專利名稱：：一種優(yōu)化的蒙藥阿給issr分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
：蒙藥阿給[Agi]——冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld.)，又名小白蒿、菟毛蒿，為菊科蒿屬的小灌木[1]。阿給為蒙醫(yī)常用藥，具有止血、消腫之功效，臨床上主治各種出血、關(guān)節(jié)腫脹、腎熱、月經(jīng)不調(diào)、瘡?fù)吹?，也是蒙醫(yī)上常用的“人造圣水組成之一”。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，人們已將這一技術(shù)廣泛地應(yīng)用于傳統(tǒng)藥材資源、鑒定、栽培等方面。阿給的分子生物學(xué)水平的研究很少，且都不是作為藥物進(jìn)行研究。目前僅獲得了5條DNA序列，它們是小白蒿葉綠體的leu-tRNA基因的片段以及核糖體rRNA基因片段，主要用來(lái)分辨各個(gè)植物之間的差別。王靜等人檢測(cè)了阿給作為牧草在不同放牧壓力下群體的遺傳多樣性變化。由于阿給是風(fēng)媒異花受粉，在時(shí)間上和空間上有廣泛的分布，所面臨的環(huán)境差異大，個(gè)體和種群數(shù)目多，基因交流頻繁，因此產(chǎn)生新的遺傳變異的機(jī)會(huì)多，這有利于其增加遺傳多樣性水平，并使之保持較高的水平(多態(tài)位點(diǎn)百分率為94.49%),高于高等植物平均遺傳多樣性水平為70%。遺傳多樣性隨著放牧強(qiáng)度的不同也有所不同。加強(qiáng)蒙藥阿給的分子生物學(xué)水平的研究，無(wú)疑為其種子種苗研究、資源保護(hù)、功效應(yīng)用等提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。ISSR(Inter-SimpleSequenceR印eat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分子標(biāo)記是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，基本原理是利用在植物基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計(jì)引物，對(duì)位于反向排列的SSR之間的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR呈孟德?tīng)柺竭z傳，為顯性標(biāo)記，穩(wěn)定性高，技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、成本低廉。由于SSR在真核生物中分布非常普遍，且串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目是可變的，呈高度多態(tài)性，因此ISSR標(biāo)記技術(shù)可以檢測(cè)基因組許多位點(diǎn)的差異。目前該技術(shù)在植物的指紋圖譜、遺傳多樣性、遺傳作圖和基因定位研究中得到了廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，其中，所述ISSR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μ反應(yīng)體系中含有10XPCR緩沖液2yL，模板DNA50ng,此外，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaq酶為1.5U,引物為0.75μmo1·lA所述ISSR擴(kuò)增的條件為94°C退火5min，然后94°Clmin、56°C40s、72°Clmin30s40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min,其中，所述引物序列如以下所示。弓丨物序列(5，-3，)UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC本發(fā)明所建立的蒙藥阿給ISSR反應(yīng)體系擴(kuò)增出的條帶具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、背景清楚及穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。圖1為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果，1_9為表3的處理組合編號(hào)；引物為UBC807圖2為12個(gè)不同引物的ISSR擴(kuò)增結(jié)果，M:100bpladder；1.UBC807；2.UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887。圖3為ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果，1.52.0°C；2.52.3°C；3.52.90C；4.53.8°C；5.55.0°C；6.56.0°C；7.56.6°C；8.57.0°C；M:100bpladder；引物為UBC807。圖412個(gè)不同引物的ISSR擴(kuò)增，1-12選用引物分別是UBC807、UBC810、UBC811、UBC823、UBC834、UBC840、UBC841、UBC845、UBC857、UBC864、UBC873和UBC887；MIOObpladder。圖5ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增結(jié)果，1-4分別表示所用循環(huán)數(shù)目為30個(gè)循環(huán)、35個(gè)循環(huán)、40個(gè)循環(huán)和45個(gè)循環(huán)；MIOObpladder；引物為UBC807。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1提取阿給基因組DNA。1、擴(kuò)增體系的篩選正交優(yōu)化設(shè)計(jì)篩選ISSR的最優(yōu)反應(yīng)體系(四因素三水平)，選用L9(34)正交表，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系各成分的因素-水平正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表(方案見(jiàn)表2及表3)。以UBC807為引物，利用表3中的9個(gè)體系，對(duì)阿給進(jìn)行ISSR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，除表中所列因素外，每管含有IOXPCRbuffer2μL，模板DNA50ng。初擴(kuò)增程序?yàn)?°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循環(huán)45次；72°C延伸5min，4°C保存。表1ISSR擴(kuò)增引物和序列_引物序列(5，-3，)PrimerPrimersequences(5，_3，)_UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC_表2ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素與水平‘S^if平(體系終濃度J3,Mg2+Zmmol·L'11.52.02.5dNTP/mmol·L"10J502025TaqDNA聚合酶/(U·之。+·1)0.51.01.5引物/μιηο·L'1_025_05_0.75表3ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L9(34)]<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>參照何正文等的方法，對(duì)電泳條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少做直接分析。從圖1可以看出，在9個(gè)處理組合中，由于Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物4種影響因素組合的不同，擴(kuò)增效果存在著明顯差異。第1、6號(hào)處理擴(kuò)增效果較差，譜帶弱且多態(tài)性低，第3號(hào)處理效果最好，譜帶強(qiáng)，多態(tài)性高。因此獲得的最佳ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積為20μL，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶為1.5U，引物為0.75μmol·Γ1。采用優(yōu)化后的體系，以相同的DNA模板，以UBC807，UBC810，UBC811，UBC823，UBC834，UBC840，UBC841，UBC845，UBC857，UBC864，UBC873，UBC887為引物，進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出清晰且穩(wěn)定性好的條帶，多態(tài)性高(圖2)。說(shuō)明該反應(yīng)體系適合于阿給ISSR-PCR反應(yīng)。2、擴(kuò)增條件的篩選1)根據(jù)電泳結(jié)果，選用體系3為阿給ISSR反應(yīng)條件。即在20μL反應(yīng)體系中，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶為1.5U，引物為0.75μmol·Λ此外，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2μL10XPCRbuffer2μL，模板DNA為50ng，不足體積用滅菌的雙蒸水補(bǔ)足。2.1退火溫度的篩選在上述試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，優(yōu)化篩選最佳退火溫度，根據(jù)在引物理論退火溫度上下波動(dòng)2-4°C的原則，在PCR梯度擴(kuò)增儀上設(shè)置最小退火溫度為52°C，最大為57°C，PCR儀自動(dòng)形成8個(gè)梯度，即52.0°C>52.3°C>52.9°C、53.8°C>55.0°C>56.0°C>56.6°C>57.0°C。從圖3可以看出當(dāng)退火溫度為52.0-53.8°C時(shí)，產(chǎn)生的條帶不清晰，而當(dāng)退火溫度高于56.0°C時(shí)，產(chǎn)生雜帶。因而認(rèn)為UBC807引物的退火溫度為56°C較為合適。使用引物UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887，以56°C退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，產(chǎn)生的條帶清晰。2)循環(huán)數(shù)的確定根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)及退火溫度篩選的結(jié)果，進(jìn)行循環(huán)數(shù)的確定。循環(huán)數(shù)依次為30，35，40，45。每個(gè)循環(huán)設(shè)2個(gè)重復(fù)。根據(jù)正交試驗(yàn)及退火溫度的結(jié)果，選擇最佳退火溫度進(jìn)行循環(huán)數(shù)的檢測(cè)。從圖5可以看出當(dāng)循環(huán)數(shù)為30，35時(shí)，條帶不清晰，循環(huán)數(shù)為40，45時(shí)，條帶較清晰，且無(wú)雜帶，從節(jié)約時(shí)間和成本的角度考慮，選擇循環(huán)數(shù)40較為合適。結(jié)論利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA酶濃度和引物濃度4因素3水平，對(duì)蒙藥阿給ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化分析，并在此基礎(chǔ)上對(duì)PCR的循環(huán)數(shù)及退火溫度進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，20μL反應(yīng)體系中，Mg2+為1.5mmol·L—1，dNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA酶為1.5U，引物為0.75μmol·L—1時(shí)，且ISSR最適的循環(huán)數(shù)為40，最適退火溫度為56°C，擴(kuò)增效果最好。為阿給遺傳多樣性的進(jìn)一步研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。權(quán)利要求一種優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法，所述方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進(jìn)行ISSR擴(kuò)增。其中，所述ISSR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL反應(yīng)體系中含有10×PCR緩沖液2μL，其中Mg2+為1.5mmol·L-1，模板DNA50ng，dNTP為0.25mmol·L-1，Taq酶為1.5U，引物為0.75μmol·L-1。所述ISSR擴(kuò)增的條件為94℃退火5min，然后94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。其中，所述引物序列如以下所示引物序列5’-3’UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化的蒙藥阿給ISSR分子標(biāo)記方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，其中，所述ISSR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL反應(yīng)體系中含有10×PCR緩沖液2μL，模板DNA50ng，此外，Mg2+為1.5mmol·L-1，dNTP為0.25mmol·L-1，Taq酶為1.5U，引物為0.75μmol·L-1。所述ISSR擴(kuò)增的條件為94℃退火5min，然后94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。本發(fā)明所建立的蒙藥阿給ISSR反應(yīng)體系擴(kuò)增出的條帶具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、背景清楚及穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101818197SQ201010108950公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2010年2月8日優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日發(fā)明者馮金朝,劉越,周宜君,孫洪波,張淑萍,張琳霞,王俊麗,王斌,王真,申剛義,韋善君,高飛申請(qǐng)人:中央民族大學(xué)