專利名稱：人核型簇蛋白及其載體與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人簇蛋白在治療癌癥中的應用，尤其涉及一種人核型簇蛋白，以及載有該蛋白或相應基因的載體在癌癥治療和對癌細胞生物學行為研究中的應用。
背景技術(shù)：
簇蛋白，Clusterin是一種多功能的蛋白質(zhì)，在不同的病理、生理過程中 起到重要的作用。由于選擇性剪接的結(jié)果，Clusterin有兩種主要的亞型分泌型 Clusterin (secreted clusterin, sCLU)禾口核型 Clusterin (nuclearclusterin,nCLU)。sCLU 有細胞保護作用，而nCLU卻在細胞核中堆積，可導致細胞死亡。sCLU是Clusterin的主要形式，由TRPM-2單拷貝基因表達，定位于8p21_pl2染 色體上，序列全長1651個堿基，共編碼449個氨基酸組成的異二聚體硫酸化糖蛋白，兩個亞 單位α和β鏈分子量均為40KDa;nCLU是將Clusterin進行選擇性剪接后而得的產(chǎn)物， 無第II外顯子(exon)，而由第I外顯子和第III外顯子相連接而成。與sCLU蛋白相比， nCLU缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶引導肽，不分離為α鏈和β鏈，而且蛋白序列上也沒有經(jīng)過廣泛的糖基 化(glycosylation)。Clusterin幾乎在人體所有組織中都有分布，在惡性腫瘤中也同樣不 例外。研究表明Clusterin在前列腺癌、腎癌、膀胱癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋 巴瘤和肺癌等均表現(xiàn)出表達上調(diào)，而在食管鱗癌組織中則為表達下調(diào)。Clusterin可作為 許多惡性腫瘤的預后因子來預測腫瘤患者的預后，在腎細胞癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌中， Clusterin高表達患者的總體生存率低；而在非小細胞肺癌和胰腺癌中，Clusterin表達 陽性的患者卻有更長的生存期(Cancer EpidemiolBiomarkers Prev.，200716，1845-51)。 另有研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤中隨著其惡性程度的增高，存在nCLU表達缺失，sCLU表達 反而上升的現(xiàn)象，這表明Clusterin在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能起著重要的作用。 Clusterin與惡性腫瘤關(guān)系密切，Clusterin可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用 (Oncogene.，2004，23，2298-304)。細胞增殖與細胞周期密切相關(guān)。在前列腺癌細胞中，Clusterin高表達可使Gtl/ G1期細胞比例增加，并使細胞周期進展緩慢，DNA合成下降，且細胞增殖緩慢(Oncogene.， 2002，21，4328-34) ；nCLU 可以通過 cyclinBl/細胞周期依賴型激酶 1 (cyclin B1/CDK1) 途徑使細胞阻滯在G2/M期，并使細胞凋亡率增加(Cancer Res.，2004，64，6174-82)；而 sCLU的過度表達并不影響細胞的增殖(Cancer Res.，2007，67，10325-33)。也有學者認為， Clusterin可以抑制前列腺正常細胞的增殖(中華實驗外科雜志，2001，18，415-417)。遷移和侵襲是腫瘤細胞的惡性表現(xiàn)之一。過度表達sCLU和nCLU均使正常前 列腺上皮細胞活動力降低，而在腫瘤細胞中，只有nCLU過度表達可使活動力下降，進一 步研究發(fā)現(xiàn)nCLU是通過結(jié)合α肌動蛋白來影響其活動力，nCLU是α肌動蛋白的一種 “分子伴侶”(Cancer Res.，2007，67，10325-33)。研究證明，MT6-MMP (Membrane-type 6 matrixmetalloproteinase)是金屬蛋白酶中膜型家族的一員，對于腫瘤細胞的侵襲起到重 要的作用。內(nèi)源性的sCLU蛋白可以作為MT6-MMP的負性調(diào)節(jié)因子，對降解細胞基質(zhì)中有重要的功能(J Biol. Chem.，2003，278，36350-7)。目前，尚沒有任何研究證明外源nCLU具有抑制腫瘤細胞增殖，并可使細胞的運動 遷移、侵襲能力明顯減弱，從而能對治療肺癌起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種人核型簇蛋白，在癌癥治療中的應用。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種人核型簇蛋白的載體，該載體能將人核型簇蛋 白輸送到細胞中。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種含有人核型簇蛋白表達載體的細胞，用于研究 人簇蛋白對癌細胞生物學行為的作用機制。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種人核型簇蛋白表達載體，以及含有該載體的細 胞在癌癥治療中的應用。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供的人Clusterin基因為人核型Clusterin基因，人核型Clusterin基 因包括SEQ ID No :1及其簡并序列，還包括與SEQ ID No :1及其簡并序列具有40%以上同 源性的序列。這些同源序列優(yōu)先選擇與SEQID No :1及其簡并序列具有50%以上同源性的 序列，更優(yōu)先選擇的具有60%、70%或80%以上同源性的序列，最優(yōu)先選擇的具有90%以 上同源性的序列。本發(fā)明中，優(yōu)選選擇SEQ ID No 1所示的序列，該序列相應的蛋白序列如SEQ ID No 2所示(即人Clusterin序列34-449氨基酸殘基)。本發(fā)明中，蛋白nCLU包括SEQ ID No 2及其突變蛋白，還包括具有與SEQ ID No 2及其突變蛋白40%以上同源性的序列。這些同源序列優(yōu)先選擇與SEQ ID No :2具有50% 以上同源性的序列，更優(yōu)先選擇的具有60%、70%或80%以上同源性的序列，最優(yōu)先選擇 的具有90%以上同源性的序列。本發(fā)明突變蛋白優(yōu)先采用對nCLU序列進行“保守性”取代。nCLU蛋白的保守性氨 基酸取代可包括一組內(nèi)的同義氨基酸取代，同組氨基酸內(nèi)的氨基酸具有足夠相似的生理生 化特性，該組成員之間的取代將保留該分子的生物功能(Science，1974，185，862-4)。在上 述序列中也可進行氨基酸的插入或/和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失 只涉及少數(shù)氨基酸時，如30個以下，最好為10個以下，而且不除去或取代對功能性構(gòu)型起 關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失或/和插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。優(yōu)先選擇的，本發(fā)明同義氨基酸對nCLU進行保守性取代的方式。
氨基酸_同義氨基酸_
SerSer, Thr, Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu, His
LeuIle，Phe, Tyr，Met，Val, Leu
ProGly，Ala, Thr，ProThrPro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
AlaGly, Thr，Pro, Ala
ValMet，Tyr, Phe，lie, Leu, Val
GlyAla, Thr，Pro, Ser, Gly
lieMet, Tyr，Phe, Val，Leu，lie
PheTrp，Met, Tyr，lie, Val, Leu，Phe
TyrTrp，Met, Tyr，lie, Val，Leu, Phe
CysSer，Thr，Cys
HisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln，Lys，Gln，Thr，Arg，His,
Gln
Asn
AsnGin, Asp，Ser, Asn
LysGlu，Gln，His，Arg，Lys
AspGlu, Asn，Asp
Asp, Lys，Asn, Gin, His, Arg，
Glu
Glu
Met Phe，lie, Val, Leu，Met _Trp_Trp_更優(yōu)先選擇的，本發(fā)明同義氨基酸對nCLU進行保守性取代的方式。
氨基酸_同義氨基酸_
SerSer
ArgArg，Lys，His
LeuIle，Phe，Met, Leu
ProAla, Pro
ThrThrAla Pro，Ala
ValMet, lie, Val
GlyGly
lieMet, Leu，Phe，Val，lie
PheTrp, Met, Tyr, lie, Leu，Phe
TyrTyr，Phe
CysSer, Cys
HisGln，Arg，HisGlnGlu，Gln，His
AsnAsp, Asn
LysArg，LysAspGlu, Asn, Asp
GluGln，Glu
Met Phe，lie, Val，Leu, Met _Irp_Trp_
最優(yōu)先選擇的，本發(fā)明同義氨基酸對nCLU進行保守性取代的方式。
氨基酸_同義氨基酸_
SerSer
ArgArg
Leulie，Met, Leu
ProPro
ThrThr
AlaAla
ValVal
GlyGly
lieMet, Leu，Phe，Val, liePheMet, Tyr，lie, Leu, Phe
TyrTyr, Phe
CysSer, Cys HisGln，Arg, His GlnGlu，Gln，His AsnAsp，Asn LysArg，Lys AspGlu，Asn，Asp GluGln，Glu MetPhe, lie, Val，Leu, Met _Trp_Trp_在對本發(fā)明nCLU進行取代而獲得突變蛋白過程中，進一步優(yōu)先選擇對SEQ ID No 2序列中的核定位序列不予取代的方式進行。這些序列如=Leu-Glu-Glu-Ala-Lys-Lys-L ys-Lys(艮口人 clusterin 序歹Ij 74—81 氛基酸殘基)、Arg-Arg-Glu-Leu-Asp-Glu-Ser-Leu-Gln-Val-Ala-Glu-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys (即人 clusterin 序列 324-340 氨基酸殘基)和 Arg-Lys-Lys-His-Arg (即人 clusterin 序列 442-446 氨基酸殘基)。本發(fā)明所述的人簇蛋白包括nCLU蛋白，優(yōu)先選擇人核型簇蛋白34-449，即SEQ ID No 2所示的序列。
為具備蛋白質(zhì)、多肽或核酸等大分子輸送知識的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知， 各種載體，如但不僅限于，脂質(zhì)體、聚合物和表達載體等，都可以作為人簇蛋白及其核酸的 輸送載體而送入細胞內(nèi)。本發(fā)明中，人簇蛋白納米粒也屬于本發(fā)明的范圍?！N本發(fā)明提供的人核型簇蛋白真核表達載體包括多克隆位點、人Clusterin 基因、標記基因、終止信號PolyA基因、啟動子(promoter)，還包括內(nèi)部核糖體插入位點 (internal ribosome entry site, IRES)基因、復制起點(Ori)基因和增強子(enhancer)。具體的，本發(fā)明提供的人簇蛋白真核表達載體含有ColEl復制起點、取自于SV40 的PolyA信號、合成內(nèi)含子、氨芐青霉素抗性基因、潮霉素磷酸化酶基因、人巨細胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)啟動子、衍生自腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, ECMV)的 IRES 和人 Clusterin 基因。另一種本發(fā)明提供的人簇蛋白真核表達載體，由pIREShyg3載體和人Clusterin 基因組成，即在pIREShyg3載體上插入人Clusterin基因。該基因與載體的連接采用BamH I和Not I雙酶切方式進行。本發(fā)明中，各種nCLU蛋白可以根據(jù)其氨基酸序列得到相應的人核型Clusterin基 因序列及其簡并序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過篩選具有抑制癌細胞增殖的、減弱細 胞運動遷移能力或明顯減弱侵襲能力的nCLU蛋白，推知相應的人核型Clusterin基因序列 及其簡并序列，從而選擇適合特定癌癥細胞的載體進行蛋白或基因的輸送。 本發(fā)明提供的含有人Clusterin基因的真核表達載體，轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌A549細 胞后，得到穩(wěn)定克隆A549-nCLU細胞能表達人nCLU蛋白。這些A549-nCLU細胞與對照組相比生長緩慢，流式細胞儀分析細胞周期，顯示轉(zhuǎn) 染了核型Clusterin基因的細胞GcZG1期比例增多，而S期比例減少，使得細胞增殖受到抑 制。表達的nCLU蛋白能與細胞質(zhì)中的α肌動蛋白相結(jié)合，使Α549細胞的遷移力明顯 減弱。A549-nCLU穿過人工膜的數(shù)量顯著減少，侵襲力減弱了 47. 3% (P < 0. 05)，且差異具 有統(tǒng)計學意義，表明核型Clusterin基因的轉(zhuǎn)入能減弱A549細胞的侵襲能力。nCLU在非小細胞肺癌A549細胞中屬于表達上調(diào)的蛋白。核型Clusterin上調(diào)表 達對在該腫瘤細胞具有明顯的抑制增殖、減弱細胞運動遷移和侵襲能力的作用。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以得知，在nCLU同樣表現(xiàn)出表達上調(diào)的其它癌癥，如前列腺癌、腎癌、膀胱癌等 泌尿系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和淋巴瘤，本發(fā)明真核表達載體也能具有明顯抑制腫瘤細胞 增殖，并且也可使細胞的運動遷移、侵襲能力明顯減弱的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)特定癌 組織或細胞選擇其它真核表達載體作為輸送人核型Clusterin基因的載體以更有利于在 相應組織和細胞中表達亦屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明提供的含有人Clusterin基因的真核表達載體能用于癌癥治療，尤其是 nCLU表達上調(diào)的癌癥的治療當中。本發(fā)明提供的含有人Clusterin基因的真核表達載體更 適合用于非小細胞肺癌的治療當中。此外，該載體及其含有該載體的細胞，還能應用于人簇 蛋白對癌細胞生物學行為的作用機制研究當中。本發(fā)明技術(shù)方案實現(xiàn)的有益效果本發(fā)明提供了一種人核型簇蛋白及其載體，所述載體中含有人核型Clusterin基 因或人核型簇蛋白。轉(zhuǎn)染有人核型Clusterin基因表達載體的非小細胞肺癌A549細胞的增殖受到明顯抑制，且細胞運動遷移和侵襲能力亦明顯減弱，表明人核型簇蛋白及其該表 達載體能用于癌癥的治療。本發(fā)明轉(zhuǎn)染有人簇蛋白表達載體的細胞，能用于研究人簇蛋白對癌細胞生物學行 為的作用機制。本發(fā)明所述的術(shù)語與其一般概念相同。所述的“突變蛋白”指將人核型簇蛋白序列上的一個或多個氨基酸殘基進行替換、 增加或/和缺失后得到的同源蛋白。其中天然人核型簇蛋白的一個或多個氨基酸殘基被不 同氨基酸殘基所替換，或缺失，或者人核型簇蛋白的天然序列中加入了一個或多個氨基酸 殘基，但所產(chǎn)生的同源蛋白的活性與天然人核型簇蛋白相比無顯著降低，甚至有提高。這些 突變蛋白的活性可用各種篩選技術(shù)與以實現(xiàn)，如丙氨酸掃描(Alanine Scan)進行點突變 和組合化學等，這些突變蛋白可用已知的合成和/或定點誘變技術(shù)，或任何適合的其它已 知技術(shù)制備。本發(fā)明人核型簇蛋白優(yōu)先選擇nCLU，更優(yōu)選SEQ ID No :2所示的序列。所述的“同源性”是反應兩個或多個蛋白/多肽序列或兩個或多個核苷酸序列之 間的關(guān)系，通過比較這些序列而確定。通常，同源性指所比較的序列長度上兩個多核苷酸或 兩個蛋白/多肽序列，它們的核苷酸與核苷酸或者氨基酸與氨基酸之間的對應是完全一樣 的。對于那些與所述人核型Clusterin基因或人核型簇蛋白對應不是完全一樣的序 列，需要通過“同源性百分比”進行確定。通常把待比較的兩個序列進行對比，得出這兩個序 列之間的最大相關(guān)性。這可包括在其中一個或兩個序列中插入“空格”以增加對比度。比 較每一個序列的整個長度，或者比較它們的較短的限定長度，可確定同源性百分比，前者特 別適合長度相等或長度差不多的序列，或者更適合長度不相等的序列。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，兩個或多個序列同源性的比較方法已為他們所熟知， 例如BLAST和FASTA程序。本發(fā)明中，所述的40 %、50 %、60 %、70 %、80 %和90 %均為同 源性百分比。所述的“非小細胞肺癌”是nCLU上調(diào)表達的癌癥，也包括nCLU上調(diào)表達的其它癌 癥，如但不僅限于，前列腺癌、腎癌、膀胱癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。所述的“癌癥治療”，包括基因治療，可治療或改善癌癥及其所引起的紊亂和病 癥?；蛑委熓菍⒛繕薉NA、含目標DNA的載體以及含目標DNA的表達載體轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或輸 送(gene delivery)到細胞中，從而依據(jù)目標DNA表達出相應蛋白(Crit. Rev. Biotech., 1992，12，335-56)或使目標DNA與細胞中DNA/RNA互補結(jié)合以阻止蛋白的表達的各種方法。 基因治療包括將DNA序列導入體細胞或種系細胞以用于體外(exvivo)或體內(nèi)(in vivo) 治療。本發(fā)明目標DNA是所表達的nCLU蛋白具有抑制癌細胞增殖的、減弱細胞運動遷移 能力或明顯減弱侵襲能力的一段核苷酸序列。為了能與表達載體連接而在細胞中表達，該 核苷酸序列中還可以包括被核苷酸酶識別并酶切的序列，這些核酸酶如但不僅限于，BamH I、Not I, Nco I和Nsi I。這些用于酶切的序列通常設(shè)于核苷酸序列的兩端。用于基因治療的方法包括物理方式(如電擊穿孔、直接基因轉(zhuǎn)導/轉(zhuǎn)化和)、化 學方式(如脂質(zhì)載體或非病毒載體)和生物學方式(如病毒衍生載體和受體攝取)。可 以使用的非病毒載體，如但不僅限于，含有目標DNA的脂質(zhì)體、含有目標表達載體的脂質(zhì)體，以及共價或非共價結(jié)合有目標DNA的聚合物，如聚賴氨酸、聚乙二胺和dendrimer等。 這類攜帶有DNA的脂質(zhì)體或聚合物可直接靜脈注射到患者體內(nèi)。此外，目標DNA或含有目 標DNA的載體可直接輸送到病變器官、組織或腫瘤中，或?qū)δ繕薉NA或含有目標DNA的載體 進行修飾后，如但不僅限于，在脂質(zhì)體表面連接RGD識別分子，再輸送到病變器官、組織或 腫瘤中，以實現(xiàn)目標DNA的靶向輸送。體內(nèi)基因輸送涉及在細胞位于患者體內(nèi)時將目標DNA導入患者細胞。方法包括使 用病毒介導的基因轉(zhuǎn)移，其中使用非感染性病毒將目標DNA輸送到患者體內(nèi)，或注射到患 者體內(nèi)某部位并由一定百分比的細胞攝取，在該細胞中表達目標DNA相應的蛋白質(zhì)。此外， 使用物理的或化學的方式，也可以將目標DNA輸送到體內(nèi)?；瘜W方法包括化學物質(zhì)結(jié)合細胞或/和運送DNA穿過細胞膜，如但不僅限于，月旨 質(zhì)體、促融合脂質(zhì)囊泡、脂轉(zhuǎn)染試劑或多聚賴氨酸攜帶的DNA輸送。受體吞噬作用涉及使用 特定配體細胞表面受體并將它包裹和轉(zhuǎn)運穿過細胞膜。配體結(jié)合目標DNA，而進入細胞。病毒載體也可用于將目標DNA導入體內(nèi)細胞(Goodman & Gi Iman，sThe Pharmacological Basis ofTheraputics，1996，77-101)。為了指導外來基因的組織特異性 表達，可使用已知具有組織特異性的順式作用調(diào)控原件或啟動子。


圖1為pGEM-CLU PCR產(chǎn)物電泳圖；其中泳道1為分子量標記(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2為全長的Clusterin基因；圖2為全長Clusterin片段及核型Clusterin片段電泳圖；其中泳道1為分子 量標記(Marker)DL2000 (Takara公司)，泳道2為全長的Clusterin基因，泳道3為核型 Clusterin 基因；圖3為pIRES-full及pIREShyg3酶切電泳圖；其中泳道1為分子量標記(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2為含全長Clusterin基因的真核表達質(zhì)粒，泳道3為 pIREShyg3 空載體；圖4為PCR、pIRES-nCLU酶切及三個真核表達質(zhì)粒(pIREShyg3、pIRES-full和 pIRES-nCLU)電泳圖；其中泳道1為分子量標記(Marker) DL2000 (Takara公司)，泳道2和 泳道3為pIRES-nCLU經(jīng)PCR后的電泳，泳道4和泳道5為pIRES-nCLU酶切后的電泳圖，泳 道6為pIREShyg3質(zhì)粒電泳圖，泳道7為pIRES-full質(zhì)粒電泳圖，泳道8為pIRES-nCLU質(zhì) 粒電泳圖；圖 5 為 A549、A549-hyg 和 A549-nCLU 三種細胞 Western blot 結(jié)果；圖中，數(shù)字 49，000、40，000和36，000表示分子量標記；圖6為A549、A549-hyg和A549_nCLU三種細胞生長曲線圖；圖7為A549、A549_hyg和A549_nCLU三種細胞遷移能力圖；圖8為A549、A549_hyg和A549_nCLU三種細胞侵襲能力圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，可參考自《分子克隆》一書(J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學出版社，1994)。該書及其后續(xù)出版版本是 本領(lǐng)域技術(shù)人員在進行與分子生物學相關(guān)的實驗操作時最常用的具有指導性的參考書籍。 此外，根據(jù)不同實驗目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在各種商品化試劑盒(Kit)所附帶的操作手冊 的指導下完成相應的實驗或委托專業(yè)化的公司進行，如基因測序、質(zhì)粒測序和確定分子量寸。本發(fā)明實施例中，人非小細胞肺癌A549細胞由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗 室提供；pIREShyg3真核表達質(zhì)粒購自Clontech公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和 潮霉素B為Invitrogen公司產(chǎn)品；鼠抗人Anti-Clusterin單克隆抗體(clone 41D)購自 Upstate Biochemicals 公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒為 Dojindo Molecular Technologies Inc公司產(chǎn)品；Transwell小室(孔徑8um)和Matrigel膠購自BD公司。本發(fā)明實施例其它所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪一奧德里奇 (Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明實施例所涉及的統(tǒng)計學方法，均應用SPSS 16. O統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均 數(shù)士標準差表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。實施例1 nCLU真核表達載體的構(gòu)建用引物對5'-GACTCCAGAATTGGAGGCATG-3 和 5‘ -ATCTCACTCCTCCCGGTGCT-3 ‘， 從肝癌SMMC7721cDNA文庫中用PCR方法擴增出人全長的Clusterin_cDNA，將 Clusterin-cDNA連接到pGEM-T Easy載體(Promega公司，技術(shù)手冊TM042)中，得到質(zhì)粒 pGEM-CLU。再以pGEM-CLU 為模板用引物對5 ‘ -GGCGGCCGCGGGGATCCGAT-3 ‘禾口 5 ‘ -GACCTGCAGGCGGCCGCGAAT-3 ‘擴增出全長 Clusterin 基因 Cluster in-full (見 圖1)，并將其連接到pIREShyg3真核表達質(zhì)粒的BamHI和Not I酶切位點中，得到質(zhì)粒 pIRES-full。再以pIRES-full 質(zhì)粒為模板，用引物對5' -GTCTCAGACAATGGGATCCAGGA-3‘禾口 5' -GACCTGCAGGCGGCCGCGAAT-3‘經(jīng) PCR 擴增出核型 Clusterin 基因 Clusterin-in(見圖 2)，將Clusterin-in基因連接到pIREShyg3質(zhì)粒的BamH I和Not I酶切位點中，得到核型 Clusterin 真核表達載體 pIRES-nCLU。通過PCR、雙酶切和DNA測序等對目的質(zhì)粒進行鑒定。進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒 定，結(jié)果見圖3和圖4。從圖可以看出，質(zhì)粒被BamH I和Not I酶切后分離出兩條帶，與插 入的PCR片段和空載體酶切片段大小一致。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿公司測序，將測 序結(jié)果與Clusterin基因序列比對，結(jié)果證實插入的基因序列確實為正確的基因序列，且 閱讀框正確。實施例2重組Clusterin蛋白的表達檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細胞篩選用Lipofectamine 2000 Reagent 將空載體 pIREShyg3 及重組質(zhì)粒 pIRES-nCLU 轉(zhuǎn) 染A549細胞。按120ug/ml濃度加入潮霉素B進行篩選。經(jīng)3_4周持續(xù)篩選后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 pIREShyg3空載體和pIRES-nCLU重組質(zhì)粒的A549細胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 pIREShyg3 空載體的A549細胞命名為A549-hyg ；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 pIRES-nCLU重組質(zhì)粒的A549細胞命名 為 A549-nCLU。Western blot 檢測 Clusterin 蛋白的表達用冰PBS (pH7. 4)洗細胞3次，加入細胞裂解液，于冰上裂解細胞30分鐘，測定蛋 白濃度。取70μ g蛋白做10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟 乙烯(PVDF)膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉2小時，1 500的Clone 41D單克隆抗體 4°C孵育過夜，和羊抗鼠IgGl 1000孵育2小時，ECL顯色，X膠片曝光，顯影定影記錄條帶 (見圖5)。結(jié)果顯示A549-nCLU細胞在相當于pnCLU蛋白的49_50kDa處表達顯著，而作為 對照的A549和A549-hyg，兩者的細胞裂解物中均無核型Clusterin蛋白的表達。由于全長 的sCLU在經(jīng)二硫鍵裂解后成為α和β鏈，兩條鏈均為40kDa，而sCLU在肺癌細胞中是高 表達的，可以看出三種細胞均在40kDa處有差不多相同的sCLU表達。實施例3細胞形態(tài)與增殖CCK8檢測細胞增殖情況按2000個/孔的濃度將處于對數(shù)期的細胞接種至96孔板，每組設(shè)6個復孔，待細 胞貼壁后，于24、48、72、96、120小時后加入10 μ 1CCK-8溶液，5% CO2 37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育 3小時；用自動酶標儀在450nm波長處，測定各孔的OD值。最后取各樣本的平均值并繪制 生長曲線(見圖6)。圖6中，轉(zhuǎn)染了 pIREShyg3空載體的A549細胞和未轉(zhuǎn)染的A549細胞，兩者外觀上 并無明顯區(qū)別，生長狀態(tài)良好，分裂旺盛，生長曲線并無明顯差異(各時間點p>0. 05)。而 轉(zhuǎn)染了 pIRES-nCLU質(zhì)粒的A549細胞的形態(tài)與前兩者相比具有明顯不同，培養(yǎng)過程中細胞 容易漂起，許多細胞中出現(xiàn)空泡，培養(yǎng)液中有大量細胞碎片，生長緩慢，生長曲線與前兩者 相比有明顯不同(各時間點P < 0.05)。這表明，高表達核型Clusterin蛋白可明顯抑制 A549細胞的生長。實施例4細胞周期分布的檢測流式細胞術(shù)檢測細胞周期細胞首先在無血清培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)48小時，加入 正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時，消化收集細胞，95%乙醇冰上固定1小時，PBS洗滌細胞2次 并重懸于 300-500 μ 1 的 PBS 中(其中含 20ug/ml RNaseA,0. 2% Triton X_100、0. 2mM EDTA 和20μ g/mlPropidium Iodide)，并將其置于37°C的水浴中溫浴15-30分鐘，流式細胞儀 (BD公司)檢測細胞的DNA含量，并以儀器中的Modfit程序進行人工校正。 轉(zhuǎn)染了核型Clusterin的A549細胞較轉(zhuǎn)染了 pIREShyg3空載體的A549細胞相比， GcZG1期細胞比例增多了約 29%，分別為(63. 31 士4. 30) %和(33. 54士 2. 10) %，而 A549_hyg 和ASAgGcZG1期相比并無明顯差異，分別為(33. 67士0. 77) %和(33. 54士2. 10)%。這表明， 核型Clusterin基因轉(zhuǎn)染后細胞生長受到明顯抑制，大量細胞阻滯在GtlAi1期，使得細胞生 長緩慢。實施例5 核型Clusterin對A549細胞遷移和侵襲的影響體外遷移能力的測定按lX105/ml的濃度將處于對數(shù)期的細胞用無血清1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，取IOOul加入Transwell上室(1 X IO4個細胞)，下室加入600ul含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基；5% C023 7°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時后，取出Transwell上室，用棉拭子擦除小室上層 的細胞后HE染色。于400倍光鏡下，隨機選取5個視野計數(shù)細胞，取平均值作為細胞體外 趨化性遷移能力的強弱，結(jié)果見圖7。體外侵襲能力的測定按1 6的比例混合Matrigel和無血清1640培養(yǎng)基制備成人工基底膜；于上室 加入50ul的混合液，37°C孵育4小時以使其凝固；按lX106/ml的濃度將處于對數(shù)期的三 種細胞用無血清1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，于上室中加入IOOul的細胞懸液(IX IO5個細 胞)，下室加入600ul含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48小時。取出Transwell 上室，用棉拭子擦除小室上層的細胞后HE染色。于400倍光鏡下，隨機選取5個視野計數(shù) 細胞，取平均值作為細胞體外趨化性遷移能力的強弱，結(jié)果見圖8。圖7中，轉(zhuǎn)染了核型Clusterin后的A549_nCLU遷移較A549和A549_hyg有明顯 減弱，減少了 68. 5% (P<0. 05)，具有統(tǒng)計學差異(P < 0. 05)，說明上調(diào)核型Clusterin的 表達可以顯著降低A549細胞自身的運動能力。圖8中，與對照組相比，A549-nCLU穿過人工膜的數(shù)量顯著減少，侵襲力減弱了 47. 3% (P<0. 05)，差異具有統(tǒng)計學意義，說明核型Clusterin基因的轉(zhuǎn)入能減弱A549細 胞的侵襲能力。序列表<110> 李鶴成<120>人核型簇蛋白及其載體與應用<130>BLH. HF. 9001<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>SEQ ID No 1<211>1251<212>DNA<213> 人核型 Clusterin 基因<400>1atgtccaatc agggaagtaa gtacgtcaat aaggaaattc aaaatgctgt caacggggtg 60aaacagataa agactctcat agaaaaaaca aacgaagagc gcaagacact gctcagcaac 120ctagaagaag ccaagaagaa gaaagaggat gccctaaatg agaccaggga atcagagaca 180aagctgaagg agctcccagg agtgtgcaat gagaccatga tggccctctg ggaagagtgt 240aagccctgcc tgaaacagac ctgcatgaag ttctacgcac gcgtctgcag aagtggctca 300ggcctggttg gccgccagct tgaggagttc ctgaaccaga gctcgccctt ctacttctgg 360atgaatggtg accgcatcga ctccctgctg gagaacgacc ggcagcagac gcacatgctg 420gatgtcatgc aggaccactt cagccgcgcg tccagcatca tagacgagct cttccaggac 480aggttcttca cccgggagcc ccaggatacc taccactacc tgcccttcag cctgccccac 540cggaggcctc acttcttctt tcccaagtcc cgcatcgtcc gcagcttgat gcccttctct 600ccgtacgagc ccctgaactt ccacgccatg ttccagccct tccttgagat gatacacgag 660
gctcagcagg ccatggacat ccacttccac agcccggcct tccagcaccc gccaacagaa 720ttcatacgag aaggcgacga tgaccggact gtgtgccggg agatccgcca caactccacg 780ggctgcctgc ggatgaagga ccagtgtgac aagtgccggg agatcttgtc tgtggactgt 840tccaccaaca acccctccca ggctaagctg cggcgggagc tcgacgaatc cctccaggtc 900gctgagaggt tgaccaggaa atacaacgag ctgctaaagt cctaccagtg gaagatgctc 960aacacctcct ccttgctgga gcagctgaac gagcagttta actgggtgtc ccggctggca 1020aacctcacgc aaggcgaaga ccagtactat ctgcgggtca ccacggtggc ttcccacact 1080tctgactcgg acgttccttc cggtgtcact gaggtggtcg tgaagctctt tgactctgat 1140cccatcactg tgacggtccc tgtagaagtc tccaggaaga accctaaatt tatggagacc 1200gtggcggaga aagcgctgca ggaataccgc aaaaagcacc gggaggagtg a1251<210>SEQ ID No 2<211>416<212>PRT<213> 人核型 Clusterin 蛋白 34-449<400>1Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu lie Gln Asn Ala Val151015Asn Gly Val Lys Gln lie Lys Thr Leu lie Glu Lys Thr Asn Glu Glu Arg202530Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys Lys Glu Asp Ala35404550Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys Glu Leu Pro Gly Val556065Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu Cys Lys Pro Cys Leu Lys70758085Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu9095100Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe105110115Trp Met Asn Gly Asp Arg lie Asp Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln120125130135Thr His Met Leu Asp Val Met Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser lie140145150lie Asp Glu Leu Phe Gln Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr155160165170Tyr His Tyr Leu Pro Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe175180185Pro Lys Ser Arg lie Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro
190195200
Leu Asn Phe His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met lie His Glu Ala205210215220Gln Gln Ala Met Asp lie His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro225230235Thr Glu Phe lie Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu lie240245250255Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys Cys260265270Arg Glu lie Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln Ala Lys275280285Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg Leu Thr Arg290295300305Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met Leu Asn Thr Ser310315320Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser Arg Leu Ala325330335340Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu Arg Val Thr Thr Val Ala345350355Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser Gly Val Thr Glu Val Val Val360365370Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro lie Thr Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser375380385 390Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu395400405Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu Glu41041權(quán)利要求
一種包括nCLU蛋白的人核型簇蛋白，在癌癥治療中的應用。
2.一種人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于包括多克隆位點、人Clusterin基因、 標記基因、啟動子和終止信號polyA基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于所述真核表達載體 還包括復制起點基因和內(nèi)部核糖體插入位點基因。
4.一種人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于包括ColEl復制起點、取自于SV40的 PolyA信號、合成內(nèi)含子、氨芐青霉素抗性基因、潮霉素磷酸化酶基因、人巨細胞病毒啟動 子、衍生自腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體插入位點和人Clusterin基因。
5.一種人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于由pIREShyg3載體和人Clusterin基 因組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5之一所述的人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于所述的人 Clusterin基因為SEQ ID No 1及其簡并序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-5之一所述的所述的人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于所述 的人Clusterin基因與所述SEQ ID No :1及其簡并序列具有40%、50%、60%、70%、80% 或90%以上同源性的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于與所述的SEQID No 1及其簡并序列相應的蛋白為nCLU。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人核型簇蛋白真核表達載體，其特征在于所述的nCLU包括 SEQ ID No 2及其突變蛋白。
10.一種含有權(quán)利要求2-7之一所述的人核型簇蛋白真核表達載體的細胞，在人簇蛋 白對癌細胞生物學行為作用機制研究中的應用。
11.一種權(quán)利要求2-7之一所述的人核型簇蛋白真核表達載體，在癌癥治療中的應用。
全文摘要
一種包括nCLU蛋白的人核型簇蛋白。該簇蛋白的真核表達載體包括多克隆位點、復制起點基因、人Clusterin基因、啟動子、標記基因和終止信號polyA等基因。將表達載體轉(zhuǎn)染癌癥細胞后，能使細胞增殖受到抑制，且細胞運動遷移和侵襲能力亦明顯減弱，這表明人核型簇蛋白及其表達載體能用于癌癥的治療。
文檔編號C12N5/10GK101816779SQ20101002303
公開日2010年9月1日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者李鶴成 申請人:李鶴成