專利名稱：從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)獲取生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微生物領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種從厭氧發(fā)酵系統(tǒng) 獲取生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方法。
背景技術(shù)：
在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，主要存在著四個階段第一階段為水解階 段，發(fā)酵原料中以木質(zhì)纖維素為主的大分子有機物被水解為各自的單體物質(zhì)；第二階段為 酸化階段，單體物質(zhì)再進一步降解為揮發(fā)性脂肪酸；第三階段為產(chǎn)乙酸階段，第四階段為產(chǎn) 甲烷階段。這四個不同的階段需要不同微生物類群的參與，這些微生物類群分別具有與其 功能相對應(yīng)的從纖維素分解到甲烷產(chǎn)生過程中關(guān)鍵酶的基因，包括與木質(zhì)纖維素水解、產(chǎn) 氫產(chǎn)酸及甲烷形成相關(guān)的基因資源。這些基因和酶在生物能源、食品、造紙、飼料、紡織、發(fā) 酵、環(huán)境和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，將成為一種豐富的尚待挖掘的基因資源。獲得環(huán)境微生物的酶或其功能基因的傳統(tǒng)方法，首先需要從環(huán)境中分離純化目標 微生物。但是，由于目前自然界中大部分的微生物的分離培養(yǎng)條件尚不清楚，分離培養(yǎng)純菌 既耗時而且有多數(shù)情況下并不能獲得目標微生物。所以，對大多數(shù)環(huán)境微生物而言，盡管知 道它們的存在，也了解它們的部分生理功能，但卻無法獲得它們的純培養(yǎng)物，特別是厭氧發(fā) 酵體系中，有90%以上的微生物不僅沒有純培養(yǎng)物，而且對它們的系統(tǒng)進化或分類地位也 缺少相應(yīng)的信息。對這些未培養(yǎng)微生物酶資源或基因資源的挖掘，已經(jīng)無法采用傳統(tǒng)的依 賴于純培養(yǎng)的微生物學(xué)技術(shù)。近幾年發(fā)展起來的元基因組學(xué)(metagenomics)技術(shù)，繞開分離培養(yǎng)，通過直接從 環(huán)境中抽提微生物核酸并構(gòu)建元基因組文庫(BAC，R)smid、C0smid或者質(zhì)粒文庫)，通過功 能篩選或同源序列篩選，獲得具有某種表型或序列的陽性克隆，經(jīng)過對陽性克隆的序列分 析，獲得功能基因或基因簇，從而有可能獲得大量的新基因。但是，如何選擇適當?shù)沫h(huán)境微 生物系統(tǒng)來滿足不同目的功能基因的篩選，如何高效率地從復(fù)雜體系中分離提純DNA，如何 建立高通量的篩選體系以及對陽性克隆的低成本、高效的序列分析方法，仍是利用元基因 組技術(shù)開發(fā)新基因資源需要解決的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從厭氧微生物群落篩選生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種從厭氧微生物群落篩選生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方 法，所述方法包括(1)從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉(zhuǎn) 染入細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克隆；(2)從步驟(1)獲得的細胞克隆中篩選具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞克隆，所述克 隆中攜帶生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因；和(3)鑒定或分離步驟( 獲得的具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的克隆中生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。在一個優(yōu)選例中，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物質(zhì)的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢 棄物(如秸稈、玉米芯等)或畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)生的家畜糞便經(jīng)過產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷或堆肥產(chǎn)生的微生 物群落。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的載體選自Josmid載體或者Cosmid載體；或在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，收集的DNA片段的長度是30_551Λ(較佳地 36-48kb)。在另一優(yōu)選例中，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15_40 分鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質(zhì)，獲得 上清；和(b)從上清提取DNA。在另一優(yōu)選例中，蛋白酶K的終濃度是1 士0. 2mg/ml ；SDS的終濃度是1 士0. 2mg/ ml ο在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，在55 士 1°C孵育18-22分鐘，接著在70 士 1°C孵育 9-11分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質(zhì)的方法是將裂解液 于17000 士 2000g (優(yōu)選17000 士 IOOOg ；更優(yōu)選17000g)下離心8-12分鐘(優(yōu)選10分鐘)。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比 25 24 1)抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比M 1)抽提上清；接著 用異丙醇(優(yōu)選0. 6倍體積)在MOO 士 500g下離心沉淀DNA。在另一優(yōu)選例中，在裂解微生物細胞前，還包括采用差速離心法去除厭氧微生物 群落中的粗顆?；蚍羌毎镔|(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因選自(但不限于)內(nèi)切葡聚糖酶基 因，內(nèi)切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或所述的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀選自(但不限于)對應(yīng)于內(nèi)切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水 解圈；對應(yīng)于內(nèi)切木聚糖酶水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經(jīng)剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水解圈；對應(yīng)于葡萄糖苷酶水解培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈 現(xiàn)黑色水解圈；對應(yīng)于外切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮-β -D-纖維二糖，在紫外光 激發(fā)下呈現(xiàn)熒光水解圈。在另一優(yōu)選例中，步驟C3)包括對生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因進行測序，測序的方法包 括(i)選取2-100個(如3個、5個、10個、20個、50個)具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞
克隆分別進行培養(yǎng)，將獲得的細胞培養(yǎng)物混合，獲得混合的細胞體系；和(ii)從所述混合的細胞體系中提取DNA，測序。在另一優(yōu)選例中，步驟(i)中，分別進行培養(yǎng)時，將細胞克隆培養(yǎng)到基本上相同的細胞數(shù)(0D值)，再將各細胞培養(yǎng)物混合。在另一優(yōu)選例中，采用4M高通量測序法進行測序。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(iii)將DNA測序結(jié)果與現(xiàn)有的基因序列數(shù)據(jù)庫進 行比對，找出新的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。更優(yōu)選地，所述DNA編碼的蛋白序列與現(xiàn)有的DNA編碼的蛋白相似性小于90% (更佳地小于85% )，則所述生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因為新基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種從厭氧微生物群落提取DNA的方法，所述方法包 括(al)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15_40 分鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質(zhì)，獲得 上清；和(bl)從上清提取DNA。在一個優(yōu)選例中，步驟(al)中，在55士 1°C孵育18_22分鐘，接著在70士 1°C孵育 9-11分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(al)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質(zhì)的方法是將裂解 液于17000士2000g (優(yōu)選17000士 IOOOg ；更優(yōu)選17000g)下離心8_12分鐘(優(yōu)選10分 鐘)。在另一優(yōu)選例中，步驟(bl)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比 25 24 1)抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比M 1)抽提上清；接著 用異丙醇(優(yōu)選0. 6倍體積)在MOO 士 500g下離心沉淀DNA。在另一優(yōu)選例中，在裂解微生物細胞前，還包括采用差速離心法去除厭氧微生物 群落中的粗顆?；蚍羌毎镔|(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了篩選到的呈現(xiàn)黃色水解圈(箭頭所示)的內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆。圖2顯示了篩選到的呈現(xiàn)黃色水解圈(箭頭所示)的內(nèi)切木聚糖酶陽性克隆。圖3顯示了篩選到的呈現(xiàn)黑色水解圈(箭頭所示)的β -葡萄糖苷酶。圖4顯示了篩選到的紫外光激發(fā)下呈現(xiàn)熒光水解圈(箭頭所示)的外切葡聚糖酶 陽性克隆。圖5顯示了本發(fā)明的方法(泳道1)和現(xiàn)有技術(shù)方法(泳道2)提取的基因組DNA 的脈沖場凝膠電泳的結(jié)果，其中泳道M為Lamda mix DNA Marker。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次優(yōu)化了一種從厭氧微生物群落篩選生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相 關(guān)基因的方法。本發(fā)明建立了從厭氧發(fā)酵群落的未培養(yǎng)微生物中直接篩選與能源轉(zhuǎn)化相關(guān) 酶的基因資源的方法，并且針對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落復(fù)雜的特點，優(yōu)化了 DNA提取 技術(shù)和序列測定技術(shù)。本發(fā)明可以從厭氧發(fā)酵微生物群落中高通量、高效率地篩選獲得大量的與生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的新基因，解決了厭氧發(fā)酵群落中多數(shù)微生物不能被培養(yǎng)，而難以對 其基因資源進行挖掘利用的難題，還有效地提高了篩選效率和準確性。微生物群落本領(lǐng)域人員均了解，由于環(huán)境微生物的共生性和復(fù)雜性，在非純培養(yǎng)的條件下， 不一定存在100%均為厭氧微生物的微生物群落，因此本發(fā)明中所述的“厭氧微生物群 落”的概念是相對的。本發(fā)明人將所述的“厭氧微生物群落”定義為厭氧微生物占微 生物總數(shù)的70%以上，較佳地為80%以上的微生物群落。所述的厭氧微生物群落是由 多種菌群構(gòu)成的集合體，其中含有的厭氧微生物沒有特別的限制，代表性的微生物例如 (但不限于)熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)，解纖維素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)，溶纖維素擬桿菌 (Bacteroides cellulosolvens)(Cytophaga hutchinsonii),^
胞菌(Syntrophomonas wolfei), Methanoculleus bourgensis 等。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物質(zhì)的工 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物或畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)生的家畜糞便經(jīng)過產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷或堆肥產(chǎn)生的微生物群落。 所述的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物如秸稈、玉米芯等。DNA的提取本發(fā)明的方法中，直接從厭氧微生物群落中提取基因組DNA，而不是從微生物的純 培養(yǎng)物中提取基因組DNA，如何獲得盡可能完整的、有利于后續(xù)連接、轉(zhuǎn)染的基因組DNA是 較為關(guān)鍵的。因此，本發(fā)明人進行了深入的研究，優(yōu)化了 DNA提取的技術(shù)。DNA提取的常規(guī)步驟通常包括分離細胞，細胞破碎(或裂解)，離心獲取含有DNA 的上清，有機溶劑抽提DNA。本發(fā)明人對于這些步驟進行了優(yōu)化，特別是對于細胞裂解以及 粗裂解液的處理進行了優(yōu)化。微生物細胞的裂解直接關(guān)系到最終得到的DNA的多少以及完整性，如果裂解條件 太劇烈則無法得到完整的大片段，而如果裂解條件太溫和又不能完全裂解細胞從而影響后 續(xù)提取結(jié)果。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細 胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C、更佳地為55士 1°C孵育15-40分鐘、更 佳地為18-22分鐘；接著在70士2°C、更佳地為70士 1°C孵育8_12分鐘、更佳地為9_11分 鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質(zhì)，獲得上清；和(b)從上清提取DNA。本發(fā) 明優(yōu)化后的條件實現(xiàn)了在有效裂解的基礎(chǔ)上得到較為完整的DNA大片段，從而有利于高效 地、準確地篩選得到目的基因。并且，本發(fā)明分別在兩種溫度(在55士2°C，70士2°C)條件 下分別進行孵育，在裂解時間上比現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)裂解時間(一般需要2小時以上)大 大縮短。蛋白酶K和SDS的濃度優(yōu)選1 士0. 3mg/ml ；更佳地為1 士0. lmg/ml。進一步優(yōu)選地，以上步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質(zhì)的方法是將裂解 液于17000士2000g，較佳地17000士 lOOOg，更佳地17000g下離心8_12分鐘，更佳地為10 分鐘。或者，以上步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇 抽提上清；接著用異丙醇在M00士500g下離心沉淀DNA。所述離心的條件有利于盡可能地 去除雜質(zhì)而保留下完整的DNA。提取DNA的其它方面的技術(shù)是本領(lǐng)域人員已知的，在未特殊說明的情況下，可以 參照現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法。例如，在裂解微生物細胞前，通常還會包括去除非細胞物質(zhì)或粗
7顆粒的步驟；在獲得DNA沉淀后，通常還包括將DNA溶解的步驟，溶解DNA通常采用TE溶 液。優(yōu)選地，本發(fā)明采用差速離心法去除厭氧微生物群落中的粗顆?；蚍羌毎镔|(zhì)。文庫的構(gòu)建在獲得了基因組DNA后，對基因組DNA進行切割，從而獲得適當大小的DNA片段。 將DNA片段連接到適當?shù)氖删w載體上，進行包裝和轉(zhuǎn)染，從而構(gòu)建獲得供篩選的文庫。除 非另外說明，文庫的構(gòu)建采用本領(lǐng)域人員已知的材料和技術(shù)。所述的克隆載體可以選自 Fosmid載體或者Cosmid載體等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用R)smid載體構(gòu)建R)smid文庫。構(gòu)建方法主要包括 將基因組DNA進行切割處理，對DNA片段進行末端平滑磷酸化處理；電泳回收長度適合于 連接到R)smid載體的DNA片段；將回收的片段連接到R)smid載體上；包裝；轉(zhuǎn)染感受態(tài)細 胞；獲得攜帶所述各DNA片段的細胞克隆，形成R)smid文庫。連接、包裝、轉(zhuǎn)染的方法均是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以采用商品化的材料。功能鑒定獲得了攜帶所述DNA片段的細胞克隆后，根據(jù)所需篩選的基因所編碼的蛋白的生 物質(zhì)轉(zhuǎn)化特性來篩選具有特定性狀的細胞克隆。所述的基因例如(但不限于)內(nèi)切葡聚糖 酶基因，內(nèi)切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因。這些基因所編碼的 酶蛋白均有明確的水解特性，水解特定的底物并在特定的染色劑存在下發(fā)生顯色反應(yīng)。其 中，內(nèi)切葡聚糖酶可水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水解圈；內(nèi)切木 聚糖酶可水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經(jīng)剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水解圈；β -葡萄糖苷酶可水解 培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈現(xiàn)黑色水解圈；外切葡聚糖酶可水解培 養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮- β -D-纖維二糖，在紫外光激發(fā)下呈現(xiàn)熒光水解圈。對于篩選獲得的具有特定性狀的細胞克隆，提取其中的DNA進行測序，從而獲得 功能基因相關(guān)的序列信息。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，選取2-100個具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞克隆分別進行 培養(yǎng)，將獲得的培養(yǎng)物混合，獲得混合的細胞體系；從所述混合的細胞體系中提取DNA，測 序。為了獲得更好的測序結(jié)果，提取的混合DNA中來自每個細胞克隆的DNA的比例需要保 持基本上一致，現(xiàn)有技術(shù)中為了達到這個目的通常是將每個克隆分開來抽提DNA，然后再等 比例混合DNA，但是這樣的做需要同時提取多個克隆的DNA，非常繁瑣而且大幅增加DNA提 取消耗的試劑盒成本。而如果將所有的陽性克隆先混合培養(yǎng)再抽提DNA，那個因為每個陽性 克隆的生長速度不一致，那么那些生長緩慢的克隆的DNA在混合DNA中的比例就會偏低，這 樣對于測序來說是不利的。因此本發(fā)明進行了優(yōu)化，通過先分別培養(yǎng)細胞克隆，然后按照相 同或相近的細胞數(shù)量(數(shù)目)來混合不同的細胞克隆，最后再抽提混合DNA，這樣做可以保 證提取的混合DNA中來自每個細胞克隆的DNA的比例盡可能地保持了一致，而且通量高成 本低。對多個細胞克隆進行混合測序，有利于提高檢測的效率，實現(xiàn)高通量測序，從而降低 檢測成本。優(yōu)選地，采用4Μ高通量測序法進行測序。如本文所用，“基本上相同”的細胞數(shù)目是指各個細胞克隆在被分別培養(yǎng)后，達到 屬于相同或接近的細胞數(shù)目，例如細胞克隆1的細胞數(shù)目是ι χ IO9,細胞克隆2的細胞數(shù)目 是1.2Χ109，也可以認為達到了數(shù)目的基本上相同。本領(lǐng)域人員均了解，細胞個體是細微的 且動態(tài)的，無法控制不同細胞培養(yǎng)物中細胞數(shù)目達到絕對的相同?？梢酝ㄟ^一些現(xiàn)有的檢測手段來控制細胞數(shù)目基本上相同，較佳地是測量細胞培養(yǎng)物的OD值，調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)物的 OD值相同或相近。可將DNA測序結(jié)果與現(xiàn)有的基因序列數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出新的生物質(zhì)轉(zhuǎn) 化相關(guān)基因。作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明所述的方法包括(1)從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)出發(fā)， 特別是從秸桿厭氧發(fā)酵系統(tǒng)出發(fā)，提取并純化30-481Λ的元基因組DNA，經(jīng)過連接、包裝和 轉(zhuǎn)染建立R)smid元基因組文庫；( 利用水解圈顯色法篩選該R)smid文庫中具有生物質(zhì) 轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶如內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切木聚糖酶等的陽性克 ??；(3)篩選到的陽性克隆等比例混合后提取R)Smid DNA后采用妨4測序法測序，將編碼 相應(yīng)的酶的基因與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定是否為與已報道基因編碼蛋白質(zhì)序列的相 似性小于85%的新基因，同時可獲得該新基因的(上下游)調(diào)控序列。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明不需要對厭氧發(fā)酵群落中的微生物進行培養(yǎng)，而直接將厭氧發(fā)酵群落 的元基因組DNA用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的基因資源的篩選，該方法同時針對厭氧發(fā)酵群落 中所有的微生物，具有免培養(yǎng)和高通量的優(yōu)點。(2)本發(fā)明優(yōu)選地建立了 R)smid文庫，對其中具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶如內(nèi)切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和內(nèi)切木聚糖酶等活性的陽性克隆的篩選使用水解 圈顯色法，對10萬個克隆進行篩選后得到了 1000多個陽性克隆，具有高通量、高效率的優(yōu)
點O(3)本發(fā)明優(yōu)選地將獲得的陽性克隆等比例混合后進行高通量測序，可以同時獲 得多個陽性克隆的功能基因的編碼序列和上下游調(diào)控序列的信息，具有高通量、高效率和 低成本的特點。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。實施例1、沼氣發(fā)酵系統(tǒng)R)smid元基因組文庫的構(gòu)建1、基因組DNA的提取取SmL沼液(取自以秸桿和豬糞為原料進行40°C厭氧發(fā)酵的沼氣池)，SOOOg 離心 5min 后，取沉淀并用 20mL PBS 緩沖液(137mM NaCl, 2. 7mMKCl, 1. 5mM KH2PO4,8. ImM Na2HPO4, pH 7.4)洗 3 次。沉淀用 7. 68mL DNA 抽提緩沖液重懸(IOOmM Tris-HCl(pH 8.0)， IOOmM EDTA, IOOmM Na3PO4,1. 5M NaCl, 1 % (w/v)CTAB) 加入蛋白酶 K(終濃度 lmg/mL) 和SDS(終濃度(w/v))后在55°C孵育20min，然后再在70°C孵育lOmin。粗裂解液于 17，OOOg離心IOmin后，收集上清。用苯酚氯仿異戊醇Q5 24 1)抽提上清兩次后 再用氯仿異戊醇04 1)抽提上清一次。用0. 6倍體積的異丙醇在5，400g離心5min沉 淀DNA，用 200μL TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8.0)溶解 DNA 沉淀。使用 Epicentre 公司的DNA End-Repair Kit試劑盒對5 μ g元基因組DNA進行補平和磷酸化，操作按照試 劑盒說明書進行。將經(jīng)過補平和磷酸化的基因組DNA樣品，進行脈沖場凝膠電泳(緩沖液0. 5XTBE,電壓6V/cm，電泳時間18h，轉(zhuǎn)換時間7s，轉(zhuǎn)角120度，溫度14°C )，電泳結(jié)果見圖 5泳道1 ο對比例在提取元基因組DNA時，其它步驟同上，不同點在于在加入蛋白酶K(終濃度Img/ mL)和SDS (終濃度1 % (w/v))后在55 °C孵育3小時。對獲得的基因組DNA進行脈沖場凝膠 電泳(緩沖液0. 5 X TBE,電壓6V/cm,電泳時間18h，轉(zhuǎn)換時間7s，轉(zhuǎn)角120度，溫度14°C )， 電泳結(jié)果見圖5泳道2。因此，從脈沖場凝膠電泳的結(jié)果(圖5)可以看到，用本發(fā)明優(yōu)化的方法提取的 DNA,其片段大小集中在38-481Λ之間，而用一般方法提取的DNA其片段長度集中在23-301Λ 之間，所以本發(fā)明優(yōu)化的方法提取的DNA片段要大于一般方法提取的DNA，更加適合文庫構(gòu) 建的要求。同時，用本專利優(yōu)化的方法提取的DNA，其A260/A280和A260/A230的值均高于一 般方法提取的DNA (見表1)，這表明用本發(fā)明的方法提取的DNA比用一般方法提取的DNA純 度更高。高純度大片段DNA的獲取是成功構(gòu)建高質(zhì)量R)Smid文庫的關(guān)鍵。表1、不同方法獲得DNA的吸光度檢測
權(quán)利要求
1.一種從厭氧微生物群落篩選生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方法，其特征在于，所述方法包括(1)從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉(zhuǎn)染入 宿主細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克隆；(2)從步驟(1)獲得的細胞克隆中篩選具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞克隆，所述克隆中 攜帶生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因；和(3)鑒定或分離步驟( 獲得的具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的克隆中生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物 質(zhì)的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物或畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)生的家畜糞便經(jīng)過產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷或堆肥產(chǎn)生的微生物 群落。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的載體選自Josmid載體 或者Cosmid載體；或收集的DNA片段的長度是30-551Λ。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15-40分鐘， 接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質(zhì)，獲得上清； 和(b)從上清提取DNA。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質(zhì) 的方法是將裂解液于17000 士 2000g下離心8-12分鐘。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇抽 提上清；接著采用氯仿、異戊醇抽提上清；接著用異丙醇在MOO士500g下離心沉淀DNA。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因選白內(nèi)切葡聚 糖酶基因，內(nèi)切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或所述的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀選自對應(yīng)于內(nèi)切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水解圈；對應(yīng)于內(nèi)切木聚糖酶水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經(jīng)剛果紅染色呈現(xiàn)黃色水解圈； 對應(yīng)于葡萄糖苷酶水解培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈現(xiàn)黑 色水解圈；對應(yīng)于外切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮-β -D-纖維二糖，在紫外光激發(fā) 下呈現(xiàn)熒光水解圈。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)包括對生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因進行 測序，測序的方法包括(i)選取2-100個具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞克隆分別進行培養(yǎng)，將獲得的細胞培養(yǎng) 物混合，獲得混合的細胞體系；和( )從所述混合的細胞體系中提取DNA，測序。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(i)中，分別進行培養(yǎng)時，將細胞克隆培 養(yǎng)到基本上相同的細胞數(shù)，再將各細胞培養(yǎng)物混合。
10. 一種從厭氧微生物群落提取DNA的方法，其特征在于，所述方法包括 (al)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15-40分 鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質(zhì)，獲得上 清 ’和(bl)從上清提取DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)獲取生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的方法，所述方法包括從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉(zhuǎn)染入細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克?。粡墨@得的細胞克隆中篩選具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的細胞克隆，所述克隆中攜帶生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因；鑒定或分離獲得的具有生物質(zhì)轉(zhuǎn)化性狀的克隆中生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因。本發(fā)明不需要對厭氧發(fā)酵群落中的微生物進行培養(yǎng)，而直接將厭氧發(fā)酵群落的元基因組DNA用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的基因資源的篩選，該方法同時針對厭氧發(fā)酵群落中所有的微生物，具有免培養(yǎng)、高通量和低成本的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102146368SQ20101010794
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者嚴興, 劉芳華, 周志華, 張珺, 程林, 耿阿蕾, 魏勇軍 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院