專利名稱：一株在草莓連作病害中起生防作用的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株在草莓連作病害中起生防作用的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
連作病害導(dǎo)致包括草莓在內(nèi)的許多農(nóng)作物植株生長發(fā)育不良、根部病害嚴(yán)重、產(chǎn) 量和品質(zhì)下降，減產(chǎn)高達(dá)50% 90%。以往人們?cè)诳朔B作病害時(shí)曾采用栽培、物理、化 學(xué)和微生物制劑等多種方法，其中以溴甲烷等化學(xué)藥物處理土壤最為普遍。但是化學(xué)藥物 的毒性對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，禁止使用已成必然。栽培和物理的如輪作、曬土、土壤 熏蒸或悶蒸消毒等方法可以達(dá)到一定的效果，但存在實(shí)際困難和弊病，例如由于中國耕地 缺少的實(shí)際情況，生產(chǎn)中農(nóng)民采用輪作、曬土困難；土壤熏蒸或悶蒸消毒破壞了土壤理化性 狀，殺死病害菌的同時(shí)也殺死有益生防菌，引起土壤理化性狀的惡化，破壞了農(nóng)作物賴以生 存的土壤生態(tài)環(huán)境。在連作病害防治方面目前備受人們青睞的是微生物連作防治劑，原因 是其副作用小，成本較低，安全有效，符合農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的要求。中國各省(市、區(qū))均有草莓栽培，主要集中在河北、山東、遼寧、江蘇等地。據(jù)農(nóng) 業(yè)部統(tǒng)計(jì)，2006年中國草莓栽培面積(7.93 5hm2)和產(chǎn)量(187. 6萬t)均居世界首位。保 護(hù)地草莓由于淡季上市，加上近年草莓果實(shí)品質(zhì)明顯提高，個(gè)大形美，香甜可口，色澤艷麗， 價(jià)格高銷量大。因此，目前中國各地草莓發(fā)展勢頭有增無減。2012年第七屆世界草莓大會(huì) 將在中國北京召開，這更進(jìn)一步促進(jìn)了中國草莓產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)增和升級(jí)。從全球許多草莓種植 地區(qū)的經(jīng)驗(yàn)可以看出，草莓連作病害是草莓大面積生產(chǎn)地區(qū)的發(fā)展克星，如果不加以有效 的控制對(duì)草莓生產(chǎn)可以形成毀滅性的打擊。草莓連作病害一直是世界草莓生產(chǎn)中亟待解 決的問題，這一問題在中國更為嚴(yán)重。世界草莓主要種植區(qū)一般采用一年一栽制，而我國由 于耕地?cái)?shù)量限制，以及設(shè)施栽培廣泛使用，造成很多產(chǎn)區(qū)不能進(jìn)行規(guī)范化輪作，從而導(dǎo)致草 莓連作病害。草莓連作病害是由多種病原真菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起的，主要病害種類為草 莓枯萎病和黑根腐病等，主要病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和立枯絲核菌 (Rhizoctonia spp.)。如何在草莓連作病害防治中既保證草莓產(chǎn)品質(zhì)量安全，同時(shí)又不破 壞土壤生態(tài)環(huán)境，是一急需解決的問題。連作是指一年內(nèi)或連年在同一塊田地上連續(xù)種植同一種作物的種植方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。本發(fā)明所提供的菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZLS-01，其保藏編號(hào) 為 CGMCC No. 3513。該菌株已于2009年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號(hào)為 CGMCC No. 3513。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生物菌劑。本發(fā)明所提供的生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZLS-OICGMCC No. 3513?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在拮 抗病原真菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述病原真菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)或立枯絲核菌 (Rhizoctoniasolani)?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在植 物連作中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在防 治植物連作病害中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在改 善植物連作土壤中菌群結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在改 善植物連作土壤微生態(tài)環(huán)境中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在增 加植物連作土壤中利于植物生長的細(xì)菌數(shù)目和利于植物生長的放線菌數(shù)目中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在降 低植物連作土壤的PH值、降低植物連作土壤的土壤容重和/或增加植物連作土壤中的有機(jī) 質(zhì)含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或所述生物菌劑在增 加植物連作土壤中的堿解氮、速效磷和/或速效鉀中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述的應(yīng)用中，所述植物為草莓。上述任一所述的應(yīng)用中，所述連作土壤為相同植物連作2茬或2茬以上的土壤，具 體可為相同植物連作2茬或3茬的土壤。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明菌株對(duì)病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)或立枯絲核 菌(Rhizoctonia solani)具有拮抗作用，可抑制病害。本發(fā)明菌劑，可增加土壤中優(yōu)勢菌 (益生微生物種群)的數(shù)量，對(duì)預(yù)防和抑制草莓連作病害起到了積極作用；本發(fā)明菌劑與基 肥混合使用后能降低土壤PH值，使其趨向于中性，pH值從8. 2下降到7. 1，使土壤酸堿緩 沖能力增強(qiáng)；增強(qiáng)土壤的透氣性、透水性、保水性和保肥性；還使土壤有機(jī)質(zhì)逐年提高，從 2. 80%上升到3. 20%，增高土壤肥力；使草莓根際土壤堿解氮、速磷和速鉀都顯著增加。本 發(fā)明菌劑能抑制草莓連作病害，保障草莓產(chǎn)量。另外，本發(fā)明菌副作用小、成本較低、對(duì)造成 草莓連作病害的病原菌真對(duì)性強(qiáng)、安全有效，與其它生防菌有很好的協(xié)同作用，對(duì)土壤環(huán)境 有天生適應(yīng)性，穩(wěn)定性好，符合當(dāng)前發(fā)展綠色有機(jī)果品的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為ZLS-01菌株的16S rDNA序列BLAST相似度分析結(jié)果圖2為基于16S rDNA序列的ZLS-01菌種系統(tǒng)發(fā)育樹
圖 3 為 ZLS-Ol 菌株對(duì)病原真菌 Rhizoctonia solani 禾口 Fusarium oxysporum 的 拮抗圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從生物公司購買。實(shí)施例1、菌的分離與鑒定一、菌的分離采用五點(diǎn)法，在草莓生產(chǎn)田取草莓根際土壤放于滅菌的鋁盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。稱取 20g 土樣加入無菌水90毫升，吸取上清液制成稀釋?duì)│?1, ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4,10_5 土壤溶液。選 取10_3，IO-4,10_5三個(gè)稀釋液，每個(gè)梯度吸取0. 1毫升溶液涂板、倒置于人工培養(yǎng)箱中370°C 下培養(yǎng)。將具不同表型的細(xì)菌用接種針在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，然后37°C下培養(yǎng)。細(xì)菌 分離培養(yǎng)基為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/L、瓊脂粉10g/L、pH 7. 2。采用對(duì)峙法 將病原真菌(尖孢鐮刀菌或立枯絲核菌)的瓊脂塊接入平板一側(cè)，在另一側(cè)距離病原真菌 3cm處用劃線法接入分離的細(xì)菌菌株，置于28°C下培養(yǎng)3飛天，篩選分離對(duì)病原真菌生長有 抑制作用的菌株。篩選得到對(duì)病原真菌具有抑制作用的菌株，命名為ZLS-01。二、菌的鑒定(一)菌體特征ZLS-01菌株劃線培養(yǎng)，菌落形態(tài)直接觀察和顯微鏡檢。將待檢菌落挑入0. 5ml的 無菌稀釋液內(nèi)充分混勻后，再取此稀釋液進(jìn)行有關(guān)生理生化試驗(yàn)，具體操作按照東秀珠等， 2001，《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的方法進(jìn)行。結(jié)果單個(gè)細(xì)胞0.72X 2. 3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽 性菌，芽孢0. 79X 1. 35微米，橢圓，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，淺白色。 以孢子形式存在時(shí)耐高溫、耐酸堿。產(chǎn)生抗菌類的多肽物質(zhì)。( 二 ) 16SrDNA 全序列采用細(xì)菌16SrDNA 的通用性引物(16SF 5，AGTTTGATCCTGGCTCAG 3，，16SR 5‘GGTTACCTTGTTACGACTT 3，)，以ZLS-01菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 為50 μ 1，其中10X擴(kuò)增緩沖液10μ 1，4種dNTP混合物各200ymol/L，正反引物各20pmol/ L，模板DNA 50ng，Pfu 聚合酶 1. 5u，Mg2+2mmol/L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2. 5min, 94°C 45sec, 52°C lmin，72°C 1. 5min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，最后4°C保存。擴(kuò)增出的16S rDNA 在瓊脂糖凝膠上電泳分離，DNA膠回收試劑盒分離純化后克隆至pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化 Escherichia coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。將陽性克隆進(jìn) 行測序，測序結(jié)果在NCBI上通過BLAST進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果，得到的16SrDNA全序 列如序列表中序列1所示。以序列1所示序列與Genbank中其它相似性高、同屬芽孢桿菌不同種的參照模式 菌株進(jìn)行16SrDNA序列相似性多重序列比對(duì)，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1和圖2所 示。相似性多重序列比對(duì)結(jié)果表明本發(fā)明菌株的16SrDNA序列與多株枯草芽孢桿菌的模式 菌株的16SrDNA序列相似性很高，達(dá)99% (圖1所示)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明本發(fā)明菌株 與枯草芽孢桿菌聚在了一小支(圖2所示)，與枯草芽孢桿菌同源性最強(qiáng)。說明本發(fā)明菌株屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。綜合上述鑒定結(jié)果，表明該菌株ZLS-Ol為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 的一株新菌株，該菌株已于2009年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 3513。實(shí)施例2、菌的應(yīng)用一、菌株ZLS-Ol對(duì)病原真菌的拮抗作用實(shí)驗(yàn)方法將ZLS-Ol菌株接種于NB培養(yǎng)基，220r/min、37°C振蕩培養(yǎng)24h ；拮抗活 性測定采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，將待測病原真菌從斜面培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入PDA平板預(yù)培養(yǎng)4天，轉(zhuǎn) 接至新的PDA培養(yǎng)平板正中央，同時(shí)在真菌接種處的三個(gè)方向各3. Ocm處接入活化培養(yǎng)24h 的ZLS-Ol菌株菌液100 μ 1，28°C暗培養(yǎng)，直至出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，測定抑菌帶寬。NB培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水組成；牛肉膏在NB培養(yǎng)基中的濃度為5g/ L，蛋白胨在NB培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，NaCl在NB培養(yǎng)基中的濃度為5g/L ；NB培養(yǎng)基的 pH*7.2。牛肉膏、蛋白胨均購自北京盛旭生物公司。拮抗帶寬度的統(tǒng)計(jì)方法直尺測定拮抗帶寬度。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖3和表1所示。圖3中，A. ZLS-01和Rhizoctoniasolani ； B. ZLS-Ol和Fusarium oxysporum。培養(yǎng)皿中央為病原真菌,外側(cè)為細(xì)菌。平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果顯示，ZLS-Ol菌株對(duì)供試病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用，其拮抗帶 寬度見表1。本發(fā)明菌株ZLS-Ol對(duì)病原真菌的平板抑制作用表明，菌株向菌落周圍的培養(yǎng) 基中分泌釋放出了某種拮抗物質(zhì)，從而明顯抑制了病原菌絲的生長和發(fā)育。表 1， ZLS-Ol 對(duì)病原真菌 Fusarium oxysporum 禾口 Rhizoctonia solani 的 吉抗活 性
病原真菌抑菌帶(mm)尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum3. 7立枯絲核菌 Rhizoctonia solani10. 2二、在草莓連作栽培中使用菌株ZLS-01(一)方法草莓品種為紅顏。草莓生產(chǎn)基地為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗(yàn)基地、昌平北流果園和
昌平天翼草莓生產(chǎn)基地。本實(shí)驗(yàn)中種植草莓的方法為大棚設(shè)施栽培，每年9月份定植，陸續(xù)收獲至次年的 4、5月份。2005年前，未使用本發(fā)明菌，草莓設(shè)施栽培的每個(gè)周期中的各個(gè)栽培過程如下 每年9月份進(jìn)行種草莓田地的整理、土壤消毒、肥料的使用，目的是增加土壤肥力，減少土 壤有害生物。而后起壟、覆蓋塑料薄膜、定植草莓。草莓定植后每年9月份至次年的4、5月份進(jìn)行生產(chǎn)田間管理，植株整理、疏花疏果、陸續(xù)收獲、病蟲害綜合防治等。2005年至2007年，實(shí)驗(yàn)組使用本發(fā)明菌，草莓設(shè)施栽培的每個(gè)周期中的各個(gè)過 程，除了肥料的使用過程與上述不同，其余過程均與上述相同。菌ZLS-01是在肥料的使用 這一工作過程中基肥的使用中加以應(yīng)用。具體工作過程為將5000kg腐熟有機(jī)肥、50kg氮 磷鉀復(fù)合肥和80kg菌混合物(即ZLS-01菌體沉淀物和畜禽糞便的混合物，ZLS-01菌在混 合物中的濃度為101(lCfU/g，ZLS-01菌體沉淀物的質(zhì)量為100g)混合均勻，然后向田地進(jìn)行 撒施，并結(jié)合翻地施入土壤。菌體沉淀物按照如下方法得到的將ZLS-01菌株接種于NB培 養(yǎng)基，220r/min、37°C振蕩培養(yǎng)24h。而后8000r/min離心5min，收集沉淀，即為菌體沉淀物。腐熟有機(jī)肥為腐熟的豬廄肥。氮磷鉀復(fù)合肥購自山西省交城紅星化工有限公司。2005年至2007年，對(duì)照組對(duì)照組所用實(shí)驗(yàn)地與實(shí)驗(yàn)組在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)基地且 土壤狀況相同，不使用本發(fā)明菌、其余過程與實(shí)驗(yàn)組完全相同。( 二)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的草莓植株形態(tài)差異2005年至2007年，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用菌ZLS-01后，田間草莓植株生長健壯，葉片大而 油綠，草莓連作病害未見發(fā)生。逐步恢復(fù)和提高了草莓的產(chǎn)量，改善了草莓品質(zhì)和風(fēng)味。2005年至2007年，對(duì)照組沒有應(yīng)用菌ZLS-01的對(duì)照，田間出現(xiàn)連作病害，主要 表現(xiàn)為草莓根系腐爛、植株矮化、葉片變小等病態(tài)，到膨大期果實(shí)增大緩慢、繼而呈缺水狀、 植株萎蔫甚至死亡。產(chǎn)量沒有得到恢復(fù)，反而進(jìn)一步滑坡，有的對(duì)照產(chǎn)量跌到了每畝1000 公斤以下。上述差異說明本發(fā)明菌株抑制了連作土壤中對(duì)草莓生長有害的病菌，改善了連 作土壤微生態(tài)環(huán)境，提高了土壤的肥力，從而使草莓植株生長健壯，提高了對(duì)病害的抗性， 保障了草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)。(三)草莓產(chǎn)量自2002年起至2007年連續(xù)六年對(duì)昌平天翼草莓生產(chǎn)基地產(chǎn)量跟蹤記錄，結(jié)果 如表2，在2004-2005年產(chǎn)量有一個(gè)很明顯的低谷，主要反映了經(jīng)過連續(xù)三年種植后，由于 土壤狀況的惡化，導(dǎo)致該品種草莓重茬病害嚴(yán)重，產(chǎn)量急劇下降，經(jīng)過2005年秋季應(yīng)用菌 ZLS-01后，到2007年，草莓產(chǎn)量有了明顯的回升，基本與2002年的產(chǎn)量持平。表2、ZLS-01微生物菌劑對(duì)草莓產(chǎn)量的影響 上述產(chǎn)量結(jié)果說明本發(fā)明菌株抑制了連作土壤中的病害菌，改善了土壤的菌群 結(jié)構(gòu)，從而加速有機(jī)肥轉(zhuǎn)化，提高肥料利用率，使土壤環(huán)境利于草莓生長，進(jìn)而恢復(fù)了草莓產(chǎn)量。(四)菌株ZLS-01對(duì)土壤中微生物數(shù)量的影響方法2007年的9月份(草莓定植初期)、次年1月份(草莓生長中期)和次年4 月份(草莓生長末期)，取草莓植株根際土壤檢測其中細(xì)菌數(shù)目和放線菌數(shù)目，每次每份田 地中取樣5份(即5個(gè)重復(fù))；取一年中各檢測結(jié)果的平均值。
細(xì)菌、放線菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)方法采用平板計(jì)數(shù)法。結(jié)果如表3所示，表明使用菌株ZLS-01以后，土壤中微生物數(shù)量有明顯的改 善與對(duì)照相比，細(xì)菌總數(shù)增加了 11.2X106CfU/g-32.8X 106CfU/g，放線菌數(shù)量增加了 9.8X105CfU/g-19.0X105CfU/g，細(xì)菌總數(shù)增加更為明顯。在土壤中形成了良好的菌群結(jié) 構(gòu)，增加了益生菌群的數(shù)量，對(duì)預(yù)防和抑制土傳病害起到了積極作用。一般情況下，地力衰 竭、連作病害嚴(yán)重的土壤往往植株根際細(xì)菌、放線菌的數(shù)量呈下降趨勢，致病真菌增加。說 明本發(fā)明菌株增加了土壤中益生菌細(xì)菌、放線菌的數(shù)量，使其更加利于草莓生長。表3、ZLS-01微生物菌劑對(duì)土壤有益微生物數(shù)量的增加 (五)菌株ZLS-01對(duì)土壤物理性狀的影響此實(shí)驗(yàn)結(jié)果是昌平天翼草莓生產(chǎn)基地的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。土壤容重是指土壤在未破壞自然結(jié)構(gòu)的情況下，單位容積的干土重，以g/cm3表
7J\ o土壤物理性狀測定參照中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤物理研究室主編的《土壤 物理性質(zhì)測定法》(北京科學(xué)出版社，1978. 1 21)進(jìn)行。土壤容重采用環(huán)刀法測定，土 壤PH值采用pH儀測定，土壤有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀氧化_外加熱法測定。每年的9月份(草莓定植初期)、次年1月份(草莓生長中期)和次年4月份(草 莓生長末期)，取草莓植株根際土壤檢測進(jìn)行物理性狀檢測，每次每份田地中取樣5份(即 5個(gè)重復(fù))；取一年中各檢測結(jié)果的平均值。土壤pH值測定2005年、2006年、2007年的平均土壤pH值分別為8. 2、7. 5、7. 1 ； 表明使用菌株ZLS-013年后，土壤pH值趨向于中性，pH值從8. 2下降到7. 1，說明土壤酸 堿緩沖能力增強(qiáng)。土壤容重測定2005年、2006年、2007年的平均土壤容重分別為1. 45、1. 29、1. 25 ； 表明土壤容重呈每年遞減狀態(tài)，從1.45下降到1.25，說明隨著大量有機(jī)肥和菌株ZLS-01 的使用，土壤的透氣、透水性和保水、保肥性增強(qiáng)。土壤有機(jī)質(zhì)含量測定2005年、2006年、2007年的平均土壤有機(jī)質(zhì)含量分別為 2. 80%,2. 85%,3. 20% ；表明隨著大量有機(jī)肥和菌株ZLS-01的使用，土壤有機(jī)質(zhì)逐年提 高，從2. 80%上升到3. 20%，土壤肥力增高。土壤物理性狀的檢測結(jié)果表明，本發(fā)明菌株ZLS-01改變了土壤中的菌群結(jié)構(gòu)，使 菌群結(jié)構(gòu)利于草莓生長，改善了土壤性狀，具體是降低了土壤PH值和土壤容重，提高了土 壤有機(jī)質(zhì)含量，增強(qiáng)了土壤酸堿緩沖能力，增強(qiáng)了土壤的透氣、透水性和保水和保肥性，提 高了土壤肥力，使土壤更利于植物生長發(fā)育。(六)使用菌株ZLS-01對(duì)土壤養(yǎng)分含量的影響此實(shí)驗(yàn)結(jié)果是昌平天翼草莓生產(chǎn)基地的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
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土壤物理性狀測定參照中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤物理研究室主編的《土壤 物理性質(zhì)測定法》(北京科學(xué)出版社，1978. 1 21)進(jìn)行。堿解氮測定采用堿解擴(kuò)散法， 速效磷測定采用0. 5mol/L碳酸氫鈉浸提法，速效鉀測定采用lmol/L乙酸銨浸提-火焰光 度法。每年的9月份(草莓定植初期)、次年1月份(草莓生長中期)和次年4月份(草 莓生長末期)，取草莓植株根際土壤檢測進(jìn)行養(yǎng)分含量檢測，每次每份田地中取樣5份(即 5個(gè)重復(fù))；取一年中各檢測結(jié)果的平均值。結(jié)果堿解氮實(shí)驗(yàn)組2005年、2006年、2007年的堿解氮含量分別為135mg/Kg、150mg/ Kg、155mg/Kg。對(duì)照組2005 年、2006 年、2007 年堿解氮含量分別為 123mg/Kg、120mg/Kg、 118mg/Kg。速效磷實(shí)驗(yàn)組2005年、2006年、2007年的速效磷含量分別為135mg/Kg、147mg/ Kg、150mg/Kg。對(duì)照組2005 年、2006 年、2007 年速效磷含量分別為 109mg/Kg、109mg/Kg、 107mg/Kg。速效鉀實(shí)驗(yàn)組2005年、2006年、2007年的速效鉀含量分別為90mg/Kg、97mg/ Kg、112mg/Kg。對(duì)照組2005 年、2006 年、2007 年速效鉀含量分別為 79mg/Kg、79mg/Kg、76mg/ Kg。結(jié)果表明，連續(xù)三年使用菌ZLS-01，草莓根際土壤中的堿解氮、速效磷和速效鉀含 量都顯著增加，年均分別增加了 22. 0%,33. 0%和28. 4%。其中速效磷含量增加最明顯，年 均增加了 33. 0%;土壤速效養(yǎng)分平均提高了 27. 8%。說明本發(fā)明菌株促進(jìn)有利于草莓生長 的菌群結(jié)構(gòu)的生成，在有利菌群的作用下，土壤中的速效養(yǎng)分得以提高，對(duì)植物生長發(fā)育有 利。各年速效磷含量增加(％ )=(實(shí)驗(yàn)組中各年速效磷含量_對(duì)照組中各年速效磷 含量)/各年對(duì)照組中速效磷含量；速效磷年均增加(％) = [2005年速效磷增加(％ )+2006年速效磷增加 (% )+2007年速效磷增加(% )]/3 ；堿解氮和速效鉀的各年含量增加及年均增加(％ )與速效磷的計(jì)算公式相同。土壤速效養(yǎng)分平均增加(％ )=[堿解氮年均增加(％ ) +速效磷年均增加(％ ) + 速效鉀年均增加(%)]/3 序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120> 一株在草莓連作病害中起生防作用的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>1612<212>DNA<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>1ggggggttac gaggcagtgc aagagcatga cggcaagtgg acgattgaag agtttgatcc 60
tggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatggga120
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agaatctccagaggatcgccgggaaccgaggacgagtcgtaatcatgtcatt161權(quán)利要求
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZLS 01，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3513。
2.一種生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZLS-01CGMCC No.3513。
3.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物 菌劑在拮抗病原真菌中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述病原真菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)或立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)。
5.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物 菌劑在植物連作中的應(yīng)用。
6.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物 菌劑在防治植物連作病害中的應(yīng)用。
7.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生 物菌劑在改善植物連作土壤中菌群結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用；或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZLS-OICGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物菌劑在改善植物連作土壤微生態(tài)環(huán)境中的應(yīng) 用。
8.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物 菌劑在增加植物連作土壤中利于植物生長的細(xì)菌數(shù)目和利于植物生長的放線菌數(shù)目中的 應(yīng)用；或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZLS-01CGMCC No. 3513或權(quán)利要求2所述生物 菌劑在降低植物連作土壤的PH值、降低植物連作土壤的土壤容重和/或增加植物連作土壤 中的有機(jī)質(zhì)含量中的應(yīng)用；或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZLS-01CGMCC No. 3513或 權(quán)利要求2所述生物菌劑在增加植物連作土壤中的堿解氮、速效磷和/或速效鉀中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為草莓。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述連作土壤為連作2茬以上 的土壤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株在草莓連作病害中起生防作用的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。該枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZLS-01，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3513。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明菌株對(duì)病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)或立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)具有拮抗作用，可抑制病害。本發(fā)明菌劑，可增加土壤中優(yōu)勢菌的數(shù)量，對(duì)預(yù)防和抑制土傳病害起到了積極作用；本發(fā)明菌劑能降低土壤pH值，使其趨向于中性，pH值從8.2下降到7.1，使土壤酸堿緩沖能力增強(qiáng)；增強(qiáng)土壤的透氣性、透水性、保水性和保肥性；還使土壤有機(jī)質(zhì)逐年提高，從2.80％上升到3.20％，增高土壤肥力；使草莓根際土壤堿解氮、速效磷和速效鉀都顯著增加。本發(fā)明菌劑能抑制草莓重茬病害，保障草莓產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12R1/125GK101892173SQ201010034439
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者張潞生 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)