專利名稱：一種生物脫氮?jiǎng)┘捌鋺?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌、培養(yǎng)該細(xì)菌 的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫氮?jiǎng)┑闹苽洌捌湓诮到馑w氮素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氮素循環(huán)是自然界中最為重要的生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的組成之一。然而，氮肥的使 用及高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，在帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題。在水 產(chǎn)養(yǎng)殖中，因氮磷元素含量過高而造成的富營養(yǎng)化情況頻繁出現(xiàn)，除使水質(zhì)惡化及破壞其 中的生物平衡外，其中的氨氮和亞硝態(tài)氮對養(yǎng)殖動(dòng)物具有較強(qiáng)毒性，特別是氨氮(MV-N)， 它能直接或間接影響著魚類的生長和繁殖乃至死亡。一方面它能被植物直接吸收利用， 構(gòu)成它們生命的蛋白質(zhì)，增加浮游生物量，為魚類提供更豐富的營養(yǎng)餌料。另一方面它對 魚類及其他水生動(dòng)物有毒性，它能破壞鰓組織，并滲進(jìn)血液中，降低血液載氧能力，使呼吸 機(jī)能下降。水中氨氮的來源，除了人工施肥外，主要是蛋白質(zhì)分解的最終產(chǎn)物，由其造成 的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害甚至死亡現(xiàn)象已多見報(bào)道[ANTONIO T，CARLOS M，MANUEL P M，et al.Environmental impactsof intensive aquaculture in marine water[J]. Wat Res, 2000,34(1) =334-342] 0如在對蝦養(yǎng)殖中，蝦池中氨氮含量超過0. 10mg/L時(shí)，對蝦就會(huì)中 毒，且不易搶救。傳統(tǒng)上。為減少氨氮污染帶來的危害，人們開始研究采用生物處理法，如活 性污泥法、生物膜法和穩(wěn)定塘法，但這些傳統(tǒng)方法存在或伴有污泥產(chǎn)生、反應(yīng)啟動(dòng)慢、出水 水質(zhì)不穩(wěn)定等問題，后又采用固定化光合細(xì)菌來進(jìn)行脫氮處理。人們曾利用硝化菌群除氮， 但是硝化作用的終產(chǎn)物是硝酸鹽，會(huì)破壞生物圈氮素的平衡且該產(chǎn)物能誘發(fā)人類的高鐵血 紅蛋白癥。經(jīng)典脫氮工藝主要由氨化、硝化反應(yīng)器和反硝化反應(yīng)器組成，但由于在魚蝦養(yǎng)殖 過程中必須充氧來保證水中的溶解氧量，那么厭氧反硝化細(xì)菌的脫氮作用也不能得到充分 發(fā)揮，效果不理想。與傳統(tǒng)的生物脫氮工藝相比，脫氨枯草芽孢桿菌菌株的出現(xiàn)可以使生物脫氮在同 一反應(yīng)器中完成，實(shí)現(xiàn)真正意義上對氨氮的降解。目前，關(guān)于利用枯草芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)的生物 脫氮已經(jīng)有成功應(yīng)用的報(bào)道。Gupta 等[Gupta AB, Gupta SK. Simultaneous Carbon and NitrogenRemoval in a Mixed Culture Aerobic RBC Biofilm[J]. Wat Res,1999,33(2) 555-561. ]Thiosphaera pantotropha (ijJlM^ % Paracoccus denitrif icans)的 t 物轉(zhuǎn)盤處理不同濃度的生活污水。利用枯草芽孢桿菌發(fā)展脫氨氮技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)第一、 對氨氮的降解不需要經(jīng)過硝化反硝化過程，可以大大降低對水體的二次污染；第二、枯草芽 孢桿菌菌種單一，對動(dòng)植物無害，生產(chǎn)成本低廉，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；第三、枯草芽孢桿菌對環(huán)境 中亞硝態(tài)氮也有一定的降解能力；第四、枯草芽孢桿菌為好氧菌，方便在養(yǎng)殖水體中應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌除了對氨氮有較好的脫除能力外，還能產(chǎn)生大量的胞外酶類，從而 大量消耗池塘中的殘餌和動(dòng)物排泄物等大分子有機(jī)質(zhì)。大分子有機(jī)質(zhì)被分解為小分子有機(jī) 酸、氨基酸等物質(zhì)，能為水體中光合細(xì)菌、藻類以及其它浮游生物提供營養(yǎng)，客觀上促進(jìn)了 微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定；枯草芽孢桿菌還可使水生動(dòng)物的腸道pH降低，產(chǎn)生較強(qiáng)活性的蛋白酶和淀粉酶，促進(jìn)水生動(dòng)物的消化；此外，枯草芽孢桿菌定植在目標(biāo)動(dòng)物腸道中，經(jīng)生物奪氧 作用，能抑制病原菌的滋生以及提高動(dòng)物的免疫力，最終預(yù)防疾病的發(fā)生，達(dá)到促進(jìn)目標(biāo)動(dòng) 物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率、防病和促進(jìn)生長起重要作用。環(huán)境污染是當(dāng)今人類面臨最大的危害之一，特別是工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，排出大量的 污水，這些污水如直接排放或處理不當(dāng)，將影響水體的自凈，因而使水質(zhì)惡化。人們?nèi)找嬉?識到環(huán)境污染帶來的危害，現(xiàn)在污水必須通過處理才能排放已經(jīng)成為人們的共識。在污水 中，N是主要的污染物之一，在污水中氮源主要以有機(jī)氮化合物的形式存在，包括蛋白質(zhì)以 及氨基酸等，在枯草芽孢桿菌的作用下，一部分有機(jī)含氮物在菌體自身生長繁殖中被利用， 另一部分在胞外酶的作用下脫氨基產(chǎn)生氨，以NH4+的形式被菌體吸收利用。此外，在污水中 同樣含有大量的C源，包括造紙、制麻廢水中含有的果膠質(zhì)，在好氧條件下，枯草芽孢桿菌 可以分解果膠質(zhì)，產(chǎn)生二氧化碳和水；淀粉廠、酒廠、印染廢水和生活污水的含有的淀粉，好 氧條件下，枯草芽孢桿菌首先將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，提供菌體生命活動(dòng)所需要的能量，另一 部分用于細(xì)胞合成?？莶菅挎邨U菌除了可以對污水有明顯的凈化作用外，菌體的大量繁殖 對于環(huán)境中存在的致病微生物也存在著明顯的拮抗作用。若與好氧反硝化細(xì)菌聯(lián)合應(yīng)用， 可將環(huán)境以及污水中存在的氮素高效脫除。枯草芽孢桿菌脫氮技術(shù)的關(guān)鍵在于，在一定的條件下(如溫度，pH，C/N比)，該菌 本身具有高效的氨氮的脫除能力，同時(shí)具有較好的外界環(huán)境耐受性，如對鹽度，重金屬離子 的耐受性等。因此，篩選同時(shí)具有這兩方面能力的枯草芽孢桿菌對于這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用具有 很重要的意義。目前已報(bào)道的枯草芽孢桿菌大多存在氨氮的脫除能力不強(qiáng)，缺乏對高濃度 的銨鹽的耐受性，處理時(shí)間過長，效率不高等問題。賈燕等[賈燕，江棟，周偉堅(jiān)，等.2009. 高效脫硫脫氨氮菌株的分離、鑒定及特性研究[J].中國給水排水，25(23) 114-116]報(bào)道 了一株枯草芽孢桿菌能在12_32h，將初始濃度88!^/1的氨氮降解96.6%以上，其中，當(dāng)氨 氮初始濃度> 66mg/L時(shí)，對氨氮的去除能力陡降。可見，對初始銨鹽的耐受性也是限制其 應(yīng)用的重要因素之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌，該細(xì)菌具有脫除 水體氮素的能力。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種組合培養(yǎng)條件，使該細(xì)菌能體現(xiàn)更強(qiáng)的氮素脫除 能力。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了一種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，使該細(xì)菌實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高密度 的培養(yǎng)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種生物脫氮?jiǎng)┑膭┬徒M成方式，使其在處理水體氮 素污染時(shí)更具實(shí)用性和可操作性。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供新的細(xì)菌在水體生物脫氮中的應(yīng)用。單獨(dú)使用該生物 脫氮?jiǎng)┘纯捎行摮w中的氮素。本發(fā)明公開了一株具有脫氮生物活性的細(xì)菌，該細(xì)菌具有較高的氨氮脫除能力。 在生物脫氮中能有效地將NH4+-N直接轉(zhuǎn)化成菌體的自身組成物質(zhì)。更具體地，該細(xì)菌是 本實(shí)驗(yàn)室篩選出的具有高氨氮脫除能力的一株枯草芽孢桿菌枯，命名為枯草芽孢桿菌CPUBS-1，英文名為 Bacillus subtilis CPU BS-1，簡稱 CPU BS-1。保藏號為 CGMCC No. 3668， 保藏時(shí)間2010年3月17日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。 平皿菌落圖見附圖1。本發(fā)明的菌株CPU BS-1的篩選方法包括以下步驟a.出發(fā)菌株復(fù)蘇以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, CGMCC NO. 0050)作為出發(fā)菌株，將其菌種 接種至種子培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)48h。b.菌懸液的制備從斜面取一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)16_17h后，以10%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，使菌體達(dá)到同步生長。取菌液lmL，5000rpm離心8min，棄上清，菌體沉 淀以無菌生理鹽水洗滌2次后，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的搖瓶中用手搖動(dòng)打散，并用無菌的定性 濾紙過濾，得到單細(xì)胞菌懸液，稀釋至108CFU/ml，即為待處理菌懸液。c.誘變處理以CGMCC NO. 0050為出發(fā)菌株進(jìn)行NTG誘變，用少許丙酮溶解NTG，然后用pH 7.0的磷酸緩沖液配制NTG母液，使母液的濃度為 lmg/mL。將菌懸液和NTG母液進(jìn)行混合，使混合液中NTG終濃度為0. 5mg/mL。接著將混合 液放在搖床上37°C，lOOrpm避光處理15min、30min、45min。處理完后立即稀釋1000倍停止 誘變，涂布平板。每個(gè)處理涂三個(gè)平板，然后置37°C培養(yǎng)。 將上述處理后的菌株接種到新鮮種子培養(yǎng)基中，37°C，200rpm避光培養(yǎng)4h后涂布 篩選平板。此后培養(yǎng)可以消除生理延遲現(xiàn)象(即稀釋了細(xì)胞內(nèi)原有酶量)，可以使誘變中獲 得的突變性狀得以表現(xiàn)出來，從而獲得純的變異細(xì)胞。d.高效氨氮降解菌的篩選在種子培養(yǎng)基的平板中涂布經(jīng)誘變處理過的菌液，于37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h，挑 取長出的單菌落，將菌株接種于種子培養(yǎng)液中200rpm 37°C振蕩培養(yǎng)18h，取此種子液2mL 接種于25mL/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中200rpm 37°C振蕩培養(yǎng)72h，吸取10ml活化菌液，轉(zhuǎn)入離 心管中，3000r/min離心lOmin，去除上清液；再用10ml生理鹽水洗滌沉淀，混勻，再次離心； 如此重復(fù)3次，以除去菌種活化過程中產(chǎn)生的氨氮。最后用10ml生理鹽水洗下沉淀，接入 裝有100ml篩選培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C搖床培養(yǎng)24h。用靛酚藍(lán)分光光度法測定培養(yǎng)液中 氨氮含量，同時(shí)測定未接菌的培養(yǎng)基中的初始氨氮含量，計(jì)算各個(gè)氨氮降解菌的降解率。最 終得到氨氮降解率最高的CPU BS-1。上述篩選方法中，其中種子培養(yǎng)基優(yōu)選麥芽糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至lL，pH7. 2。上述d步驟中發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選葡萄糖160g，玉米漿40g，黃豆餅粉5g，尿素20g， 碳酸鈣5g，蒸餾水定容至1L，pH7. 2。上述d步驟中篩選培養(yǎng)基優(yōu)選葡萄糖5. 0g，(NH4)2S04 0. 5g，NaCl 1. 0g，K2HP04 0. 5g，MgS04 7H20 0. 25g，蒸餾水定容至1L，pH 7. 2 7. 4，其中氨氮含量約為100mg/L。上述篩選培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基滅菌條件優(yōu)選1 X 105Pa滅菌20min，葡萄糖單獨(dú) lX105Pa滅菌20min后加入無菌培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)基中需加入1. 5%瓊脂粉。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1可以用以下方法培養(yǎng)溫度20 40°C;溶氧搖瓶轉(zhuǎn)速150 230rpm ；pH5. 0 10. 0 ；麥芽糖18 25g，蛋白胨8 12g，牛肉膏8 10g， NaCl 3 8g，酵母膏2 4g，蒸餾水定容至1L ；初始(NH4) 2S04濃度0. 5 5. Og/L。優(yōu)選的培養(yǎng)條件是溫度25 37°C ；溶氧搖瓶轉(zhuǎn)速160 200rpm ；pH7. 0 10.0 ；麥芽糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L ；初始 (NH4)2S04 濃度 0.5 4. Og/L。更優(yōu)選的培養(yǎng)條件是溫度37°C ；溶氧搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm ；pH 7. 5 ；麥芽糖20g， 蛋白胨10g，牛肉膏10g, NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L ；初始(NH4)2S04濃度2. 0g/ L0本發(fā)明公開了一種大規(guī)模高密度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌CPU BS-1的方法，包括在 20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速120 200rpm，通氣量0. 05 0. 08vvm，接菌量3 6%，初始pH 7. 5 的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌。優(yōu)選的方法包括在37°C、攪拌轉(zhuǎn)速180rpm、通氣量0. 07vvm、接 菌量5%，初始pH 7. 5的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1是具有較高的氨氮脫除能力的細(xì)菌。在常規(guī)的 生長條件下就可表現(xiàn)出氨氮脫除活性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌CPU BS-1可在含有較高濃度氨氮水體中生長繁殖，通過細(xì)菌 體內(nèi)的生物反應(yīng)過程，能快速地將一部分氨氮轉(zhuǎn)化成菌體自身物質(zhì)，使得水體中的殘余氨 氮維持在較低的水平，經(jīng)枯草芽孢桿菌CPU BS-1生物處理的養(yǎng)殖水體可達(dá)到對淡水魚蝦類 相對安全的水平。本發(fā)明提供了枯草芽孢桿菌CPU BS-1在水體生物脫氮的應(yīng)用。在本發(fā) 明的具體實(shí)施例中，枯草芽孢桿菌CPU BS-1,CGMCC No. 3668應(yīng)用于水體中氮素污染物的脫 除。本發(fā)明公開的具有脫氮生物活性的枯草芽孢桿菌CPU BS-1，在含氨氮的水體中， 能將氨氮快速的轉(zhuǎn)化為菌體自身的組成物質(zhì)。這種作用發(fā)生的環(huán)境是在好氧條件之下。本發(fā)明公開了一種對水體進(jìn)行生物脫氮的方法，包括對本發(fā)明枯草芽孢桿菌CPU BS-1進(jìn)行大規(guī)模高密度培養(yǎng)后，通過12，000g，4°C離心15min收獲菌體，重懸于10 20% 的脫脂牛奶，凍干處理。菌體凍干粉O.OXKTcfu/g)直接投入淡水養(yǎng)殖水體，使其用量為 200 300g每畝。本發(fā)明公開了一種對含氨氮廢水進(jìn)行生物脫氮的方法，本發(fā)明中具有氨氮脫除能 力的枯草芽孢桿菌CPU BS-1可加入到含氨氮廢水中，在自然環(huán)境20-27°C靜止或攪拌狀態(tài) 下，15-30天后，可脫除水體氨氮的80-95%。更優(yōu)選的時(shí)間是22天。本發(fā)明的方法節(jié)能高效，操作可在同一反應(yīng)器中一步進(jìn)行，無需特殊的設(shè)備和額 外的處理?xiàng)l件，氨氮濃度高于2. 2g/L的廢水并不能抑制菌體的生長，并且氨氮脫除率在 80%以上，脫氮效果很好。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1是一株好氧異養(yǎng)微生物，它能對富營養(yǎng)化水體， 特別是含較高濃度氨氮的水體進(jìn)行氮素?zé)o害化生物處理，經(jīng)枯草芽孢桿菌CPU BS-1生物處 理的淡水養(yǎng)殖水體達(dá)到對淡水魚蝦類相對安全的水平?？莶菅挎邨U菌CPU BS-1的水體無 害化處理是在有氧條件下進(jìn)行的，不需要特殊的設(shè)備和額外的處理?xiàng)l件，氨氮被大量轉(zhuǎn)化 為菌體自身的組成物質(zhì)，細(xì)菌可以作為魚類的食物從而循環(huán)進(jìn)入食物鏈，從而在實(shí)現(xiàn)環(huán)境 保護(hù)的同時(shí)，真正做到了能源和物質(zhì)的無害、合理再循環(huán)。


附圖1是枯草芽孢桿菌CPU BS-1的菌落形態(tài)圖附圖2是枯草芽孢桿菌CPU BS-1菌株生長曲線附圖3是枯草芽孢桿菌CPU BS-1對模擬含銨廢水的氨氮脫除曲線附圖4是枯草芽孢桿菌CPU BS-1實(shí)際污染養(yǎng)殖水體中的氨氮脫除曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CPU BS-1對模擬含銨廢水的氨氮脫除能力1.靛酚藍(lán)法測定培養(yǎng)基中氨氮1. 1銨標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密測量0. 2358g 105 °C干燥至恒重的硫酸銨溶于適量雙蒸水中，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，然后定容至刻度。即為含銨500i!g/mL的母液。臨用時(shí)準(zhǔn)確稀釋10倍。1. 2 試劑 A 精密稱取5. OOOOg苯酚和0. 0290g亞鐵基鐵氰化鈉(二水)溶于雙蒸水中，定容 至500mL，棕色瓶4°C保存。1. 3 試劑 B 稱取2. 50g氫氧化鈉、2. 0g檸檬酸三鈉和3. 5mL次氯酸鈉溶于雙蒸水中，定容至 500mL，棕色瓶4°C保存。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按下表加入各種溶液后，搖勻，37°C水浴反應(yīng)20min，迅速移至冰浴，測定A637。 靛藍(lán)法-分光光度法是一種靈敏度高，重現(xiàn)性好的氨氮檢測方法。氨在高pH條件 下和酚以及次氯酸鹽發(fā)生反應(yīng)而生產(chǎn)出一種靛酚藍(lán)的藍(lán)色化合物，顏色的深淺與NH4+的濃 度具有很好的相關(guān)性，可以利用分光光度法來檢測氨氮的含量。2.種子培養(yǎng)基
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麥芽糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L，pH7. 2。 加入1. 5%瓊脂粉制成固體斜面培養(yǎng)基。3.模擬含銨廢水的配置無機(jī)鹽溶液:NaH2P040. 25g, KH2P04 0. 75g, MgS04 7H20 0. 03g, MnS04 H20 0. Olg, FeS04 7H20 0. Olg, (NH4)2S04 10g，蒸餾水定容至1L。葡萄糖溶液稱取36g葡萄糖溶解于 1000ml蒸餾水中形成0. 20mol/L的葡萄糖溶液。以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121 °C lX105Pa滅菌20min，葡萄糖單獨(dú)115°C 1 X 105Pa 滅菌20min，使用時(shí)無機(jī)鹽溶液與葡萄糖溶液以體積9 1混合，制成模擬含銨廢水培養(yǎng)基。將菌種枯草芽孢桿菌CPU BS-1轉(zhuǎn)接到斜面，37°C培養(yǎng)24h復(fù)蘇后，從斜面接一環(huán) 枯草芽孢桿菌CPU BS-1的菌苔入裝有50ml培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在37°C，200rpm搖 床震蕩。結(jié)果培養(yǎng)物在培養(yǎng)22d后，以靛酚藍(lán)比色法測氨氮含量，氨氮去除率為89. 1%, 枯草芽孢桿菌CPU BS-1對模擬污水的氨氮脫除能力見附圖3。實(shí)施例2凍干粉制備以及活菌濃度測定1.凍干粉制備枯草芽孢桿菌CPU BS-1發(fā)酵液加入15% (m/v)脫脂奶粉，凍干機(jī)冷阱預(yù)凍 7h-8h，凍干機(jī)真空干燥。第一段-30°C 240min(4h)，第二段-10°C 600min(10h)，第三段 0°C 960min(16h)，第四段 4°C 360min(6h)。2.凍干粉活菌濃度的測定凍干粉測定活菌濃度，用淀粉稀釋至適宜濃度。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則宜選取細(xì)菌平均菌落數(shù)在30 300之間，作為菌數(shù)報(bào)告(取兩位有 效數(shù)字)的依據(jù)。2. 1當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。2. 2當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值(比值為高稀釋級 的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值)而定。若比值不大 于2，以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過5時(shí)，以 低稀釋級的菌落乘以稀釋倍落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因 再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。2. 3當(dāng)各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。2. 4如各稀釋級的平板均無均落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均 菌落數(shù)小于1時(shí)，以< 1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐菌體凍干粉制劑活菌濃度為3. OX lO^cfu/g，中試發(fā)酵罐凍干粉制 劑活菌濃度可達(dá)2. OX 101(lCfu/g。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌CPU BS-1的發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)從瓊脂斜面上接兩環(huán)菌苔裝入有50ml種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在37°C， 200rpm搖床培養(yǎng)12h。按5%接種量接種，將500ml種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至裝有9. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中。根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，確定最佳發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件37°C、攪拌轉(zhuǎn) 速lOOrpm、通氣量0.07vvm、接菌量5%，發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖160g，玉米漿40g， 尿素20g，黃豆餅粉5g，碳酸鈣5g，初始pH調(diào)節(jié)至7. 2，24h后菌株生長進(jìn)入平臺(tái)期。培養(yǎng) 24h可收獲較高濃度的菌體，有利于實(shí)際應(yīng)用中的大規(guī)模使用。生長曲線見附圖2。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌CPU BS-1在實(shí)際污染養(yǎng)殖水體中的氨氮脫除能力按照實(shí)施例3，將菌體凍干粉制劑(2. OX 101(lCfU/g)直接投入污染淡水養(yǎng)殖池塘， 菌體的投入量為200-300克每畝，每天以納氏試劑比色法測定池塘水體的氨氮含量。結(jié)果表明，在水溫25°C、pH8. 6的水體環(huán)境下，水中NH4+_N從菌體投放后的第2d開 始下降，到7d時(shí)已由6. 72mg/L下降至0. 29mg/L，見圖4，枯草芽孢桿菌CPU BS-1降解氨氮 的效果非常明顯，能在不采取其他方法的情況下，較快地將水體氨氮降解至對魚蝦相對安 全的水平。在整個(gè)觀察過程中，PH在8. 4-8. 9的范圍間波動(dòng)，這個(gè)范圍適合枯草芽孢桿菌 CPU BS-1的生長。
權(quán)利要求
一種具有脫氮生物活性的細(xì)菌，保藏號是CGMCC No.3668。
2.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1中所述細(xì)菌的方法，該方法是在下列條件下培養(yǎng)溫度20 40°C;溶氧搖瓶轉(zhuǎn)速150 230rpm ；pH5. 0 10. 0 ；培養(yǎng)基每升水中含麥芽糖18 25g， 蛋白胨8 12g，牛肉膏8 10g，NaCl 3 8g和酵母膏2 4g ；初始(NH4) 2S04濃度0. 5 5. Og/Lo
3.權(quán)利要求2的方法，該方法是在下列條件下培養(yǎng)溫度37°C；溶氧搖瓶轉(zhuǎn)速 200rpm ；pH 7. 5 ；培養(yǎng)基每升水中含麥芽糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，NaCl 5g和酵母 膏 3g ；初始(NH4)2S04 濃度 2. Og/L。
4.一種大規(guī)模培養(yǎng)權(quán)利要求1中所述細(xì)菌的方法，包括在20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速120 180rpm,通氣量0. 05 0. 08vvm,接菌量3 6%，培養(yǎng)基每升水中含葡萄糖160g，玉米漿 40g，黃豆餅粉5g，尿素20g，碳酸鈣5g，初始pH6. 0 9. 0的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌。
5.權(quán)利要求4的方法，包括在37°C、攪拌轉(zhuǎn)速180rpm、通氣量0.07vvm、接菌量5%， 初始pH 7. 5的條件下發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌。
6.權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌在養(yǎng)殖水體生物脫氮中的應(yīng)用。
7.一種對水體進(jìn)行生物脫氮的方法包括將權(quán)利要求1的細(xì)菌培養(yǎng)后，懸浮于脫脂牛 奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，菌體的投入量為1 X lCTcfu/m3。
8.一種污水處理中氨氮脫除的方法，包括將權(quán)利要求1的細(xì)菌加入到污水中，在自然 環(huán)境pH6-8，溫度20-40°C靜止或攪拌狀態(tài)下，培養(yǎng)15-30天后，即可脫除水體氨氮。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種生物脫氮?jiǎng)┘捌鋺?yīng)用，本發(fā)明的生物脫氮?jiǎng)┦且恢昕莶菅挎邨U菌，命名為枯草芽孢桿菌CPU BS-1，保藏號為CGMCC No.3668，保藏時(shí)間2010年3月17日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明還公開了該具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌的培養(yǎng)方法，及其在降解水體氮素中的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK101851595SQ201010142220
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者周長林, 和金周, 洪秀娟, 王濤, 竇潔, 賈源賓 申請人:南京曜動(dòng)節(jié)能環(huán)?？萍加邢薰?中國藥科大學(xué)