrook等人(同上)所述，可培養(yǎng)用于產生感興趣干擾素的原核宿主細胞?？捎酶鞣N培養(yǎng)基培養(yǎng)用于產生感興趣干擾素的哺乳動物宿主細胞?？少彽玫呐囵B(yǎng) 基如 Ham，s F10 (Sigma)，Minimal EssentialMedium( (MEM)，Sigma)，RPMI-1640 (Sigma)，和 Dulbecco's Modified Eagle，sMedium( (DMEM)，Sigma)適用于培育宿主細胞。另外，如 Ham 禾口 Wallace，Meth. Enz. ,58 44(1979), Barnes 禾口 Sato，Anal. Biochem.，102 255(1980), U. S. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；或 4，560，655 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ； U. S. Pat. Re 30，985 ；或U. S. 5，122，469所述的任何培養(yǎng)基(所有這些公開內容納入本文參 考文獻中)，可用作宿主細胞的培養(yǎng)基。如需要，這些培養(yǎng)基可補加激素和/或其它生長因 子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽類(如氯化鈉，鈣，鎂，以及磷酸鹽)，緩沖液 (如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如慶大霉素藥物)，微量元素(限于通常以微
37摩爾范圍的最終濃度存在的無機化合物)，以及葡萄糖或等同的能源。也可包括本領域技術 人員所知的適當濃度的任何其他所需補充物。培養(yǎng)條件，如溫度，PH值等等，是那些先前與 所選表達宿主細胞一起使用的，并且對于本領域普通技術人員是清楚的。
本文所提宿主細胞包括體外培養(yǎng)的細胞以及宿主動物體內的細胞。在胞內表達系統(tǒng)或周質間隙分泌系統(tǒng)中，可通過破壞宿主細胞膜/細胞壁(如滲 透休克或用洗滌劑溶解宿主細胞膜)從培養(yǎng)細胞中回收重組表達的干擾素蛋白質。另外， 在胞外分泌系統(tǒng)中，可由培養(yǎng)基中回收重組蛋白質。第一步，離心培養(yǎng)基或裂解液以除去任 何顆粒性細胞碎片。然后分離膜與可溶性蛋白組分。通常從可溶性組分中純化得到干擾素。 如果IFN-α表達為膜結合種類，可用洗滌劑溶解從膜組分中回收膜結合肽。然后用合適的 方法(如免疫親和或離子交換柱上的分級；乙醇沉淀；反相HPLC ；硅土或陽離子交換樹脂 (如DEAE)層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；如使用S印hadexG-75的凝膠過濾；疏 水親和樹脂和使用固定在基質上的干擾素受體的配體親和法)進一步純化該粗肽提取物。本文所用的許多人IFN- α可從商業(yè)來源獲得，如從Sigma (St. Louis, MO)， Calbiochem-Novabiochem Corporation(San Diego, CA)或 ACCURATEChemical & Scientific Corporation (Westbury, NY)獲得。標準的克隆方法如 Maniatis 等人，Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)所述用于構建 質粒，該質粒能指導各種hIFN-α轉位進入大腸桿菌周質空隙中。利用加入到引物中的 NsiI和StyI限制性位點在hIFN- α的不同亞型的cDNA克隆上進行PCR反應(Goeddel等， Nature 290 :20_26 (1981)。然后將這些PCR產物亞克隆入表達載體pB0720的相應位點(如 Cunningham等人，Science243 1330-1336 (1989)所述)。所得的質粒將 h_IFN_ α 亞型的產 生置于大腸桿菌PhoA啟動子和熱穩(wěn)定腸毒素II信號肽的調控下(如Chang等人，Gene55 189-196(1987)所述)。用美國生物化學測序酶試劑盒2. O版本證實每個基因的正確DNA 序列。將各質粒轉化入大腸桿菌株27C7(ATCC # 55244)中并在10升發(fā)酵罐中培養(yǎng)(如 Carter等人，Bio/Technology 10 163-167 (1992)所述)。用親和層析法從含有各個IFN-α 的大腸桿菌糊漿中純化得到人hIFN。裂解細菌，并以10，OOOxg離心裂解液除去碎片。將上 清液加到含有小鼠抗 hIFN-α B 抗體(LI-I)(如 Staehelin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 78 1848-1852(1981)所述獲得)的免疫親和柱上。用 Roy 等人，Journal of Chromatography, 303 =225-228(1984)的改進方法將LI-I固定在可控孔玻璃上。用含20% (W/V)甘油pH為 3. O的0. IM檸檬酸鹽從該柱中洗脫結合的干擾素。純化的IFN用SDS-PAGE和免疫印跡法 分析，和用本文所述的hIFN誘導的抗病毒試驗測試生物活性。如Rehberg 等人，J. Biol. Chem.，257 11497—11502 (1992)或 Horisberger 和 Marco，Pharmac. Ther. ,66 507-534 (1995)所述，獲得了人 IFN-α 2/1 雜合分子 (IFN- α 21_62/ α 64_166)。b. IFN- α 的固定為了用于噬菌體展示克隆的親和層析分離，可將純化的IFN-α吸附于合適的基 質，如瓊脂糖珠，丙烯酰胺珠，玻璃珠，纖維素，多種丙烯酸共聚物，羥基甲基丙烯酸酯凝 膠，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物，尼龍，中性和離子型運載體，等等。用如Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)所述方法可實現(xiàn)IFN-α蛋白質與基質的附著。將蛋白質配體附著在多糖基質(如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素)的常用技術包括用鹵化氰活化運載體并隨 后將肽配體的主要脂肪胺或芳香胺與該活化基質偶聯(lián)。另外，IFN-a可用于包被吸附板孔，表達在固定于吸附板的宿主細胞上或用于細 胞分選，或偶聯(lián)生物素而用于用鏈霉親合素包被的玻璃珠來捕獲，或用于任何其他已知的 淘選噬菌體展示文庫的方法中。c、淘選方法在適合于用吸附劑結合至少一部分噬菌體顆粒的條件下使噬菌體文庫樣品， 與固定的IFN-a接觸。通常，選擇此條件包括pH值，離子強度，溫度等來模擬生理條 件。洗滌結合于固相的噬菌體并用酸(如Barbas等人，Proc.Natl.Acad. Sci USA,88 7978-7982(1991)所述)，或用堿(如Marks 等人，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)所述)， 或用IFN-a抗原(如類似于Clackson等人，Nature，352 =624-628(1991)的抗原競爭法的 方法)洗脫。在一輪選擇中，可富集噬菌體20-1000倍。另外，可將富集的噬菌體培養(yǎng)在細 菌培養(yǎng)物中并進行更多輪選擇。在一個優(yōu)選實施例中，用各種固定的IFN-a亞型連續(xù)地溫育噬菌體以鑒定和進 一步特征分析對大部分(優(yōu)選全部)IFN_a亞型表現(xiàn)出明顯結合的噬菌體克隆。此方法中， 噬菌體先與一特定IFN-a亞型一起溫育。洗脫結合于此亞型的噬菌體并用另一 IFN-a亞 型選擇。對所有IFN-a亞型重復此結合與洗脫過程。最后，該方法獲得了對所有IFN-a 亞型具有廣譜反應活性的噬菌體展示抗體群。除IFN-a外用其它種類IFN檢測這些噬菌 體，以選擇那些對其他種類IFN不顯示明顯結合的克隆。最后，可檢測所選出的噬菌體克隆 中和各種IFN-a亞型的生物活性(如抗病毒活性)的能力，最后選出展現(xiàn)對大部分(優(yōu)選 全部)IFN-a亞型有廣泛中和活性的抗體的克隆。選擇效率依賴許多因素，包括洗滌時的解離動力學，和單個噬菌體上的各個抗體 片段能否同時與抗原結合。具有快速解離動力學(和弱結合親和力)的抗體可用短時洗滌， 多價噬菌體展示和固相中抗原高密度包被來保留。高密度通過多價相互作用不僅能穩(wěn)定噬 菌體，還有利于已解離的噬菌體重結合。用長時間洗滌和單價噬菌體展示(如Bass等人， Proteins, 8 :309_314 (1990)和W092/09690所述)，以及抗原低密度包被(如Marks等人， Biotechnol. ,10 :779_783 (1992)所述)可促進具有慢解離動力學(和良好結合親和力)的 抗體的選擇?？稍趯FN-a具有不同親和力(甚至微弱差別的親和力)的噬菌體抗體之間進 行選擇。然而，所選抗體的隨機突變(如按照上述親和力成熟技術的某些技術進行)可能產 生許多突變體，大部分能結合抗原，且少數(shù)具有高親和力。通過限制IFN-a，可競爭出罕見 的高親和力噬菌體。為了保留所有較高親和力的突變體，可與過量的生物素化IFN-a (但 用低于IFN-a靶摩爾親和力常數(shù)的摩爾濃度的生物素化IFN-a) —起溫育噬菌體。用鏈 霉親合素包被的順磁珠可捕獲高親和力結合性噬菌體。此種“平衡捕捉”使得抗體根據(jù)它 們的結合親和力而被選出，其靈敏度能夠從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只 高2倍的突變克隆。也可操縱用于洗滌結合于固相的噬菌體的條件來根據(jù)解離動力學進行 區(qū)分。在一個實施例中，將噬菌體與固定在固體支撐物(如上述層析聚合物基質)上的 不同IFN-a亞型一起連續(xù)溫育。此方法中，噬菌體先與一特定IFN-a亞型一起溫育。用合適的洗脫液(如能將結合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩沖液)從固相中洗脫結合于 該亞型的噬菌體。然后，將洗脫的噬菌體克隆用另一 IFN-a亞型選擇。為了富集與可溶性 IFNAR2競爭結合IFN-a的克隆群，從一系列IFN_ a亞型層析分離物中回收噬菌體克隆，將 其與預先吸附于IFN-a的固定IFNAR2的復合物一起溫育，然后從溫育反應混合物中回收 未吸附的噬菌體克隆。選擇方法可設計為使用任何合適的批次層析技術。在一個實施例中，使噬菌體克 隆吸附在懸浮的IFN-a衍生聚合物基質珠上。離心回收吸附的珠，以合適的洗脫緩沖液重 懸回收的珠并溫育，合適的洗脫液沖洗是能使結合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩沖 液，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆，然后對于每種其它IFN-a亞型 都重復此吸附/洗脫程序。為了富集能與可溶性IFNAR2競爭性結合IFN-a的克隆群，將 從IFN-a亞型層析分離物回收的噬菌體克隆與預吸附至IFN-a的IFNAR2衍生聚合物基 質珠懸浮液一起溫育，離心溫育混合物，然后從上清液中回收未吸附的噬菌體克隆。在另一實施例中，設計選擇方法來富集在每次親和層析分離中能抑制IFN-a與 IFNAR2結合的噬菌體群落。此方法中，使噬菌體與各種固定在固體支撐物上的特定IFN-a 亞型一起連續(xù)溫育，然后用含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2 E⑶-IgG Fc)的洗脫液，在 可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競爭結合固定化IFN-a的噬菌體克隆的條件下從固相 中洗脫。對每種特定IFN-a亞型重復此結合與洗脫過程。在另一實施例中，使噬菌體克隆吸附于懸浮的IFN-a衍生聚合物基質珠上，離心 回收吸附的珠，以含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2 ECD-IgGFc)的合適的洗脫緩沖液重 懸回收的珠，在可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競爭性結合固定化IFN-a的條件下培 育，使結合的噬菌體釋放到溶液中，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆， 然后對于每種其它IFN- a亞型都重復此吸附/洗脫程序。最后，此法獲得對廣泛IFN- a亞型具有IFNAR2結合抑制活性的噬菌體展示抗體 群。然后可測試這些噬菌體對其它IFN種類(除了 IFN-a種類)如IFN-3的作用，以選 出那些對其他種類IFN不顯示明顯結合的克隆。最后，可測試所選噬菌體克隆中和各種 IFN-a亞型生物活性，如抗病毒活性的能力，最終選出展現(xiàn)對大多數(shù)(優(yōu)選全部)IFN_a亞 型有廣泛中和活性的抗體的克隆?？笽FN-a克隆的活性選擇在一個實施例中，本發(fā)明提供了抗IFN-a抗體，該抗體能結合并中和大多數(shù)(優(yōu) 選全部)IFN-a亞型的活性，但并不明顯結合或中和其他種類干擾素的活性。例如用前述 用于抗體的基本上相同方法，可測試不同噬菌體克隆中和不同IFN-a亞型抗病毒活性的 能力。4、可溶性IFNAR2_IgG的制備采用與Haak-Frendscho 等人，Immunology 79 :594_599 (1993)所述用于構建鼠 IFN受體免疫黏附素的相似方法，可產生基于hIFNAR2胞外域的人免疫球蛋白融合蛋白 (免疫黏附素)的編碼cDNA(pRKS hIFNAR2-IgG克隆)。簡而言之，如W089/02922 (PCT/ US 88/03414，公布于1989年4月6日)實施例4所述構建質粒pRK⑶42FC1。從公開的 序列(Novick 等人，Cell,77 391-400[1994])中獲得成熟 hIFNAR2 ECD 的前 216 個殘 基的cDNA編碼序列。用hIFNAR2 EOT編碼cDNA代替pRK⑶42Fei的⑶4編碼序列以形成pRK5hIFNAR2-IgG克隆。使用磷酸鈣沉淀技術通過瞬時轉染在人胚胎腎293細胞中表 達hIFNAR2-IgG。通過蛋白質A_s印harose凝膠柱親和層析(如Haak_Frendscho等人， (1993)，同上所述)從無血清細胞培養(yǎng)上清液中一步純化此免疫黏附素。用含20% (W/ V)甘油，pH為3. 0的0. 1M檸檬酸鹽緩沖液洗脫結合的hIFNAR2-IgG。根據(jù)SDS-PAGE， hIFNAR2-IgG純化至95%純以上。5、抗IFN-a抗體的診斷應用本發(fā)明的抗IFN-a抗體是IFN-a表達診斷試驗中的獨特研究試劑。如前所述， 在某些自身免疫疾病如IDDM，SLE以及自身免疫性甲狀腺炎中IFN-a表達增加。使用對大 部分IFN-a亞型有廣泛反應活性的本發(fā)明抗IFN-a抗體可檢測并定量測量這些疾病中各 種IFN-a亞型的增加表達。抗IFN-a抗體也用于從重組細胞培養(yǎng)物或天然來源中親和純 化各種IFN-a亞型。在許多眾所周知的診斷試驗方法之任一中可采用抗IFN-a抗體以檢測IFN-a。 例如，從所需來源中獲得樣品，將該樣品與抗IFN-a抗體混合使得該抗體與存在于混合物 中的任何IFN- a亞型形成抗體/IFN- a復合物，并且檢測存在于混合物中的任何抗體/ IFN-a復合物，可測定生物樣品的IFN-a。以本領域已知的適合特定樣品的方法可制備 試驗用的生物樣品。根據(jù)所用試驗的類型選擇將樣品與抗體混合的方法以及檢測抗體/ IFN-a復合物的方法。這種試驗包括競爭和夾心試驗，以及空間抑制試驗。競爭和夾心方 法采用相分離步驟作為該方法的完整部分而空間抑制試驗在單個反應混合物中進行。IFN-a的分析方法都采用1種或多種下列試劑標記IFN_ a的類似物，固定化 IFN-a的類似物，標記的抗IFN-a抗體，固定化抗IFN-a抗體和立體偶聯(lián)物。標記試劑也 稱為“示蹤劑”。所用標記是任何不干擾IFN-a和抗IFN_a抗體結合的可檢測的官能度。用于 免疫試驗的許多標記是已知的，例子包括那些可直接檢測的分子，如熒光色素，化學發(fā)光 劑，和放射性標記以及必須經反應或衍生才能檢測到的分子，如酶。這些標記的例子包 括放射性同位素32P、14C、125I、3H和1311，熒光團如稀土螯合物或熒光素及其衍生物，羅丹明 及其衍生物，丹酰，傘形酮，螢光素酶，如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利NO 4，737，456)，螢光素，2，3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，0 -半孔糖 苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，如葡糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脫氫 酶，雜環(huán)氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與使用過氧化氫氧化染料前體的酶如HRP，乳過 氧化物酶，或微過氧化物酶偶聯(lián)，生物素/親合素，自旋標記，噬菌體標記，穩(wěn)定的的自由
其絕絕
35 寸寸o可用常規(guī)方法將這些標記共價結合于蛋白質或多肽。例如，可用偶聯(lián)劑如二醛， 碳化二亞胺，馬來酰氫亞胺，雙亞氨酸酯，雙重氮化聯(lián)苯胺等以上述熒光、化學發(fā)光和酶標 記對抗體進行標記。如見美國專利NO. 3，940，475 (熒光測定)和3，645，090 (酶)；Hunter 等人，Nature, 144 945(1962) ；David 等人，Biochemistry, 13 1014-1021 (1974) ；Pain 等 人，].Immunol. Methods, 40 :219_230 (1981)；禾口 Nygren, J. Histochem. AndCytochem. ,30 407-412(1982)。本文優(yōu)選的標記是酶，如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。這些標記(包括酶)與抗體的偶聯(lián)是免疫試驗技術普通技術人員的標準操作 方法。如參見 0’ Sullivan 等人，“Methods for the Preparation of Enzyme-antibodyConjugates for Use in Enzyme Immunoassay,，，收編在 Metnods in Enzymology, J. J. Langone 禾口 H. Van Vunakis 編，第 73 卷(AcademicPress, New York, New York, 1981), 147-166 頁。對某些試驗方法需要固定試劑。固定需要將抗IFN-a抗體與溶液中保持游離的 IFN-a相分離。常規(guī)上，在試驗步驟之前不溶解抗IFN-a抗體或IFN_ a類似物而實現(xiàn)這 一分離，如通過吸附于水不溶性基質或表面(Bermich等人，美國專利3，720，460)，通過共 價偶聯(lián)(例如，用戊二醛交聯(lián))，或者后來不溶解抗IFN-a抗體或IFN-a類似物，如免疫沉 淀法。其它的試驗方法，已知為競爭或夾心試驗，已經完善建立并廣泛用于商品化診斷產業(yè)。競爭性試驗依賴示蹤劑IFN-a類似物與測試樣品IFN_ a競爭有限數(shù)量的抗 IFN-a抗體抗原結合位點的能力。通常在競爭之前或/之后不溶解抗IFN-a抗體然后將 結合于抗IFN-a抗體的示蹤劑和IFN-a與未結合的示蹤劑和IFN_ a相分離。通過傾析 (其中結合伴侶為預先不溶解的)或離心(其中結合伴侶在競爭反應之后被沉淀)進行 此分離。試驗樣品IFN-a的量與結合的示蹤劑的量(通過標記物質的量測定)成反比。 用已知數(shù)量的IFN-a制作劑量反應曲線并與試驗結果作比較，以定量測定試驗樣品中的 IFN-a量。當用酶作為可檢測標記時，這些試驗稱為ELISA系統(tǒng)。另一種競爭試驗稱為“均相”試驗，不需要相分離。在此，制備并使用IFN-a與酶 的偶聯(lián)物，這樣當抗IFN-a抗體結合于IFN-a時，所含抗IFN_a抗體調節(jié)了酶活性。此 例中，IFN-a或其免疫活性片段以雙功能有機橋與酶(如過氧化物酶)偶聯(lián)。用抗IFN-a 抗體選擇所用的偶聯(lián)物，使得抗IFN-a抗體的結合抑制或加強了標記酶的活性。此方法本 身以EMIT命名而廣泛使用。立體偶聯(lián)物用于均相試驗的空間位阻方法中。將低分子量的半抗原與小IFN-a 片段共價連接合成這些偶聯(lián)物使得抗半抗原的抗體基本上不能與抗IFN-a抗體同一時間 結合此偶聯(lián)物。在此試驗方法下，試驗樣品中所含IFN-a將結合抗IFN-a抗體，從而使 抗_半抗原抗體與此偶聯(lián)物結合，導致偶聯(lián)物半抗原的特性改變，如，當半抗原是熒光團時 發(fā)生熒光改變。夾心試驗尤其適用于IFN-a或抗IFN_ a抗體的測定。順序夾心試驗中，使用固 定的抗IFN-a抗體吸附試驗樣品的IFN-a，通過洗滌除去試驗樣品，用結合的IFN-a吸附 第二個標記的抗IFN-a抗體，然后將殘余的示蹤劑與結合物質相分離。結合的示蹤劑量與 試驗樣品的IFN-a量成正比。在“同時”夾心試驗中，試驗樣品在加入標記的抗IFN-a之 前不分離。用抗IFN-a單克隆抗體作為一種抗體，多克隆抗IFN-a抗體作為另一種抗體 的順序夾心試驗可用于測試樣品的IFN-a。前文只是IFN- a的示范性診斷試驗。現(xiàn)在或以后開發(fā)的采用抗IFN_ a抗體測定 IFN-a的其他方法，也包括在本文范圍之內，包括上述的生物試驗法。6、治療組合物與抗IFN-a抗體的給藥將具有所需純度的抗體與任選的生理上可接受的運載體，賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Alfoson, R.編，Mack Publishing Co. (Easton, PA 1995))混合制備本發(fā)明的抗IFN-a抗體治療制劑以凍干餅或水溶液形式貯存?？山邮艿倪\載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對受者無毒性， 且包括緩沖液，如磷酸鹽，檸檬酸鹽，以及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量 (少于約10個殘基)多肽，蛋白質，如血清清蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖以及其 它糖類包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離 子如鈉；和/或非離子表面活性劑如Tween，Pluronics或聚乙二醇(PEG)。用于體內給藥的抗IFN-a抗體必須是無菌的。在凍干和重建之前或之后，通過無 菌過濾膜過濾不難實現(xiàn)這一要求。通?？笽FN-a抗體以凍干形式或溶液貯存。通常將治療性抗IFN-a抗體組合物置于帶無菌入口的容器中，例如帶有可被皮 下注射針刺穿的塞子的靜脈輸液袋或小管中。根據(jù)已知方法進行抗IFN-a抗體的給藥，如靜脈內、腹膜內、腦內、皮下、肌肉內、 眼內、動脈內、腦脊髓內或病灶內途徑注射或灌注，或如下所述的緩釋系統(tǒng)?？贵w優(yōu)選是全 身給藥的。緩釋制品的合適例子包括以有形物品形式如薄膜，或微膠囊的半滲透性聚合物基 質。緩釋基質包括聚酯，水凝膠，聚交酯(美國專利3，773，919，EP 58，481)，L-谷氨酸和 L-谷氨酸Y乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22 :547_556 (1983)，聚(甲基丙烯 酸 2-羥基乙酯(Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res.，15 167-277 (1981)和 Langer. Chem Tech. 12 =98-105,1982)，乙烯-乙酸乙烯(Langer 等人，同上)或聚-D-(-) -3 羥丁酸(EP 133,988)。緩釋抗IFNAR2抗體組合物也包括脂質體包裹的抗體。按已知方法(DE3218121 ； Epstein 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 3688-3692,1985 ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 :4030-4034,1980 ；EP 52，322 ；EP36, 676 ；EP88, 046 ；EP143, 949 ；EP142,641 ； 曰本專利申請83-118008 ；美國4，485，045和4，544，545，以及EP102，324)制備含抗體的脂 質體。通常脂質體是小的(約200-800埃)單層類型，其中脂類含量大于約30mol%的膽固 醇，為獲得最適抗體療法調整所選比例?？笽FN-a抗體也可通過吸入給藥。用于液體制劑的商品化霧化器(包括噴射霧 化器和超聲霧化器)可用于給藥。液體制劑可直接霧化，而凍干粉末可在重建后霧化。另 外，抗IFN-a抗體用氟碳配方和計量劑量吸入器氣溶膠化，或作為凍干和碾磨粉吸入。治療上所用的抗IFN-a抗體的“有效量”將取決于例如治療對象、給藥途徑、所用 抗IFN-a抗體的類型，以及患者狀況。因此，治療學家必需滴定劑量并按需修改給藥途徑 以獲得最佳治療效果。通常，臨床醫(yī)生將給予抗IFN-a抗體直到獲得所需效果的劑量。用 常規(guī)試驗不難監(jiān)控該治療過程。用本發(fā)明抗IFN-a抗體治療的患者包括臨床前患者或那些最近發(fā)作免疫介導疾 病，尤其是自身免疫性疾病的患者?；颊呤潜景l(fā)明治療對象，直到沒有健康組織需要受保護 避免免疫介導的破壞。例如，患胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的患者可從用本發(fā)明抗IFN-a 抗體的治療中得益，直到患者的胰島細胞不再有活力。在免疫介導的或自身免疫性疾病的 發(fā)展過程中，需要盡可能早的給予抗IFN-a抗體，并且要持續(xù)治療只要必須保護健康組織 不受患者免疫系統(tǒng)的破壞。例如，治療IDDM患者直到胰島素監(jiān)測顯示有充分的胰島應答和 胰島壞死減少的其它跡象(如抗_胰島-抗體滴度降低)，之后患者可撤銷抗IFN-a抗體 治療一段試驗時間，監(jiān)測此期間內胰島素反應和抗胰島抗體的水平有無復發(fā)。
在用抗IFN-a抗體治療與預防免疫介導的或自身免疫性疾病中，以復合優(yōu)良藥 物規(guī)范的方式制備此抗體組合物，確定劑量并給藥。上文所考慮因素包括待治療的具體疾 病、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、患病原因、抗體輸送的部位、抗體的具體 類型、給藥方法、給藥時間表，以及醫(yī)生已知的其他因素。待給予的抗體的“治療有效量”將 視這些因素而定，而且是預防，緩解或治療此病(包括治療慢性自身免疫性疾病和移植物 受者中維持免疫抑制)所必需的最小量。此量宜低于對宿主有毒或使宿主對感染顯著易感 的量。作為一般建議，腸胃道外給予該抗體的初步藥學有效量范圍是每天病人體重每公 斤約0. l-50mg,典型的初步抗體劑量范圍是0. 3-20mg/kg/天，更佳是0. 3_15mg/kg/天。所 需的劑量可通過抗體的單次推注給藥，多次推注給藥或連續(xù)輸注給藥來輸遞，取決于醫(yī)師 希望達到的藥物動力學衰減模式。如上所指，這些抗體的建議量應經過大量的治療性斟酌。如上所示，選擇適當劑量 與時間表的關鍵因素是所獲結果。此抗體不需要，但任選地可與當前用于預防或治療所示免疫介導的或自身免疫性 疾病的一種或多種制劑一起配制。例如，對于類風濕性關節(jié)炎，此抗體可與糖皮質類固醇聯(lián) 合給予。這些其他制劑的有效量取決于配方所含抗IFN-a抗體的量，疾病或治療類型，以 及上述的其它因素。這些制劑通常以相同劑量和前述給藥途徑或以上所用劑量的1-99%使用。以下實例中可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的更多細節(jié)，進一步明確了本發(fā)明的范圍。此說明書所 引用的所有參考文獻及其中所引用的參考文獻都在這里完整引入以作參考。
實施例提供以下實例來闡明而不限制。提供實例的目的是為了向本領域的普通技術人員 提供如何制備和應用本發(fā)明的化合物，組合物，及方法，而無意限制發(fā)明者所認為的發(fā)明范 圍。已作出努力確保所用數(shù)字的準確度(如，數(shù)量，溫度，等)，但是應該說明有一些實驗性 誤差和偏差。除另有注明，分是重量等分，溫度是攝式度，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。在 說明書中所有引用的公開內容納入本文作為參考文獻引用。實施例1廣泛反應活性的小鼠抗IFN-a單克隆抗體的產生和特性鑒定材料與方法對IFN-a諸亞型具有廣泛反應性的鼠單克隆抗體用人IFN- a諸亞型的混合物順次免疫接種小鼠產生大量候選mAbs，然 后篩選其結合能力和活性，從而開發(fā)了泛-IFN-a中和性抗體。特別地，用重懸在 MPL-TDM(Ribi Immunochemical Research, Inc. ，Hamilton, MT)巾白勺 2. 5 :g
hIFN-a (Product No. 1-9887 of Sigma, St. Louis, M0)免疫接種 Balb/c 小鼠各后腿足墊 9 次(間隔兩周)。最后一次加強注射后第三天，用35%聚乙二醇將胭窩淋巴結細胞與鼠類 骨髓瘤細胞P3X63Ag 8. U. 1 (ATCC CRL1597)融合。在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤。融合后第 十天，在ELISA中先篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液與不同種類hIFN-a結合的mAbs。如下所述，測 試了所選雜交瘤培養(yǎng)上清液抑制IFN對人肺癌細胞系A549細胞的抗病毒細胞病變效應的 能力。如圖1所示，從1794個融合孔中獲得的3個mAbs能中和一組多種IFN-a亞型。亞
44克隆并重分析這三個mAbs。中和IFN-a的抗病毒活性如Yousefi，S.，等人，Am. J. Clin. Pathol. ,83 :735_740 (1985)所述測試 了候選 抗體中和IFN-a的抗病毒活性的能力。簡而言之，用受腦心肌炎(EMC)病毒攻擊的人肺 癌A549細胞進行了該試驗。以100 1的總體積將mAb的系列稀釋液與各種單位的I型 干擾素一起溫育37°C 1小時。然后以100 1的細胞培養(yǎng)基將這些混合物與5X105個 A549細胞一起溫育24小時。然后用2X105pfu的EMC病毒攻擊細胞24小時。在溫育后， 用可見光顯微鏡檢查或結晶紫染色測定細胞活力。中和性抗體滴定度(EC50)定義為能中 和100單位/ml的I型IFN 50%的抗病毒細胞病變作用的抗體濃度。用NIH參考品重組 人IFN-a 2為標準品測定本研究中所用I型IFN的單位。所測的各種I型IFN的比活性如 下IFN- a 2/ a 1 (IFN- a 2 殘基 1-62/- a 1 殘基 64-166 (2 X 107IU/mg)，IFN- a 1 (3 X 107IU/ mg)，IFN- a 2 (2 X 107IU/mg)，IFN- a 5 (8 X 107IU/mg)，IFN- a 8 (19 X 107IU/mg)，以 及 IFN- a 10 (1. 5X 105IU/mg)。所測的白細胞 IFN 是 Sigma 產品 No. 1-2396。所測 的類淋巴母細胞IFN是NIH參考標準品Ga23_901-532。在申請人請求下，在Access Biomedical (SanDiego, CA)進行的實驗中使用上述試驗方式獲得圖3B所示數(shù)據(jù)。電泳遷移變動實驗IFN的大多數(shù)立即作用與潛伏性胞質信號轉導劑和轉錄激活(STAT)蛋白的激活 相聯(lián)系，產生多蛋白復合體，干擾素刺激的基因因子3(ISGF-3)，其誘發(fā)靶啟動子干擾素刺 激應答元件(ISRE)的轉錄。ISGF3包含3個蛋白質亞基STAT1，STAT2和p48/ISGF3 y。 P48蛋白質屬于干擾素調節(jié)因子(IRF)家族，且是直接與ISRE互相作用的DNA結合蛋白質。 這樣，監(jiān)測IFN治療反應中的ISRE特異性細胞DNA結合復合體提供了評價IFN對靶細胞作 用的簡單，快捷而方便的方法。進行這種分析的方便形式之一是電泳遷移變動試驗(EMSA)， 其中IFN治療所誘發(fā)的ISRE結合活性，導致了相應于ISRE的共同序列的放射標記的雙鏈 寡酸苷酸探針的電泳遷移率變動?；旧先鏚urabayashi 等人，Mol. Cell Biol.，15 6386(1995)所述進行了該試 驗。簡而言之，將5ng的特定IFN-a亞型加上不同濃度(5-100 y g/ml的抗IFN-a mAb在 37°C下與5X105個Hela細胞在200iiL的DMEM中溫育30分鐘。加入hIFN-a前將細胞與 抗體4°C預溫育15分鐘。在PBS中洗滌細胞并懸于125iiL緩沖液A中(10mM HEPES PH7. 9， 10mM KC1，0. ImM ETDA，ImMDTT，ImM 苯甲基磺酰氟，10 ii g/ml 亮抑蛋白酶肽，10 ii g/ml 抑蛋 白酶肽)。在冰上培育15分鐘后，加入0.025% NP40裂解細胞。通過離心獲得核沉淀，懸 于 50 微升緩沖液 B(20mM HEPES, pH7. 9,400mM NaCl,0. ImM EDTA, ImM DTT，lmM 苯甲基磺 酰氟、10微克/毫升亮抑蛋白酶酞、10微克/毫升抑蛋白酶肽)中，并保持在冰上30分鐘。 離心澄清核組分并在70°C下保存上清液直至使用。利用DNA聚合酶I Klenow填充反應用 32P-dATP (3000Ci/mM, Amersham)由單鏈寡酸苷酸(ISG 15 頂部5，-GATCGGGAAAGGGAAACCG AAACTGAAGCC-3，[SEQ ID NO. 13]，ISG15 底部，5，-GATCGGCTTCAGTTTCGGTTTCCCTTTCCC-3，[ SEQ IDN0. 14])制得雙鏈探針。使用BlO-Spin 30柱(Bio-Rad)從未摻入放射性核苷酸 中提純標記的寡核苷酸。室溫下培養(yǎng)結合反應液(在15yL結合緩沖液(lOmMTris-HCl， pH7. 5,50mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT，ImM苯甲基磺酰氟和15%甘油)中含有5yL核提取 物，25000cpm標記探針和2ii g非特異性競爭物聚(dl-dC)-聚(dI_dC)) 30分鐘。將DNA-蛋
45白質復合體在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中解析并用作放射自顯影圖分析。在單獨反應混 合物中加入350ng的未標記ISG15探針測定試驗的特異性。用抗STAT1抗體以超變動試驗 證實ISGF3特異復合體的形成?？寺【幋a9F3抗IFN- a單克隆抗體的基因產生、克隆并測序鼠抗人IFN-amAb 9F3。用于大腸桿菌中的F (ab) s表達與誘變 的質粒pEMXI 先前已有描述(Werther 等人，J. Immunol. 157 :4986_4995 [1996])。簡單而言， 此質粒含有編碼共有的人K亞組1輕鏈(VLK1-CL)和共有的人亞組III重鏈(VHIII-CH1) 的DNA片段和堿性磷酸酶啟動子。采用VL和VH的共有序列先前已有描述(Carter等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 =4285-4289[1992])。MM我們前已經表明IDDM患者的胰島表達了廣譜的IFN- a亞型(Huang等人， Diabetes 44 :658_664 [1995])。我們也闡述了在IDDM和IFN-3或IFN-Y的表達之間沒 有明顯關系(Huang等人，[1995]同上)。雖然特定IFN-a亞型的表達作為SLE病理學的 一部分還沒有被確定，對于IDDM，是與IFN-a相關，而不與IFN-0或IFN-Y相關(Hooks， 等人，Arthritis & Rheumatism 25 396-400[1982] ；Kim 等人，Clin. Exp. Immunol. 70 562-569 [1987] ；Lacki 等，J. Med. 28 :99_107 [1997] ；Robak 等人，Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis 46 :375_380[1998] ；Shiozawa等，Archritis & Rheumatism 35 417-422[1992] ；von Wussow 等人，Rheumatology International 8 :225_230 [1988])。 這些觀察使得我們提出對于IDDM或SLE的治療干預需要候選抗體能中和大多數(shù)的IFN-a 亞型而同時保留其它干擾素(日，Y和(0)和白細胞介素的完整活性，該活性是宿主防御所 需要的。它們之一(9F3)能夠中和廣譜重組干擾素-a亞型并進一步作了特征鑒定。如圖 2所示，9F3能中和7種重組干擾素(IFN- a -2，4，5，8和10 (圖2)和IFN- a 1以及21 (表 2和圖6)的抗病毒活性。這些IFN-a亞型包括如I型干擾素序列系統(tǒng)樹圖闡明的全譜序 列。更重要的是，能中和IFN-a諸亞型的9F3 mAb不能中和IFN_3 (圖2，表2)或IFN-Y。 如圖2所示IFN-0活性的略微增加在其他試驗中不可再現(xiàn)，看起來這是試驗誤差的結果。已經開發(fā)了其它中和 IFN-a 的 mAb (Tsukui et al. , Microbiol. Immunol. 30 1129-1139[1986] ；Berg, J. Interferon Res.4 481-491 [1984] ；Meager and Berg, J.Interferon Res. 6 729-736[1986]；美國專利 No. 4，902，618 ；及 EP 公開 No. 0, 139,676B1)0然而，這些抗體只中和有限數(shù)目的重組IFN-a亞型，不能中和廣譜 IFN-a亞型，如那些由活化白細胞產生的IFN-a亞型。相反，9F3mAb能中和活化白細胞產 生的IFNa亞型異質性混合物的至少95%抗病毒活性(圖3A)。類似地，9F3mAb也能阻斷 另一類淋巴母細胞IFN制品(NIH參考標準)的抗病毒活性，如在另一試驗中所測得的那樣 (圖 3B)。采用另一種生物試驗法也可測定9F3mAb中和IFN- a的能力。該試驗根據(jù)在DNA 結合試驗即電泳遷移率變動試驗中IFN-a激活信號分子，干擾素刺激基因因子3(ISGF3) 與衍生自干擾素刺激應答元件(ISRE)的寡核苷酸結合的能力(Horvath et al. , Genes Dev.9 :984-994[1995])。I型干擾素信號向細胞核的轉導依靠蛋白復合體ISGF3的激活，包 括兩個信號轉導物及轉錄活化物(STAT)蛋白，STAT1和STAT2，以及干擾素調節(jié)因子(IRF)蛋白，P48/ISGF3 y (Wathelet et al. ,Mol. Cell 1 :507_518[1998])。后者是 ISGF3 的 DNA 序列識別亞基且直接與 ISRE 相互作用(McKendry et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 11455-11459[1991] John et al.，Mol. Cell. Biol. 11 :4189_4195[1991])。用 IFN-a 或 IFN-0處理COS細胞，導致相應于ISGF3與ISRE衍生探針結合的復合體的出現(xiàn)。9F3 mAb 阻斷了 IFN-a誘導的而不是IFN-3誘導的復合體的出現(xiàn)(圖4)。另外，9F3mAb能中和該 試驗中所測試的6種重組IFN- a亞型的活性(表2)。表2mAb 9F3對I型IFN誘導ISGF3形成的抑制作用
mAbIFN- a 2/1IFN- a 1IFN- a 2IFN- a 5IFN- a 8IFN-a 21IFN-09F3. 18. 5++++++++++++++++IgGl 9F3對IFN誘導的復合體的抑制作用程度如表中所示_表示誘導條帶沒有改變； +表示誘導條帶部分丟失而+++表示誘導條帶被大部分消除。所用mAb為lOyg/ml，所用 IFN- a 為 25ng/ml。已建立了 9F3能中和廣泛種類的重組IFN- a亞型及活化白細胞產生的IFN- a亞 型的混和物，我們克隆并測序了編碼9F3 mAb重和輕鏈的cDNA。提純重和輕鏈而所衍生的 N末端氨基酸用于設計對應于N末端的簡并5’引物，而對應于小鼠K輕鏈和IgG2重鏈的 恒定結構域設計3’引物。用常規(guī)PCR技術克隆對應cDNA并測定嵌入的核苷酸序列。圖5 顯示了鼠類9F3單克隆抗體VL(5A)和VH(5B)，人源化版本(V13)以及人重鏈III亞組和 人K輕鏈III亞組的共有序列的序列比對。為確保所克隆的cDNA編碼了反映9F3 mb特異 性與特性的正確Mab，使用如圖5所示的小鼠cDNA序列和人CH1結構域生成了重組嵌合蛋 白。所得嵌合體(CH8-2)能完全中和多種重組IFN-a亞型(圖6)。然后用重和輕鏈的氨 基酸序列生成人源化抗體。實施例2 9F3泛_IFN_ a中和性單克隆抗體的人源化材料與方法人源化F(ab)s的構建為了構建人源化9F3的第一個F(ab)變體，在pEMXl的含脫氧尿苷的模板上進行 定點誘變(Kunkel,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488_492[1985])。將 6 個 CDR 改為鼠 9F3 序列(圖5)，每個CDR中所包含的殘基來自于基于序列的CDR定義(Kabat等人(1991)見上 文)。因此F-1由具有6個完整鼠⑶R序列的完整人框架(VLK亞組1和VH亞組III)組成。 從F-1的質粒模板構建了所有其它F(ab)變體的質粒。用商品化試劑盒(Qiagen，Valencia， CA)將質粒轉化入大腸桿菌株XL-1 Blue中(Stratagene，San Diego，CA)，用于制備雙鏈和 單鏈 DNA。用雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sequenase,U. S. Biochemical Corp. , Cleveland, OH) 對每個變體編碼輕鏈和重鏈的DNA完全試序。將質粒轉化入大腸桿菌株16C9(MM294的衍 生物)中，接種在含有50 u g/ml羧芐青霉素的Luria肉湯平板上，并選擇單個菌落以表達 蛋白質。37°C下，單菌落培養(yǎng)在5ml Luria肉湯-100 ii g/ml羧芐青霉素中5-8小時。將這5ml培養(yǎng)物加入到500ml含有50 u g/ml羧芐青霉素的AP5培養(yǎng)基中并在4L帶擋板搖瓶中 37°C培養(yǎng)20小時。AP5培養(yǎng)基含有1.5g葡萄糖，ll.Og Hycase SF，0. 6g酵母提取物(檢 定的)，0. 19 克 MgS04(無水的)，1.07g NH4C1，3. 73g KCl，1.2g NaCl，120ml 1M三乙醇胺， pH7. 4加到1L水中，然后用0. liiM Sealkeen過濾器過濾除菌。在1L離心瓶中以3000 X g 離心收獲細胞并除去上清液。凍結1小時之后，將沉淀重懸于25ml冷的10mM Tris-lmM EDTA-20%蔗糖，pH7. 5 中，加入 250 u L 的 0. 1M 苯甲酰胺(Sigma, St. Louis, M0)抑制蛋白 水解。冰上緩慢攪拌3小時后，以40000xg離心樣品15分鐘。然后將上清液加到已用10mM Tris-lmM EDTA，pH7. 5 平衡的蛋白 G-S印harose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden)柱中 (柱床體積0. 5ml)。用10ml 10mM Tris-lmM EDTA，pH7. 5洗滌此柱并用3ml 0. 3M甘氨酸， pH3. 0 洗脫到 1. 25ml 1M Tris, pH8. 0 中。然后用 Centricon-30 (Amicon，Beverly, MA)將 F(ab)的緩沖液更換為PBS并濃縮到0. 5ml的最終體積。所有F(ab) s跑SDS-PAGE電泳膠 以確定純度，并用電噴射質譜法驗證各變體的分子量。用定量氨基酸分析測定F(ab)濃度。嵌合性與人源化IgG的構建為了產生嵌合性和人源化9F3的人IgG2版本，將合適的鼠或人源化的VL和 VH(F-13，表3)結構域亞克隆入分開的前述pRK載體中(Eaton et al.，Biochemistry 25: 8343-8347 [1986])，該載體含有編碼人IgG2 CHl_Fc或人輕鏈CL結構域的DNA。用雙脫氧 核苷酸測序法驗證編碼各變體的完整輕鏈和完整重鏈的DNA。嵌合性IgG含有與人CH1結 構域氨基酸SerH113融合的完整鼠9F3VH結構域，和與人CL結構域氨基酸LysL107融合的 完整鼠9F3VL結構域。采用高效方法(Gormanet al.，DNA Prot. Eng. Tech. 2 :3_10 [1990])將重鏈和 輕鏈質粒共轉染入腺病毒轉化的人胚腎細胞系293中(Graham et al.，J. Gen. Virol. 36 59-74[1977])。將培養(yǎng)液改為無血清培養(yǎng)液，每日收獲至5天。用蛋白A-S印harose CL-4B (Pharmacia)從合并的上清液中提純抗體。用Centricon-30 (Amicon)將洗脫抗體的 緩沖液換為PBS，濃縮至0. 5ml，用Millex-GV(Millipore，Bedford, MA)除菌過濾并在4°C 下保存。用定量氨基酸分析測定IgG2濃度。IFN- a結合試驗在ELISA中，在各孔中加入50iiL PBS配的0. liig/ml IFN_a包被96孔微量 滴定板(Nimc)4°C培養(yǎng)過夜。然后用洗滌緩沖液(PBS加0.05% Tween20)洗板三次。用 200 ill SuperBlock (Pierce)封閉微量滴定板諸孔室溫溫育1小時。用洗滌緩沖液再洗板 三次。洗滌后，在所選孔中加入100 iU起始于10 y g/ml人源化mAb的系列稀釋液。在振 搖器上室溫溫育滴定板1小時，并用洗滌緩沖液洗三次。接著，將100 yL與山羊抗人Fab 特異性抗體(Cappel)偶聯(lián)的辣根過氧化物酶以試驗緩沖液(溶于PBS中的0.5%牛血清 白蛋白，0.05% Tween20)作1 1000稀釋，加入到各孔中。室溫振搖器上溫育滴定板，然 后用洗滌緩沖液洗三次，然后在各孔中加入100 yl底物(TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺； Kirkegaard & Perry)室溫溫育10分鐘。各孔中加入100 u L終止液(購自Kirkegaard & Perry)終止反應，在自動微量滴定板讀數(shù)器中讀取450nm處吸光值。BIA core 生物傳感器試驗用 BIA core 生物傳感器(Karlsson et al. , Methods :A companion toMethods in Enzymology 6 :97_108 [1994])測定了 IFN-a 與人源化 F (ab) s，嵌合性和人源化 IgG2
48抗體的結合。將IFN- a以pH6. 3，50mM MES緩沖液配的IFN- a 60 u g/ml固定在傳感芯片 上。使抗體以磷酸鹽緩沖鹽水Tween-20配的抗體75 u g/ml (500nM)接觸芯片。測定 抗體的結合速率(on-rate) (kon)。
鼠和人源化F (ab) s的計算機圖解模型 用VL和VH結構域(圖5A和B)序列構建了鼠9F3 VL-VH結構域的計算機圖解模 型(圖7)。用此模型確定哪個框架殘基應該摻入到人源化抗體中。還構建了人源化F(ab) 模型以驗證鼠框架殘基的正確選擇。如前所述(Carter etal.，[1992]見上文；Werther et al.，[1996]見上文)構建了這些模型。MM將人重鏈亞型III和輕鏈亞型I的共有序列用作圖5所示的人源化框架(Kabat et al.，(1991)見上文)。此框架已成功用于其它鼠抗體的人源化(Carter etal.，Proc.Natl. Acad. Sci.USA 89 :4285_4289[1992] ；Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623_2632[1993]； Eigenbrot et al. , Proteins 18 :49_62[1994] ；Werther et al. , J. Immunol. 157 4986-4995 [1996])。先制備所有人源化變體并篩選在大腸桿菌中表達的F(ab) s的結合。 500ml搖瓶中通常得率為0. 1-0. 4mg F(ab)。已根據(jù)序列高變性(Kabat et al.，(1991)見上文)或F (ab)-抗原復合體的晶體 結構(Chothia et al.，Nature 342 :877_883[1989])明確了互補決定區(qū)(CDR)殘基。雖然 以序列為基礎的CDR大于以結構為基礎的CDR，這兩種限定(范圍)除了 CDR-H1外通常是 一致的。根據(jù)以序列為基礎的限定范圍，CDR-H1包括殘基H31-H35，而以結構為基礎的限定 范圍是CDR-H1的殘基為H26-H32 (輕鏈殘基以L為前綴，重鏈殘基以H為前綴)。對于本研 究，⑶R-H1的限定范圍是此二者的結合，即，包括殘基H26-H35。用以序列為基礎的限定范 圍來確定其它CDR (Kabat et al.，(1991)見上文)。在最初的變體F-1中，從小鼠抗體的CDR殘基轉移到人框架。另外，生成含有帶 F-1輕鏈(Ch-1)的嵌合重鏈和帶嵌合輕鏈(Ch-2)的F-1重鏈組成的F(ab)s并試驗結合能 力。F-1與IFN-a結合極差(表3)。對Ch-1和Ch_2結合親和力的比較(表3)表明需要 改變F-1 VH結構域中的框架殘基以增強結合。表3 a鼠殘基為粗體字；殘基編號方式根據(jù)Kabat等人(1991)。標準字體標明了由人 框架殘基到小鼠的變化。斜體字標明了由小鼠框架殘基到人的變化。用ELISA測試Fab與 IFN-a的結合，結果以10iig/ml 0D450mm提供。SD，標準偏差；n，實驗重復次數(shù)。先前的人源化過程(Xianget al.，J. Mol.Biol. 253 :385_390 [1995] ；fferther et al.，[1996]見上文)與F(ab)_抗原晶體結構的研究(Chothia et al.，[1989]見上文； Tramontano et al. ,J. Mol.Biol. 215 175-182 [1990])已顯示 了殘基 H71 和 H73 能對結合 產生深度影響(可能通過影響⑶R-H1和⑶R-H2的構型)。將H71和H73位置的人殘基改 變成其小鼠對應物僅僅微弱改善結合(版本F-2，表3)。在位置H67，H69和H78 (版本F-3) 的更多的同時改變以及隨后ArgH94Ser (版本F-4)和AlaH24Thr (版本F-5)的改變顯著改 善了結合(表3)。由于位置H67，H69和H78已經同時改變，每個各自變回人共有序列框架 殘基；版本F-7，F(xiàn)-8，F(xiàn)-9和F-10顯示位置H67人殘基是優(yōu)選的，位置H69并未顯示對鼠或人殘基有任何偏愛，而位置H78優(yōu)選鼠殘基。 在之前的人源化過程中，我們已發(fā)現(xiàn)緊鄰⑶R-H1和⑶R-H2的框架環(huán)，F(xiàn)R3 (Kabat et al.，(1991)見上文)內的殘基能影響結合(Eigenbrot et al.，(1994)見上文)。因此， 將此環(huán)中的兩個殘基改變?yōu)樗鼈兊氖髮镔嚢彼酘75變?yōu)樾∈蟮慕z氨酸(版本F-11) 和天冬酰胺H76變?yōu)槭缶彼?版本F-12)。只有天冬酰胺H76變成精氨酸提高了結合(表 3)。檢驗鼠和人源化F(ab) s的模型，表明了掩蔽在VL_VH界面并與⑶R-H3互相作用 的殘基L46也可能對CDR-H3構象的決定和/或VL與VH結構域間的互相作用的影響起作 用。類似地，緊鄰于⑶R-L2的L49位置在人共有序列(酪氨酸)和9F3 (絲氨酸)序列之 間不同。因此，同時取代亮氨酸L46纈氨酸和酪氨酸L49絲氨酸殘基，產生了具有更進一步 改善的結合(表3)的變體(F-13)。根據(jù)所有產生的變體中的最佳結合，選擇F-13作為最 終人源化版本。將衍生于F-13的VH和VL結構域分別與人IgG2 CHl-Fc和人CL結構域融合，產 生了人源化重組抗IFN-a單克隆抗體(V13IgG2)。然后將V13IgG2的Kon速率和KD值與 嵌合性IgG2或鼠9F3相比較。V13IgG2和嵌合性IgG2結合于固定化IFN-a的BIACore 測定顯示它們的1( 速率相似(表4)。采用Kinexa 技術的親和力測量表明，與親本鼠9F3 抗體相比，V13IgG2對IFNa的親和力降低了 2倍(表4)。表 4 a. V13IgG2是與人IgG2 CHl_Fc相連的F_13 VH結構域和與人CL結構域相連的 F-13 VL結構域；ChIgG2是與人IgG2 CHl_Fc相連的鼠9F3 VH結構域和與人CL結構域相 連的鼠9F3 VL結構域。bKoff/Kon。材料的保藏以下材料已存放在美國典型培養(yǎng)物保藏所(10801 University Blvd.，Manassas， VA 20110-2209，USA(ATCC))
MMATCC保藏號保藏日期
1、分泌9F3鼠抗-IFN-aPTA-29172001年1月18日
單克隆抗體的雜交瘤細胞系
(Id. Ref. :9F3. 18. 5)
2、表達嵌合性CH8-2全長PTA-28832001年1月9日
IgG的重鏈的pRK基礎載體
(Id. Ref. :XAIFN-ChHpDR2)
3、表達嵌合性CH8-2全長PTA-28802001年1月9日
IgG的輕鏈的pRK基礎載體
(Id. Ref. :XAIFN-ChLpDRl)
4、表達人源化V13全長PTA-28812001年1月9日
IgG2重鏈的pRK基礎載體
(Id. Ref. :VHV30-IgG2)
5、表達人源化V13全長PTA-28822001年1月9日
IgG2輕鏈的pRK基礎載體
(Id. Ref. :VLV30-IgG)
根據(jù)關于國際承認用于專利程序的微生物保肩変的布達佩斯條約及其實施細則的
條款進行此保藏。自保藏之日起，保證所保藏的活培養(yǎng)物維持30年。保藏物在布達佩斯條 約條款下由ATCC可獲得并遵循Genentech公司和ATCC之間的協(xié)定，其保證相關美國專利 授權或者任何美國或外國專利申請公開(無論哪個先來)后，該保藏物培養(yǎng)產生的后代公 眾可永久和不受限制的得到，并保證對美國專利商標委員會根據(jù)35U. S. C § 122和該委員 會規(guī)則包括37C. F. R § 1. 14具體參考886 0G 638所確定的人可得到該保藏物后代。本申請受托人同意如果保藏的材料培養(yǎng)物在合適的條件下培養(yǎng)時死亡或損失或 遭受破壞，將立即用另一相同材料替換此材料?？色@得該保藏材料并不構成許可實施本發(fā) 明，那樣做就違反了政府當局根據(jù)其專利法所授予的權利。認為先前所寫的說明書足以使本領域技術人員實施本發(fā)明。因為本文的保存實施 例的目的是闡述本發(fā)明的某些方面，任何功能上相同的構建物都在本發(fā)明的范圍之內，所 以本發(fā)明并不限于該保藏的構建物所限定的范圍。本文材料的保藏并不構成承認本文中的 描述不足以使本發(fā)明任何方面得以實施，包括其最佳形式，也不構成將權利要求的范圍限 制在本說明書所描述的范圍內。本領域技術人員會懂得除了本文所顯示和描述的內容外， 可根據(jù)以上描述對本發(fā)明作各種修改，這些都落在附屬權利要求書的范圍內。
權利要求
一種抗IFN-α單克隆抗體，該抗體與至少IFN-α亞型IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10和IFN-α21結合并中和其生物活性。
2.如權利要求1所述的抗體，該抗體為鼠抗體。
3.如權利要求1所述的抗體，該抗體為人源化抗體。
4.如權利要求1所述的抗體，該抗體為人抗體。
5.如權利要求1所述的抗體，其中所述生物活性為抗病毒活性。
6.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少70%的抗 病毒活性。
7.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少80%的抗病毒活性。
8.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少90%的抗病毒活性。
9.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少99%的抗病毒活性。
10.如權利要求1所述的抗體，該抗體能與鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化 或嵌合形式結合基本上相同的IFN-a表位。
11.如權利要求1所述的抗體，該抗體是鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化或 嵌合形式。
12.如權利要求11所述的抗體，該抗體是人源化的抗人IFN-a單克隆抗體9F3的版本 13(V13)。
13.如權利要求1所述的抗體，該抗體能與2001年1月18日保藏于ATCC的、保藏號為 PTA-2917的雜交瘤細胞系所產生的抗IFN-a抗體結合基本上相同的IFN-a表位。
14.如權利要求1所述的抗體，該抗體為IgG類。
15.如權利要求14.所述抗體，該抗體有IgGpIgG2，IgG3，或IgG4同種型。
16.如權利要求1所述的抗體，該抗體為抗體片段。
17.如權利要求16所述的抗體，該抗體為Fab片段。
18.如權利要求16所述的抗體，該抗體為F(ab’)2片段。
19.如權利要求16所述的抗體，該抗體為Fab’片段。
20.一種抗IFN-a抗體輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列CDR:(a)化學式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學式YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學式QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3。
21.如權利要求20所述的抗IFN-a抗體輕鏈片段，該輕鏈片段為輕鏈可變結構域。
22.—種抗IFN-a抗體重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R:(a)化學式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的 HI ；(b)化學式SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；(c)化學式WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。
23.如權利要求22所述的抗IFN-a抗體重鏈片段，該重鏈片段為重鏈可變結構域。
24.一種抗IFN-a抗體，該抗體含有(A)至少一條輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學式YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學式QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ；禾口(B)至少一條重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的 HI ；(b)化學式SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；禾口(c)化學式WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。
25.如權利要求24所述的抗體，該抗體具有同質四聚體結構，該結構含有兩個由二硫 鍵聯(lián)接的抗體重鏈-輕鏈對。
26.如權利要求24所述的抗體，該抗體為線形抗體。
27.如權利要求24所述的抗體，該抗體為鼠抗體。
28.如權利要求24所述的抗體，該抗體為嵌合抗體。
29.如權利要求24所述的抗體，該抗體為人源化抗體。
30.如權利要求24所述的抗體，該抗體為人抗體。
31.一種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求1所述的抗體。
32.—種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求11所述的抗體。
33.一種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求12所述的抗體。
34.一種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求24所述的抗體。
35.一種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求20所述的抗體輕鏈或其輕鏈片段。
36.一種分離的核酸分子，該分子編碼權利要求22所述的抗體重鏈或其重鏈片段。
37.一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登 錄號PTA-2882的載體中編碼輕鏈多肽的核酸序列。
38.一種分離的核酸分子，該分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登錄號 PTA-2881的載體中編碼重鏈多肽的核酸序列。
39.一種載體，該載體含有權利要求31至38任何一項所述的核酸分子。
40.一種宿主細胞，該細胞是用權利要求31至38任何一項所述的核酸分子轉化的宿主 細胞。
41.產生如權利要求1，11，12和24任何一項所述的抗體的方法，該方法包括，在使編碼 該抗體的核酸序列表達從而產生抗體的條件下，培養(yǎng)含有該核酸序列的宿主細胞。
42.一種雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系含有權利要求31至38任何一項所述的核酸分子。
43.一種雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系由ATCC于2001年1月18日保存，登錄號為 PTA-2917。
44.一種權利要求42所述的雜交瘤細胞系產生的抗體。
45.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的載體混合的有效量的權利 要求1所述的抗體。
46.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權 利要求11所述的抗體。
47.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權 利要求12所述的抗體。
48.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權 利要求24所述的抗體。
49.一種診斷與細胞內IFN-a表達有關的疾病的方法，該方法包括使所述細胞與權利 要求1所述的抗IFN-a抗體接觸，并檢測IFN-a的存在。
50.一種治療與患者體內IFN-a表達有關的疾病的方法，該方法包括給予所述患者有 效量的如權利要求1所述的抗IFN-a抗體。
51.如權利要求50所述方法，其中所述患者為哺乳動物患者。
52.如權利要求51所述方法，其中所述患者為人。
53.如權利要求52所述方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。
54.如權利要求53所述方法，其中所述疾病選自于胰島素依賴性糖尿病(IDDM)；和全 身性紅斑狼瘡(SLE)；和自身免疫性甲狀腺炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-干擾素α的抗體，更具體地，本發(fā)明總體上涉及產生和特征鑒定對各種IFNα亞型具有廣泛反應活性的中和性抗-IFNα單克隆抗體。本發(fā)明還涉及這種抗-IFN-α抗體在診斷和治療與IFN-α表達增高有關的疾病，特別是自身免疫性疾病，如胰島素依糖性糖尿病(1DDM)和全身性紅斑狼瘡中的應用。
文檔編號C12N1/21GK101857636SQ20101018070
公開日2010年10月13日 申請日期2002年1月29日 優(yōu)先權日2001年2月22日
發(fā)明者A·春塔拉帕伊, J·K·金, L·G·普雷斯塔, T·斯圖爾特 申請人:基因技術股份有限公司