專利名稱：：在過氧化物酶存在下增加纖維素材料酶法水解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于增加用酶組合物進(jìn)行的纖維素材料水解的方法。相關(guān)技術(shù)纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4_鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β_連接葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，使其對纖維二糖水解酶的攻擊開放。纖維二糖水解酶接著從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-連接二聚體。β-葡糖苷酶水解纖維二糖為葡萄糖。本領(lǐng)域公知生物分子如DNA、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的氧化在生物系統(tǒng)中是顯著的問題。因此，過氧化物酶處理可改善纖維素水解酶系統(tǒng)的性能。不同的過氧化物分解酶常常具有不同的特異性和效力。舉例而言，過氧化氫酶僅在高水平的過氧化氫下非常有效，這是因?yàn)槠鋵υ撐镔|(zhì)的高M(jìn)ichaelis常數(shù)Km(Km范圍為0.1至IM；參見Nicholls等，2001，AdvancesinInorg.Chem.51:52_106；和Masaki等，1998,ArchivesofDermatologicalResearch290:113-118)。在低過氧化物水平,過氧化物酶可(與過氧化氫酶相比)顯著地更加有效于分解過氧化物，這是因?yàn)樵撁笇^氧化物較高的親和力(亞mM范圍)。舉例而言，辣根過氧化物酶，一種原型過氧化物酶，對過氧化氫或乙基氫過氧化物具有0.02mM的Km(Kedderis和Hollenberg，J.Biol.Chem.2588129-8138)，而谷胱甘肽過氧化物酶具有0.025-0.06mM的Km(Masaki等，1998，見上)。因?yàn)槎喾N生物質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)易于生成低水平的過氧化物，過氧化物酶可能比過氧化氫酶更有效地去除過氧化物以改善纖維素水解。本發(fā)明提供了用于增加用酶組合物進(jìn)行的纖維素材料水解的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物處理纖維素材料。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料在具有過氧化物酶活性的多肽存在下經(jīng)酶組合物水解。附圖簡述圖1顯示了辣根過氧化物酶減輕纖維二糖脫氫酶對過氧化氫酶的抑制。將纖維素轉(zhuǎn)化分?jǐn)?shù)對多種反應(yīng)條件作圖。實(shí)心條1日水解；陰影條3日水解。圖2顯示了辣根過氧化物酶增強(qiáng)PCS水解。圓圈1日水解；正方形3日水解。圖3顯示了多種過氧化物酶對PCS水解的作用。實(shí)心條1日水解；陰影條3日水解。數(shù)值表示如文本中所示添加的過氧化物酶儲液的體積。Mn-perox錳過氧化物酶;lignin-perox木質(zhì)素過氧化物酶；和纖維素里氏木霉纖維素組合物。定義過氧化物-生成系統(tǒng)術(shù)語“過氧化物生成系統(tǒng)”在本文中定義為如下所定義的過氧化物生成酶，或?qū)е逻^氧化物產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)。過氧化物生成的化學(xué)方法的常見實(shí)例包括但不限于，對孟加拉玫瑰紅(RoseBengal)的UV-輻射；2-乙基_9，10-二羥基蒽+至2-乙基蒽醌+的Reidl-Pfeiderer自氧化過程；單態(tài)分子氧1O2與抗壞血酸的反應(yīng)；在多種金屬和金屬絡(luò)合物催化劑存在下分子氧對有機(jī)醇的氧化；和氧對不飽和的脂質(zhì)的氧化(在自由基引發(fā)之后)形成脂質(zhì)過氧化物。過氧化物生成酶術(shù)語“過氧化物生成酶”在本文中定義為催化反應(yīng)還原底物(2e0+O2->氧化底物+的供體氧氧化還原酶(E.C.號1.1.3.χ)，如催化反應(yīng)葡萄糖+O2->葡糖酸內(nèi)酯+的葡萄糖氧化酶；以及供體超氧化物氧化還原酶(E.C.1.15.1.χ)如催化反應(yīng)202_+2Η+->02+Η202的超氧化物歧化酶。其他過氧化物生成酶的實(shí)例提供于本文?；蛘?，具有其他活性，且可使用分子氧作為電子受體的氧化還原酶，亦包括在術(shù)語過氧化氫生成酶之內(nèi)。除了過氧化氫之外，這些酶還可生成其他過氧化物。過氧化物酶活性術(shù)語“過氧化物酶活性”在本文中定義為將過氧化物例如過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧化程度較低的物種例如水的酶活性。在本文中應(yīng)理解的是具有過氧化物酶活性的多肽涵蓋過氧化物分解酶(如下所定義)。過氧化物分解酶術(shù)語“過氧化物分解酶”在本文中定義為催化反應(yīng)還原底物(2eO+ROOR'->氧化底物+ROH+R，OH的供體過氧化物氧化還原酶(E.C.號1.11.1.χ)；如催化反應(yīng)苯酚+H2O2->醌^l2O的辣根過氧化物酶，以及催化反應(yīng)Η2Α+Η202->02+2Η20的過氧化氫酶。除了過氧化氫之外，其他過氧化物亦可由這些酶分解。纖維二糖脫氫酶術(shù)語“纖維二糖脫氫酶”在本文中定義為纖維二糖受體1-氧化還原酶(Ε.C.1.1.99.18)，其在受體存在下催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖酸-1，5-內(nèi)酯和還原的受體。2，6_二氯靛酚可充當(dāng)受體，鐵，特別是!^e(SCN)3、分子氧、泛醌或細(xì)胞色素C以及可能的許多其他多酚類亦可。該酶的底物包括纖維二糖、纖維寡糖、乳糖和D-葡糖基-1，4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露二糖、硫代纖維二糖(thiocellobiose)、半乳糖基-甘露糖、木二糖和木糖。電子供體優(yōu)選為在還原端具有葡萄糖或甘露糖的β-1-4二己糖，盡管α-1-4己糖苷、己糖、戊糖和β-1-4五鄰體(pentomer)亦顯示充當(dāng)這些酶的底物(Henriksson等，1998,BiochimicaetBiophysicaActa-ProteinStructureandMolecularEnzymology；1383:48-54；禾口Schou等，1998，Biochem.J.330:565-571)。纖維二糖脫氫酶包含兩個(gè)家族，1和2，其差異在于纖維素結(jié)合基序(CBM)的存在。纖維二糖脫氫酶的3維結(jié)構(gòu)特征在于兩個(gè)球狀域，每個(gè)含有兩個(gè)輔酶之一血紅素或黃素?；钚晕稽c(diǎn)位于兩個(gè)域之間的縫隙。纖維二糖脫氫酶的催化循環(huán)遵循有序的順序機(jī)理。纖維二糖的氧化通過從纖維二糖至黃素的2電子轉(zhuǎn)移發(fā)生，生成纖維二糖酸-1，5-內(nèi)酯和還原的黃素?；钚訤AD通過電子轉(zhuǎn)移至血紅素基團(tuán)而再生，留下還原的血紅素。天然狀態(tài)的血紅素通過與氧化底物在第二活性位點(diǎn)反應(yīng)來再生。氧化底物優(yōu)選為鐵氰化鐵(ironferricyanide)、細(xì)胞色素C或氧化的酚類化合物如二氯靛酚(DCIP)，其為常用于色度法測定的底物。金屬離子和O2亦為底物，但對于大多數(shù)纖維二糖脫氫酶，對于這些底物的反應(yīng)速率比對于鐵或有機(jī)氧化劑觀察到的要低幾個(gè)數(shù)量級。在纖維二糖酸內(nèi)酯釋放之后，產(chǎn)物可進(jìn)行自發(fā)的開環(huán)以生成纖維二糖酸(HalIberg等，2003，J.Biol.Chem.278:7160_7166)。纖維素分解活性術(shù)語“纖維素分解活性”在本文中定義為水解纖維素材料的生物學(xué)活性。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement-Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452_481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括WhatmanNo.1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用WhatmanNo.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中纖維素在50-65°C進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，ImmMnSO4,50-65°C，72小時(shí)，通過AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合的β-1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素成分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose，1987，PureandApp1.Chem.59:257_268的方法，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β_1，4-連接葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri，1997，Crystallinecellulosedegradation:NewinsightintothefunctionofeellobiohydroIases,TrendsinBiotechnology15:160_167；Teeri等，1998,Trichodermareeseieellobiohydrolaseswhysoefficientoncrystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149152-156及vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLettersl87:283-288描述的方法使用熒光性二糖衍生物4-甲基傘形基-β-D-乳糖苷來測定纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶術(shù)語“β-葡糖苷酶”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum!production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66^基本方法測定葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的葡糖苷酶活性定義為在40°C，pH5，以ImM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷為底物，在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚。纖維素分解增強(qiáng)活性術(shù)語“纖維素分解增強(qiáng)活性”在本文中定義為增強(qiáng)具有纖維素分解活性的多肽水解纖維素材料的生物學(xué)活性。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素酶蛋白在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強(qiáng)活性l_50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)，在50-65°C歷時(shí)1-7天，與用相等的總蛋白加載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素酶蛋白/gPCS中的纖維素)所進(jìn)行的對照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，在總蛋白重量的3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)存在下使用CELLUCLAST1·5L(NovozymesA/S,BagSV^rd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽通過降低達(dá)到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族61糖苷水解酶術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309_316，及HenrissatB.JfIBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat將GH61家族列為未分類的，這表明對屬于該家族的多肽，如機(jī)理，催化性親核體/堿以及催化性質(zhì)子供體等性質(zhì)是未知的。木聚糖降解活性術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定義為水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和(測定單獨(dú)的木聚糖分解活性(內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶測定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公幵文獻(xiàn)中，包括Biely和Puchard，Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11)1636-1647；Spanikova禾口Biely，2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophylIumcommune，F(xiàn)EBSLetters580(19):4597_4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely禾口Kubicek，1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375_3810總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257_270中所述。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的Iml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉pH5，50°C,24小時(shí)，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273_279所述使用對羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶活性術(shù)語“木聚糖酶活性”在本文中定義為1，4-β-D-木聚糖_木聚糖水解酶活性(Ε.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中l(wèi)，4-i3-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在500C，pH5從每升2g樺木木聚糖作為底物在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉中水解的起始期間每分鐘產(chǎn)生ι.Oμmol還原糖(以葡萄糖當(dāng)量(glucoseequivalents)測定，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273_279所述)。β-木糖苷酶活性術(shù)語“β-木糖苷酶活性”在本文中定義為β-D木糖苷木糖水解酶(Ε.C.3.2.1.37)，其催化短β(1—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的木糖苷酶活性定義為在40°C,pH5從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.Oμmol對硝基苯酚。乙酰木聚糖酯酶活性術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定義為羧酸酯酶活性(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎恰⒁阴；咸烟?、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)禾口乙酸對石肖基苯酉旨(p—nitrophenylacetate)的水角軍。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.O中確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶活性定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶活性術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)活性”在本文中定義為EC3.1.1.73(IUBMBEnzymeNomenclature)中的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰糖水解酶酶活性，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸羥基-3-甲基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA,cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出1μmol對硝基苯酚陰離子的酶量。α-葡糖醛酸糖苷酶活性術(shù)語“α-葡糖醛酸糖苷酶活性”在本文中定義為α-D-葡糖苷酸葡糖酸酸水角軍活性(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖苷酸水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998，J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出Iymol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性術(shù)語“α_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”在本文中定義為α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶活性(EC3.2.1.55)，其催化對α_L_阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶活性對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μ1的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木MW(MegazymeInternationalIreland,Ltd.，Bray,Co.fficklow)^t400Cii^f30yM^,接著通過AMINEXHPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價(jià)交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesΕ·Wyman編)，pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719;Mosier等，，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素。在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法，如本文所述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸稈術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸稈“在本文中定義為通過用熱和稀硫酸處理而源自玉米秸稈的纖維素材料。含木聚糖材料術(shù)語“含木聚糖材料”在本文中定義為任何包含含有β-(1-4)連接木糖殘基骨架的植物細(xì)胞壁多肽的材料。陸生植物的木聚糖是具有i3-(14)_D-吡喃木糖骨架、具有短糖鏈分支的雜聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多種寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖組成。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復(fù)合雜木聚糖(complexheteroxylan)參見例如Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186:1_67。在本發(fā)明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。所述多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實(shí)現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選3.0.0版或更高版本)中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)的Needle程序(優(yōu)選3·0·0版或更高版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為在用多肽進(jìn)行的tfasty搜索(Pearson,WR.,1999,于BioinformaticsMethodsandProtocols中，S.Misener禾口S.A.Krawetz編，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的預(yù)測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從成熟編碼序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的核苷酸序列，其中所述亞序列編碼具有生物活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時(shí)，術(shù)語“人工變體”的意思是由表達(dá)經(jīng)修飾而編碼多肽變體的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生的多肽。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾多核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物處理纖維素材料。在一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括回收所述經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)酶組合物在具有過氧化物酶活性的多肽存在下水解。在一個(gè)方面，所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。在上述每個(gè)方法中，具有過氧化物酶活性的多肽的存在與具有過氧化物酶活性的多肽不存在相比增加了纖維素材料的水解。優(yōu)選地，過氧化物分解酶或過氧化物酶的Km是在優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM的范圍。在一個(gè)方面，過氧化物分解酶或過氧化物酶的Km是在0.0001至50mM的范圍。在另一個(gè)方面，過氧化物分解酶或過氧化物酶的Km是在0.001至IOmM的范圍。在另一個(gè)方面，過氧化物分解酶或過氧化物酶的Km是在0.005至ImM的范圍。在另一個(gè)方面，過氧化物分解酶或過氧化物酶的Km是在0.01至0.ImM的范圍。在一個(gè)方面，在上述每個(gè)方法中，酶組合物進(jìn)一步包含過氧化物生成系統(tǒng)。在另一個(gè)方面，所述纖維素材料包含過氧化物生成系統(tǒng)。過氧化物生成系統(tǒng)和具有過氧化物酶活性的多肽的存在與過氧化物生成系統(tǒng)存在而具有過氧化物酶活性的多肽不存在相比增加了纖維素材料的水解。在另一個(gè)方面，所述過氧化物生成系統(tǒng)為過氧化氫生成系統(tǒng)。本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料糖化為可發(fā)酵的糖，并將可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為許多有用物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如，酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明纖維素材料的加工可使用本領(lǐng)域常規(guī)工藝達(dá)成。而且，本發(fā)明的方法可使用任何配置為依照本發(fā)明操作的常規(guī)生物質(zhì)加工裝置實(shí)施。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個(gè)步驟中組合(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，Μ.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstraegicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15=817-827)0HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，S卩，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))步驟中組合了所有三個(gè)過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506_577)。在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中任何已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33_38；Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、研磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.，和Lee，J.Μ.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53_65),或者具有由電磁場引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,Α.P.，Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141_153)。其它反應(yīng)器類型包括流化床、升流層、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料成分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.10867-93；Galbe禾口Zacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.10841~65；Hendriks禾口Zeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.10010-18；Mosier等，2005,Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673_686；Taherzadeh禾口Karimi,2008,PretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproductionAreview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang禾口Wyman,2008,Pretreatmentthekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行預(yù)浸泡、潤濕或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界吐0、臭氧和、輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行。或者，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可以到達(dá)纖維素和其它部分，例如，半纖維素。將纖維素材料通過或穿過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170_190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度和范圍依賴于任何化學(xué)催化劑的加入。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和任何化學(xué)催化劑的加入。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，使得纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后對物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff禾口Murray,1996，BioresourceTechnology8551-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并促進(jìn)酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。化學(xué)預(yù)處理術(shù)語“化學(xué)處理“指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是吐504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150°C的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從1小時(shí)到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-220°c進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt禾口Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨處理纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等，2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇00-60%乙醇)在160_200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:ρ·69-85，和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686，和美國專利公開申請2002/0164730所述。在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的PH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至IOwt%酸，甚至更優(yōu)選0.1至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.Owt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60分鐘的時(shí)間。在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個(gè)方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”指各種類型的研磨或碾磨(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。物理預(yù)處理術(shù)語“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個(gè)方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對纖維素材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機(jī)械預(yù)處理。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對纖維素材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,1996,Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanolProductionandUtilization，Wyman，C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39295-333；McMillan，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himmel,Baker禾口Overend編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington，DC，chapter15；Gong,Cao,Du禾口Tsao，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207_241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18312—331；禾口Vallander禾口Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)0糖化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將預(yù)處理的纖維素材料水解以將纖維素和任選地也將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物在本發(fā)明具有過氧化物酶活性的多肽存在下以酶法進(jìn)行。所述組合物可進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料批式或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達(dá)200小時(shí)，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時(shí)，更優(yōu)選約16至約72小時(shí)，并且最優(yōu)選約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且最優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6，特別是約pH5。干燥固體含量優(yōu)選約5至約50wt%，更優(yōu)選約10至約40wt%，并且最優(yōu)選約20至約30wt%。酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、含纖維素底物、含纖維素底物的濃度、含纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有過氧化物酶活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.001至約50mg，優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.02至約25mg，更優(yōu)選約0.03至約20mg，更優(yōu)選約0.04至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.04至約10mg，并且最優(yōu)選約0.05至約5mg每g纖維素材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.Omg,優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.01至約30mg，更優(yōu)選約0.01至約20mg，更優(yōu)選約0.01至約10mg，更優(yōu)選約0.01至約5mg，更優(yōu)選約0.025至約1.5mg,更優(yōu)選約0.05至約1.25mg,更優(yōu)選約0.075至約1.25mg,更優(yōu)選約0.1至約1.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg,并且最優(yōu)選約0.25至約1.Omg每g纖維素材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有過氧化氫酶活性的多肽對于過氧化氫生成酶的有效量是約0.005至約1.Og,優(yōu)選約0.01至約1.Og,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g，更優(yōu)選約0.1至約0.5g，甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g，并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g過氧化氫生成酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對于纖維素分解蛋白的有效量是約0.005至約1.Og,優(yōu)選約0.01至約1.Og,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g，更優(yōu)選約0.1至約0.5g，甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g，并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g纖維素分解蛋白。發(fā)醛?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物，發(fā)酵自經(jīng)預(yù)處理和水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇底物，如本領(lǐng)域中所公知。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(；和/或C5發(fā)酵生物體，或它們的組合。C6和C5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成理想的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌禾中，優(yōu)選酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬(Pichia)，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬(Candida)，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、偽熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)；漢遜酵母屬(Hansenula)，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)；裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大腸桿菌(E.coli)的菌株，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株。在一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是ClavisporaOpuntiae0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996，見上文)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(可從RedMar/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast,BurnsPhilpFoodInc.,USA的部門獲得)、SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(可從KhanolTechnology,WI,USA獲得)、BI0FERMAFT和XR(可從NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA，USA獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB，Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen禾口Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，App1.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,App1.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter禾口Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,App1.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple，F(xiàn)EMSYeastResearch4655-664；Beall1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430,xyloseisomerase)0在一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，如約M至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5,6或7。在一個(gè)優(yōu)選的方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且PH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4_7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOiq,特別是約2xl08活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“發(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D禾口Ε。參見,例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess，Springer-Verlag(2002)，其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖牵g(shù)語“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.，Cao,N.J.，Du,J.，禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany,65207-241；Silveira，Μ.M.，禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam，P.，禾口Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute，ProcessBiochemistry30(2):117_124；Ezeji,T.C.，Qureshi,N.禾口Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone，butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435_448。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮。可理解的是術(shù)語“酮”包括含有一個(gè)或多個(gè)酮基的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上文。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard，A.,禾口Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是h2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；禾口GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。Mi可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96V0l%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽及其多核苷酸在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X為任意氨基酸，X(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(4)是在4個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。具有上述所示的基序的多肽可進(jìn)一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],其中X為任意氨基酸，X(l，2)為在1個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，X(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(2)為2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含H-X(l，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-Χ-Υ-Χ⑵-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽具有下述基序[ILMV]-P-X(4，5)-G—x—Y-[ILMV]-χ-R—x-[EQ]-χ(3)~A~[HNQ]，其中X為任意氨基酸，X(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在第三個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO16的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的氨基酸序列(下文中稱為“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽序列為SEQIDNO:2的氨基酸20至326，SEQIDNO4的氨基酸18至239，SEQIDNO6的氨基酸20至258，SEQIDNO8的氨基酸19至226，SEQIDNO10的氨基酸20至304，SEQIDNO12的氨基酸16至317，SEQIDNO14的氨基酸23至250或SEQIDNO16的氨基酸20至249。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸20至326或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的氨基酸20至幻6組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO4的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至239或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至239。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸18至239或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸18至239組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO6的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO6的氨基酸20至258或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸20至258或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸20至258組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO8的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的氨基酸19至2或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的氨基酸19至226。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸19至2或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸19至2組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO10的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:10的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:10的氨基酸20至304。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸20至304組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO12的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO12的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:12的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸16至317或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:12的氨基酸16至317。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO12的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸16至317或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO12的氨基酸16至317組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO14的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO14的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:14的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:14的氨基酸23至250或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:14的氨基酸23至250。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:14的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:14的氨基酸23至250或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸23至250組成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO16的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN016的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:16的成熟序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:16的氨基酸20至249或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:16的氨基酸20至249。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO16的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的氨基酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:16的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:16的成熟序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:16的氨基酸20至249或其等位變體，或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO16的氨基酸20至249組成。優(yōu)選地，SEQIDNO:2的成熟多肽的片段含有至少277個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少287個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少297個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:4的成熟多肽的片段含有至少185個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少195個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少205個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:6的成熟多肽的片段含有至少200個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少212個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少2個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:8的成熟多肽的片段含有至少175個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少185個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少195個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:10的成熟多肽的片段含有至少240個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少255個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少270個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN0:12的成熟多肽的片段含有至少255個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少270個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少285個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:14的成熟多肽的片段含有至少175個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少190個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少205個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN0:16的成熟多肽的片段含有至少200個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少210個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少220個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少831個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少861個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少891個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少555個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少585個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少615個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少636個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少672個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少525個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少555個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少585個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少720個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少765個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少810個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少765個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少810個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少855個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO13的核苷酸67至796的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少525個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少570個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少615個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少630個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選至少660個(gè)核苷酸。在第四個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由在至少非常低嚴(yán)格條件，優(yōu)選至少低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選至少中嚴(yán)格條件，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴(yán)格條件，且最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)格條件下與下述雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO3,SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13或SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:15的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補(bǔ)鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，見上)。SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13或SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸，或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDNO3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO:9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸46至951，SEQIDNO13的核苷酸67至796或SEQIDNO15的核苷酸77至766。SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11、SEQIDNO13或SEQIDNO15的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO16的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個(gè)核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。可使用甚至更長的探針，例如優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸長度的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常標(biāo)記探針以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。本發(fā)明涵蓋此類探針。因而，可從由此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自此類其他菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在如上文所述非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDN0:13或SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDN0:15的基因組DNA序列，其全長互補(bǔ)鏈，或它們的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30699中的質(zhì)粒PEJG120中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30699中的質(zhì)粒pEJG120中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的核苷酸98至821。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的核苷酸1至978。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒pTter61D中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒pTter61D中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的核苷酸55至678。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒pTter61E中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒pTter61E中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的核苷酸58至912。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的核苷酸46至951。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO=Il0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50044中的質(zhì)粒pTter61F中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50044中的質(zhì)粒pTter61F中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的核苷酸67至796。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒PDZA2-7中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒pDZA2-7中含有的成熟多肽編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:15的核苷酸77至766。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:16的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:15。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30878中的質(zhì)粒pTr333中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-30878中的質(zhì)粒pTr333中含有的成熟多肽編碼序列。對于長度至少100個(gè)核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。對于長度為至少100個(gè)核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在450C(非常低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴(yán)格性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計(jì)算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二fiil^l(sodiummonobasicphosphate)，0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時(shí)。對于長度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第五個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是由包含與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO13或SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性程度的核苷酸序列，或上述核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO=I的核苷酸388至1332，SEQIDNO3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO:9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸46至951，SEQIDNO13的核苷酸67至796或SEQIDNO15的核苷酸77至766。在第六個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是在SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:12或SEQIDN0:14或SEQIDNO:16的成熟多肽或其同源序列中包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的人工變體。制備此種人工變體的方法如上文所述。SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14或SEQIDNO:16成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)為10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選做多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，且甚至最優(yōu)選1。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可從任何屬的微生物獲得，在一個(gè)優(yōu)選的方面，從給定來源獲得的多肽分泌至胞外。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>lif屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬O^eudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)屬多肽，其具有纖維素分解增強(qiáng)活性。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)>I^jv^ifelflif(Bacillusamyloliquefaciens)菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有纖維素分解增強(qiáng)活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>ΜM(Lentinula)、Leptospaeria>^cifelifM(Magnaporthe)、Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有纖維素分解增強(qiáng)活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€β(Mucormiehei)、口f%罾M胃(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈？包菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木毒(Trichodermaharzianum)、康寧木毒(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、綠色木霉(Trichodermaviride)Trichophaeasaccata$月太0可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)?？煞蛛x包含編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸并將其用于表達(dá)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽以供如本文中所述在本發(fā)明的方法中進(jìn)行評價(jià)。所述多核苷酸包含編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、與SEQIDN0:1,SEQIDNO3,SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO13或SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的核苷酸序列。所述多核苷酸亦可為編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的多核苷酸，其在至少非常低嚴(yán)格條件，優(yōu)選至少低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選至少中嚴(yán)格條件，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴(yán)格條件，且最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13或SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或如本文中定義的其等位變體和亞序列(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.ManiatuS，1989，見上)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸388至1332，SEQIDNO3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸1至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸46至951，SEQIDNO13的核苷酸67至796或SEQIDNO15的核苷酸77至766。如前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。過氧化物生成酶在本發(fā)明方法中，所述過氧化物生成酶可為任何過氧化物生成酶。所述過氧化物生成酶，例如過氧化氫生成酶，可作為酶活性存在于酶組合物，作為添加至組合物的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))蛋白質(zhì)的組分存在，和/或作為存在于纖維素材料中的酶組分存在。在一個(gè)方面，所述過氧化物是過氧化氫。過氧化物生成酶的實(shí)例包括下述E.C.1.1.3.χ-供體氧氧化還原酶，葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)，己糖氧化酶(E.C.1.1.3.5)，芳香醇氧化酶(E.C.1.1.3.7)，D-阿拉伯糖基-1，4-內(nèi)酯氧化酶(E.C.1.1.3.37)，香草醇氧化酶(E.C.1.1.3.38)和木糖醇氧化酶(E.C.1.1.3.41)E.C.1.1.99.8-醇脫氫酶E.C.1.1.99.18-纖維二糖脫氫酶E.C.1.2.3.χ-酸氧化酶(Ε.C.1.2.3.1)，芳香醛氧化酶(Ε.C.1.2.3.9)Ε.C.1.3.3.χ-二氫乳清酸氧化酶(Ε.C.1.3.3.1)，吡咯并喹啉-醌合酶(Ε.C.1.3.3.11)Ε.C.1.4.3.χ-L-氨基酸氧化酶(Ε.C.1.4.3.2)，L-谷氨酸氧化酶(Ε.C.1.4.3.11)Ε.C.1.5.3.χ-多胺氧化酶(1.5.3.11)Ε.C.1.6.3.I-NADPH氧化酶Ε.C.1.7.3.χ-尿酸氧化酶(Ε.C.1.7.3.3)，羥胺氧化酶(Ε.C.1.7.3.4)Ε.C.1.8.3.χ-硫醇氧化酶(Ε.C.1.8.3.2)，谷胱甘肽氧化酶(Ε.C.1.8.3.3)Ε.C.1.9.3.1-細(xì)胞色素c氧化酶Ε.C.1.13.11.12-脂肪氧合酶Ε.C.1.13.11.31-花生四烯酸12-脂肪氧合酶Ε.C.1.13.11.33-花生四烯酸15-脂肪氧合酶Ε.C.1.13.11.34-花生四烯酸5_脂肪氧合酶Ε.C.1.13.11.40-花生四烯酸8_脂肪氧合酶Ε.C.1.13.11.45-亞油酸11-脂肪氧合酶Ε.C.1.15.1.1_超氧化物歧化酶Ε.C.1.17.3.χ-黃嘌呤氧化酶(Ε.C.1.17.3.2)所述過氧化物生成酶可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，獲得自給定來源的多肽分泌至胞外。所述過氧化物生成酶可以是細(xì)菌過氧化物生成酶。例如，所述過氧化物生成酶可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)過氧化物生成酶；或革蘭氏陰性細(xì)菌過氧化物生成酶，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)屬過氧化物生成酶。在一個(gè)方面，所述過氧化物生成酶是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus),角軍淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)過氧化物生成酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物生成酶是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸癌亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)過氧化物生成酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物生成酶是不產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)過氧化物生成酶。所述過氧化物生成酶也可以是真菌過氧化物生成酶，并且更優(yōu)選酵母過氧化物生成酶如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)過氧化物生成酶；或更優(yōu)選絲狀真菌過氧化物生成酶如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>MSM(Lentinula)、Leptospaeria>^lifM(Magnaporthe)、Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)過氧化物生成酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物生成酶是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)過氧化物生成酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物生成酶是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€β(Mucormiehei)、口f%罾M胃(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈？包菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)過氧化物生成酶。過氧化物生成酶及其來源的實(shí)例包括Cohn，1958，TheenzymaticformationofoxalaceticacidbynonpyridinenucleotidemalicdehydrogenaseofMicrococcuslysodeikticus，J.Biol.Chem.233:299_304；Yamashita等，2000，Isolation，characterizationandmolecularcloningofathermostablexylitoloxidasefromStreptomycessp.IKD472，J.Biosci.Bioeng.89:350_360(登錄號Q9KX73)；Seo等，2000，TheArabidopsisaldehydeoxidase3(AA03)geneproductcatalyzesthefinalstepinabscisicacidbiosynthesisinleaves,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:12908-12913(登錄號Q7G191)；Aurich等，1972，PurificationandpropertiesofL-aminoacidoxidasefromNeurosporacrassa，ActaBiol.Med.Ger.28:209-220(登錄號P23623)；Hoober禾口Thorpe，2002，F(xiàn)lavin-dependentsulfhydryloxidasesinproteindisulfidebondformation，MethodsEnzymol.348:30-34；Baum禾口Scandalios，1981，Isolationandcharacterizationofthecytosolicandmitochondrialsuperoxidedismutasesofmaize,Arch.Biochem.Biophys.206:249-64(登錄號P09233)；Holdom等，1996，TheCu，ZnsuperoxidedismutasesofAspergillusflavus，Aspergillusniger，Aspergillusnidulans，andAspergillusterreus!purificationandbiochemicalcomparisonwiththeAspergillusfumigatusCu，Znsuperoxidedismutase，Infect.Immun.64:3326-3332(登錄號Q3MSU9)；Lamarre等，2001，Candidaalbicansexpressesanunusualcytoplasmicmanganese-containingsuperoxidedismutase(S0D3geneproduct)upontheentryandduringthestationaryphase,J.Biol.Chem.276:43784-43791(登錄號013401)；Dufernez等，2006，Thepresenceoffouriron-containingsuperoxidedismutaseisozymesintrypanosomatidaecharacterization,subcellularlocalization，andphylogeneticorigininTrypanosomabrucei，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.40(2):193-5(AccessionNos.AY894557，AY894558，AY894559andAY894560)；Hjalmarsson等，1987，IsolationandsequenceofcomplementaryDNAencodinghumanextracellularsuperoxidedismutaseProc.Natl.Acad.Sci.USA84:6340-6344(登錄號J(^947)；Yamada等，1999Sequenceandanalysisofchromosome2oftheplantArabidopsisThaliana，Nature402:761-768(登錄號Q9ZPY2)；Kriechbaumetal.,1989,CloningandDNAsequenceanalysisoftheglucoseoxidasegenefromAspergillusnigerNRRL-3，F(xiàn)EBSLett.255(1):63-66(登錄號P13006)；Kiess等，1998)GlucoseoxidasefromPenicilliumamagasakiense.Primarystructureandcomparisonwithotherglucose-methanol-choline(GMC)oxidoreductasesEur.J.Biochem.252(1):90-99(g^^·P81156)；Nierman等,2005，GenomicsequenceofthepathogenicandallergenicfilamentousfungusAspergillusfumigatusNature438:1151-1156(登錄號Q4WZA6)；Toyama等，2005，MolecularcloningandstructuralanalysisofquinohemoproteinalcoholdehydrogenaseADH-IIGfromPseudomonasputidaHK5J.Mol.Biol.352(1):91-104(g錄號Q4W6G0)。纖維二糖脫氫酶及其來源的實(shí)例包括Xu等，2001，Humicolainsolenscellobiosedehydrogenase:cloning，redoxchemistry,and“l(fā)ogicgate“-likedualfunctionality,Enz.Microb.Technol.28:744-753(登錄號Q9P8H5)；Nozaki等，1999，CloningandexpressionofcellobiosedehydrogenasefromIrpexlacteus.Submitted(AUG-2004)totheEMBL/GenBank/DDBJdatabases(登錄號Q6AW2O)；Moukha等，1999,CloningandanalysisofPycnoporuscinnabarinuscellobiosedehydrogenase,Gene234:23-33(登錄號074253)；Li等，1996，CloningofacDNAencodingcellobiosedehydrogenase,ahemofIavoenzymefromPhanerochaetechrysosporium,App1.Environ.Microbiol.62:1329-1335(登錄號Q01738)；Kajisa等，2004，Characterizationandmolecularcloningofcellobiosedehydrogenasefromthebrown-rotfungusConiophoraputeana,Biosci.Bioeng.9857-63(登錄號Q6BDD5)；Zamocky等，Phylogeneticanalysisofcellobiosedehydrogenases.Submitted(N0V-2002)totheEMBL/GenBank/DDBJdatabases(登錄號Q7Z975)；Yoshida等，2002，MolecularcloningandcharacterizationofacDNAencodingcellobiosedehydrogenasefromthewood-rottingfungusGrifolafrondosa,FEMSMicrobiol.Lett.217:225_230(登錄號Q8J2T4)；Stapleton等，2004，MolecularcloningofthecellobiosedehydrogenasegenefromTrametesversicolorandexpressioninPichiapastoris,EnzymeMicrob.Technol.3455~63(登錄號Q875J3)；Dumonceaux等，1998,CloningandsequencingofageneencodingcellobiosedehydrogenasefromTrametesversicolor,Gene210211-219(g^^·042729)；Nierman2005,GenomicsequenceofthepathogenicandallergenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，Nature438:1151_1156(登錄號Q4WIN9)；Raices等，1995，CloningandcharacterizationofacDNAencodingacellobiosedehydrogenasefromthewhiterotfungusPhanerochaetechrysosporium，F(xiàn)EBSLett.369:233-238(登錄號Q12661)；Zamocky等，2008，Cloning，sequenceanalysisandheterologousexpressioninPichiapastorisofageneencodingathermostablecellobiosedehydrogenasefromMyriococcumthermophilum，ProteinExpr.Purif.59258-265(登錄號A9XK88)；Fedorova等，GenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號AlCFVO)；Subramaniam等，BiochemicalandmolecularbiologicalcharacterizationofcellobiosedehydrogenasefromSporotrichumthermophilum，Submitted(JUN-1998)totheEMBL/GenBank/DDBJdatabases(g^^·074240)；FedorovaGenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號A1CYG2)；Fedorova等，GenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號B0XVQ8)；Fedorova等，GenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號A1C890)；Fedorova等，GenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號A1DIY3)；Zamocky等，2008，Cloning，sequenceanalysisandheterologousexpressioninPichiapastorisofageneencodingathermostablecellobiosedehydrogenasefromMyriococcumthermophilum，ProteinExpr.Purif.59:258_265(登錄號A9XK87)；Birren等，TheBroadInstituteGenomeSequencingPlatform"GenomeSequenceofPyrenophoratritici-repentis，Submitted(MAR-2007)totheEMBL/GenBank/DDBJdatabases(登錄號B2WHI7)；Birren等，TheBroadInstituteGenomeSequencingPlatform“GenomeSequenceofPyrenophoratritici-repentis,Submitted(MAR-2007)totheEMBL/GenBank/DDBJdatabases(登錄號B2WJX3)；Fedorova等，GenomicislandsinthepathogenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus，PloS(登錄號Q4WC40)；以及Pel等，2007，GenomesequencingandanalysisoftheversatilecellfactoryAspergillusnigerCBS513.88，Nat.Biotechnol.25221-231(登錄號A2QD75)。在一個(gè)方面，所述纖維二糖脫氫酶是特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶。在另一個(gè)方面，所述纖維二糖脫氫酶是特異腐質(zhì)霉DSM1800纖維二糖脫氫酶，例如包含由SEQIDNO17編碼的SEQIDNO:18的多肽，或其具有纖維二糖脫氫酶活性的片段(參見美國專利6，280，976號)。在另一個(gè)方面，所述纖維二糖脫氫酶是嗜熱毀絲霉纖維二糖脫氫酶。在另一個(gè)方面，所述纖維二糖脫氫酶是嗜熱毀絲霉CBS117.65纖維二糖脫氫酶。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。非酶過氧化物生成系統(tǒng)在本發(fā)明中，所述過氧化物生成系統(tǒng)可為任何生成過氧化物的化學(xué)反應(yīng)或反應(yīng)系統(tǒng)。所述過氧化物生成系統(tǒng)可作為酶組合物中的組分和/或一種或多種(幾種)生物質(zhì)組分和/或一種或多種(幾種)添加至組合物的化學(xué)組分之間的反應(yīng)存在。在一個(gè)方面，所述過氧化物是過氧化氫。過氧化物生成系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于對孟加拉玫瑰紅的UV輻射(Wright等，2000,SingletOxygen-MediatedProteinOxidation:EvidencefortheFormationofReactivePeroxides,RedoxReport,5:159-161)；2_乙基-9，10-二羥基蒽+O2至2_乙基蒽醌+的Reidl-Pfeiderer自氧化過程；Eul等，2001，Hydrogenperoxide,inKirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnologyWiley,NewYork；單態(tài)分子氧1O2與抗壞血酸的反應(yīng)(Kramarenko等，2006,AscorbateReactswithSingletOxygentoProduceHydrogenPeroxide,Photochem.Photobiol.82(6):1634-1637)；不飽禾口的月旨質(zhì)的氧化(在自由基引發(fā)之后)形成脂質(zhì)過氧化物(Benzie,1996,Lipidperoxidation=Areviewofcauses,consequences,measurementanddietaryinfluences,InternationalJournalofFoodSciencesandNutrition47(3):233-261)；和在多種金屬和金屬絡(luò)合物催化劑存在下分子氧對有機(jī)醇的氧化(Bortolo等，2000，ProductionofHydrogenPeroxidefromOxygenandAlcohols,CatalyzedbyPalladiumComplexes,J.Mol.Cat.A.Chem.，153:25-29)。具有過氧化物酶活性的多肽在本發(fā)明的方法中，所述具有過氧化物酶活性的多肽可為任何具有過氧化物酶活性的多肽。所述具有過氧化物酶的多肽可作為酶活性在酶組合物中存在和/或作為一種或多種(幾種)添加至所述組合物的蛋白質(zhì)組分存在。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述具有過氧化物酶活性的多肽對所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分是外源的。過氧化物酶或過氧化物分解酶的實(shí)例包括但不限于下述E.C.1.11.1.INADH過氧化物酶E.C.1.11.1.2NADPH過氧化物酶E.C.1.11.1.3脂肪酸過氧化物酶E.C.1.11.1.5二血紅素細(xì)胞色素c過氧化物酶E.C.1.11.1.5細(xì)胞色素c過氧化物酶E.C.1.11.1.6過氧化氫酶E.C.1.11.1.6錳過氧化氫酶E.C.1.11.1.7無脊椎動物peroxinectinΕ.C.1.11.1.7嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶Ε.C.1.11.1.7乳過氧化物酶Ε.C.1.11.1.7髓過氧化物酶Ε.C.1.11.1.8甲狀腺過氧化物酶Ε.C.1.11.1.9谷胱甘肽過氧化物酶Ε.C.1.11.1.10氯化物過氧化物酶Ε.C.1.11.1.11抗壞血酸過氧化物酶Ε.C.1.11.1.12其他谷胱甘肽過氧化物酶Ε.C.1.11.1.13錳過氧化物酶Ε.C.1.11.1.14木質(zhì)素過氧化物酶Ε.C.1.11.1.15半胱氨酸過氧化物酶Ε.C.1.11.1.16多功能過氧化物酶(versatileperoxidase)Ε.C.1.11.1.Β2氯化物過氧化物酶Ε.C.1.11.1.Β4鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)Ε.C.1.11.1.B4無血紅素釩鹵素過氧化物酶(no-hemevanadiumhaloperoxidase)Ε.C.1.11.1.Β6碘化物過氧化物酶Ε.C.1.11.1.Β7溴化物過氧化物酶Ε.C.1.11.1.Β8碘化物過氧化物酶在一個(gè)方面，所述過氧化物酶是NADH過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是NADPH過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是脂肪酸過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是二血紅素細(xì)胞色素c過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是細(xì)胞色素c過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是過氧化氫酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是錳過氧化氫酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是無脊椎動物peroxinectin。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是乳過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是髓過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是甲狀腺過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是谷胱甘肽過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是氯化物過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是抗壞血酸過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是谷胱甘肽過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是錳過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是半胱氨酸過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是多功能過氧化物酶(versatileperoxidase)0在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是氯化物過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是商素過氧化物酶(haloperoxidase)。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是無血紅素釩鹵素過氧化物酶(no-hemevanadiumhaloperoxidase)。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是碘化物過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是溴化物過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是碘化物過氧化物酶。具有過氧化物酶活性的多肽的實(shí)例包括但不限于灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)￠1U·BS(Baunsgaard等,1993,AminoacidsequenceofCoprinusmacrorhizusperoxidaseandcDNAsequenceencodingCoprinuscinereusperoxidase.Anewfamilyoffungalperoxidases,Eur.J.Biochem.213(1):605-611(登錄號M8314)；辣根過氧化物BS(Fujiyama等，1988，StructureofthehorseradishperoxidaseisozymeCgenes,Eur.J.Biochem.173(3):681-687(登錄號P15232)；過氧化物氧還酶(peroxiredoxin)(Singh禾口Shichi,1998,Anovelglutathioneperoxidaseinbovineeye.Sequenceanalysis,mRNAlevel,andtranslation,J.Biol.Chem.273(40):26171-26178(登錄號077834)；乳過氧化物酶(Dull等，1990，MolecularcloningofcDNAsencodingbovineandhumanlactoperoxidase,DNACellBiol.9(7):499-509(登錄號P80025)；嗜曙紅細(xì)胞過氧化物酶(Fornhem等，1996,Isolationandcharacterizationofporcinecationiceosinophilgranu1eproteins,Int.Arch.AllergyImmunol.110(2):132-142(登錄號P80550)；多功能過氧化物酶(Ruiz-Duenas等，1999，MolecularcharacterizationofanovelperoxidaseisolatedfromtheligninolyticfungusPleurotuseryngii,Mol.Microbiol.31(1):223-235(登錄號094753)；蕪菁過氧化物酶(Mazza和Welinder，1980，Covalentstructureofturnipperoxidase7.Cyanogenbromidefragments,completestructureandcomparisontohorseradishperoxidaseC,Eur.J.Biochem.108(2)481-489(登錄號P00434)；髓過氧化物酶(Morishita等，1987，Chromosomalgenestructureofhumanmyeloperoxidaseandregulationofitsexpressionbygranulocytecolony-stimulatingfactor,J.Biol.Chem.262(31):15208-15213(登錄號P05164)；peroxidasin禾口peroxidasin同源物(Horikoshietal.,1999,IsolationofdifferentiallyexpressedcDNAsfromp53-dependentapoptoticcells:activationofthehumanhomologueoftheDrosophilaperoxidasingene,Biochem.Biophys.Res.Commun.261(3):864-869(登錄號Q92626)；木質(zhì)素過氧化物酶(Tien和Tu,1987，CloningandsequencingofacDNAforaligninasefromPhanerochaetechrysosporium,Nature326(6112):520-523(登錄號P06181)；錳過氧化物酶(Orth等，1994，CharacterizationofacDNAencodingamanganeseperoxidasefromPhanerochaetechrysosporiumgenomicorganizationofligninandmanganeseperoxidase-encodinggenes,Gene148(1):161-165(登錄號P78733)；α-二氧合酶(alpha-dioxygenase)、二重氧化BS(dualoxidase)>peroxidasin、無脊椎動物peroxinectin、feiperoxidockerin、乳過氧化物酶、髓過氧化物酶、非哺乳類脊椎動物過氧化物酶、過氧化氫酶、過氧化氫酶脂肪氧合酶融合體、二血紅素細(xì)胞色素c過氧化物酶、甲胺利用蛋白(methylamineutilizationprotein)、Dyp型過氧化物酶(DyP-typeperoxidase)、鹵素過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶過氧化物酶、雜合抗壞血酸_細(xì)胞色素c過氧化物酶(hybridascorbate-cytochromecperoxidase)、木質(zhì)素過氧化物Sl(ligninperoxidase)、f孟過氧(manganeseperoxidase)、多功能(versatileperoxidase)IIM過氧化物酶、III型過氧化物酶、烷基氫過氧化物酶(alkylhydr0per0Xidase)D、其他烷基氫過氧化物酶、無血紅素?zé)o金屬鹵素過氧化物酶(no-heme，nometalhaloperoxidase)、無血紅素釩過氧化物酶(no-hemevanadiumhaloperoxidase)、錳過氧化氫酶、NADH過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、半胱氨酸過氧化物氧還酶、thioredoxin依賴性硫醇過氧化物酶和AhpE-樣過氧化物氧還酶(Passard等，2007，Phytochemistry68:1605-1611)。所述具有過氧化物酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。在一個(gè)方面，獲得自給定來源的多肽分泌至胞外。所述具有過氧化物酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有過氧化物酶活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有過氧化物酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)屬多肽。在一個(gè)方面，所述多肽是具有過氧化物酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、!軍i^^yUfelf胃(Bacillusamyloliquefaciens)^M^^^fM(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulms)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有過氧化物酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有過氧化物酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。所述具有過氧化物酶活性的多肽也可以是具有過氧化物酶活性的真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌過氧化物生成酶如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium.鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(fThielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬CTrichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有過氧化物酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有過氧化物酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€#(Mucormiehei)、口f%gig_(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈？包菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica>Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa>yjfl^(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、/j、—冑(Thielaviamicrospore)、卵包梭包殼(Thielaviaovispora)>Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)>(Trichodermakoningii)、^枝(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霄(Trichodermareesei)或參錄色木霄(Trichodermaviride)多肽。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述過氧化物酶是灰蓋鬼傘過氧化物酶。用于分離或克隆編碼具有過氧化物酶活性的多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Irmis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。酶組合物在本發(fā)明的方法中，所述酶組合物可包含任何涉及含纖維素材料至葡萄糖和/或纖維二糖，或者半纖維素至木糖、甘露糖、半乳糖和/或阿拉伯糖的加工的蛋白質(zhì)。所述酶組合物優(yōu)選包含具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性。在一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)木聚糖降解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)木聚糖降解酶。所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶優(yōu)選選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。所述一種或多種(幾種)木聚糖降解酶優(yōu)選選自下組木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物可進(jìn)一步或甚至進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)其他酶活性以改善含纖維素材料的降解。其他優(yōu)選的酶為半纖維素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、內(nèi)切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶(glucuronoylesterases))，果膠酶，蛋白酶，木質(zhì)素水解酶(ligninolyticenzyme)(例如漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、H2O2產(chǎn)生酶、氧化還原酶)，棒曲霉素(expansin)、膨脹素(swollenin)或其組合。在本發(fā)明的方法中，其他酶可在發(fā)酵之前或過程中添加，例如在糖化過程中或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)一種或多種(幾種)酶組合物的其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用于本文中所述工藝的形式，如例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來穩(wěn)定化。具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Sti^ptococcus)JjI霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬O^eudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(toeaplasma)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬蠟菌屬、毛喙殼屬、金孢子菌屬、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、Filikisidium、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、耙齒菌屬、蘑菇屬、L印tospaeria、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、I^seudotrichonympha、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長毛盤菌屬、輪枝孢屬、包腳菇屬或炭角菌屬多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica,Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa>Thielaviaaustraleinsis>Thielaviafimeti>Thielaviamicrospora>Thielaviaovispora>Thielaviaperuvi已na、；)^—冑、毛梭孢殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木MTrichophaeasaccata還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述纖維素分解酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的DNA序列并隨即用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對宿主是同源的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中純化這樣的蛋白質(zhì)來制備。適用于本發(fā)明的商業(yè)性的纖維素分解蛋白制備物的實(shí)例包括，舉例而言，CELLICCtec(NovozymesA/S),CELLUCLAST(NovozymesA/S)、N0V0ZYM188(NovozymesA/S)、CELLUZYME(NovozymesA/S),CEREFL0(NovozymesA/S)和ULTRAFLO(NovozymesA/S)，ACCELERASE(GenencorInt.)、LAMINEX(GenencorInt.)、SPEZYMECP(GenencorInt.)，ROHAMENT7069ff(T^nhmGmbH)，F(xiàn)TRT^K7,YMF(R)LDI(DyadicInternational,Inc.)、FIBREZYMELBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的0.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的0.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加。可以用于本發(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039;W093/15186；美國專利5，275，944；WO96/02551；美國專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253_263；GENBANK登錄號M15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene6311-22;GENBANK登錄號M19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555_563；GENBANK登錄號AB003694)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439)；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號MAL515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號XM_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(SEQIDNO:20)；嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO22)；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO24)；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO26)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO28)；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO30)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO32)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO34)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO36)；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO38)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO40；GENBANK登錄號M15665)。上述SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO28,SEQIDNO30、SEQIDNO32,SEQIDNO34,SEQIDNO36,SEQIDNO38禾口SEQIDNO40的內(nèi)切葡聚糖酶分別由SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO25,SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39的成熟多肽編碼序列編碼?？捎糜诒景l(fā)明的方法的纖維二糖水解酶的示例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO42)；里氏木霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO44)；特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:46)、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO48和SEQIDNO50)、土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)(SEQIDNO52)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I(SEQIDNO54)以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II(SEQIDN0:56)。上述SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO52和SEQIDNO54的纖維二糖水解酶分別由SEQIDNO41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO53和SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列編碼?？捎糜诒景l(fā)明的方法的葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉葡糖苷酶(SEQIDNO58)；煙曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO60)；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶(SEQIDNO62)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:64)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:66)。上述SEQIDNO58、SEQIDNO60、SEQIDNO:62、SEQIDNO64和SEQIDNO66的β-葡糖苷酶分別由SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO63和SEQIDNO65的成熟多肽編碼序列編碼。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)WO2002/095014獲取。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)WO2005/047499獲取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)WO2007/019442獲取。具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲取。所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是SEQIDΝ068的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或SEQIDNO:70的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一個(gè)方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白由SEQIDΝ0:67的多核苷酸編碼，或所述米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO:69的多核苷酸編碼。其它內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根據(jù)HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316禾口HenrissatB.禾口BairochΑ.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316695~696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495,257、EP531，315、EP531，372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、W096/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792,WO2002/101078,W02003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、W02004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利No.4，435，307、美國專利No.5，457，046、美國專利No.5，648，263、美國專利No.5，686，593、美國專利No.5，691，178、美國專利No.5，763，254以及美國專利No.5，776，757。適用于本發(fā)明的商業(yè)性木聚糖降解酶制備物的實(shí)例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHtec(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM),DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)、DEP0L740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEP0L762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(W02009/079210)?？捎糜诒景l(fā)明方法的β-木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)，埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號Q8X212)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號Q7S0W4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號AAB82124)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費(fèi)希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號AAR94170)。可用于本發(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉(Trichodermareesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q99024)、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)、黑曲霉(Aspergillusniger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無機(jī)鹽，使用本領(lǐng)域己知方法(參見，例如Bennett,J.W.禾口LaSure，L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Bailey,J.E.禾口Ollis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hi11BookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何導(dǎo)致酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。核酸構(gòu)建體可構(gòu)建包含與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接的編碼感興趣的多肽(例如一種或多種(幾種)纖維素分解酶、具有過氧化物酶活性的多肽或具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽)的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，使其在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作所述分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-KamarofT等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731),以及tac啟動子(DeBoer等，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican，1980，242:74_94中；和在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其包含在曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動子，其包含在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉和米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號肽，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體可構(gòu)建包含編碼感興趣的多肽(例如，一種或多種(幾種)纖維素分解酶、具有過氧化物酶活性的多肽或具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽)的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體以供在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多肽。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)多核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞可將包含編碼感興趣的多肽(例如，一種或多種(幾種)纖維素分解酶、具有過氧化物酶活性的多肽或具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽)的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞以供所述多肽的重組產(chǎn)生。將包含多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使載體如前所述作為染色體整體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。“真菌”用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi，第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽(yù)角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata),刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法感興趣的多肽(例如一種或多種(幾種)纖維素分解酶、具有過氧化物酶活性的多肽或具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽)，可通過下述方法來產(chǎn)生(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。感興趣的多肽還可通過下述方法來產(chǎn)生(a)如本文所述，在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在所述產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。所述多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明進(jìn)一步通過下述實(shí)施例進(jìn)行描述，其不應(yīng)視為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1嗜熱毀絲霉CBS117.65的生長將來自嗜熱毀絲霉CBS117.65的PDA平板的兩個(gè)栓(plug)接種入含有IOOml搖瓶培養(yǎng)基的500ml搖瓶以獲得用于純化纖維二糖脫氫酶的培養(yǎng)液。PDA平板由39g馬鈴薯右旋糖瓊脂和加至1升的去離子水組成。搖瓶培養(yǎng)基由15g的葡萄糖，4g的K2HPO4,Ig的NaCl，0.2g的MgS04*7H20，2g的不含MES的酸(MESfreeacid)，Ig的細(xì)菌蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5g的檸檬酸，0.2g的CaCl2·2H20,5g的NH4NO3,Iml的微量元素溶液，和加至1升的去離子水組成。所述微量元素溶液由1.2g的FeSO4·7H20,IOg的ZnSO4·7H20,0.7g的MnSO4·H20,0.4g的CuSO4·5H20,0.4g的Na2B4O7·IOH20,0.8g的Na2MoO2·2H20,和加至1升的去離子水組成。將燒瓶在45°C在定軌振蕩器上以200rpm溫育48小時(shí)。將五十ml的燒瓶培養(yǎng)液用于接種2升發(fā)酵容器。將總共1.8升的發(fā)酵分批培養(yǎng)基添加至2升玻璃夾套發(fā)酵器(glassjacketedfermentor)(ApplikonBiotechnology,Schiedam,Netherlands)。將發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基以4g/1/小時(shí)的速率在72小時(shí)的時(shí)間劑量添加。發(fā)酵分批培養(yǎng)基由5g的酵母提取物，176g的粉末狀纖維素，2g的葡萄糖，Ig的NaCl,Ig的細(xì)菌蛋白胨，4g的K2HPO4,0.2g的CaCl2·2H20，0.2g的MgSO4.7H20,2.5g的檸檬酸，5g的NH4NO3,1.8ml的消泡劑，Iml的微量元素溶液，和加至1升的去離子水組成。將發(fā)酵容器維持在45°C的溫度，并使用Applikon1030控制系統(tǒng)(ApplikonBiotechnology,Schiedam,Netherlands)將pH控制在5.6+/-0.1的設(shè)定點(diǎn)。將空氣以Ivvm的速率添加至容器，并通過以1100至1300rpm旋轉(zhuǎn)的Rushton葉輪攪拌培養(yǎng)液。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，從容器收獲所有的培養(yǎng)液，并以3000xg離心以去除生物質(zhì)。實(shí)施例2嗜熱毀絲霉CBS117.65纖維二糖脫氫酶的純化將實(shí)施例1中所述收獲的嗜熱毀絲霉CBS117.65培養(yǎng)液在500ml瓶中以13000xg在4°C離心20分鐘，然后使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford,MA,USA)過濾滅菌。濃縮經(jīng)過濾的培養(yǎng)液，并用20mMTris-HClpH8.5使用配置IOkDa聚醚砜膜(PallFiltron,Northborough,MA,USA)^W^"Μ·^^(tangentialflowconcentrator)(PallFiltron,Northborough,MA,USA)進(jìn)行緩沖液交換。為了減少色素的量，將濃縮物施加于用20mMTris-HClpH8.5平衡的60mlQ-SEPHAR0SEBIGBEAD柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)，并用含有600mMNaCl的平衡緩沖液逐步洗脫。通過使用8-16%CRITERIONSDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)和以GELC0DEBlue蛋白質(zhì)染料(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)染色的SDS-PAGE分析流過物和洗脫物級分。根據(jù)通過SDS-PAGE對應(yīng)于表觀分子量大約IOOkDa的條帶的存在判斷洗脫物級分含有纖維二糖脫氫酶(CBDH)(Schou等，1998，Biochem.J.330565-571)。洗脫物級分使用配置IOkDa聚醚砜膜的AMIC0N超濾裝置(Millipore，Bedford，MA,USA)濃縮，并使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHeathcare，Piscataway，NJ，USA)緩沖液交換至20mMTris-HClpH8.5中。將經(jīng)脫鹽的材料加載于用20mMTris-HClpH8.5平衡的MONOQ柱(HR16/10,GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上。將結(jié)合的蛋白質(zhì)用20mMTris-HClpH8.5中從0至500mM(18個(gè)柱體積)的線性NaCl梯度進(jìn)行洗脫。如上所述通過SDS-PAGE分析級分，且纖維二糖脫氫酶在大約350-400mMNaCl洗脫。匯集含有纖維二糖脫氫酶的級分(60ml)并將其與等體積的含有3.4M硫酸銨的20mMTris-HClpH7.5混合以產(chǎn)生終濃度1.7M的硫酸銨。在加載于用20mMTris-HClpH7.5中的1.7M硫酸銨平衡的PhenylSuperose柱(HR16/10，GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上之前過濾樣品(0.2μM注射器過濾器，聚醚砜膜，Whatman,Maidstone,UnitedKingdom)以去除顆粒狀物質(zhì)。結(jié)合的蛋白質(zhì)用20mMTris-HClpH7.5中的1.7—OM遞減的硫酸銨梯度(12個(gè)柱體積)洗脫。如上所述通過SDS-PAGE分析級分，且纖維二糖脫氫酶在大約SOOmM硫酸銨洗脫。如通過SDS-PAGE判斷，纖維二糖脫氫酶級分>90%純。如Schou等，1998，見上所述，在纖維二糖存在下通過2，6-二氯靛酚(DCIP)還原測定法確證CBDH活性。匯集了含有纖維二糖脫氫酶的級分，將其濃縮，并通過以1877xg使用VIVASPIN20離心濃縮器(IOkDa聚醚砜膜；Sartorius，G0ttingen,Germany)在SORVALLRT7離心機(jī)(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)中的離心濃縮而緩沖液交換至20mMTris-HClpH7.5中。蛋白質(zhì)濃度使用MicroplateBCAProteinAssayKit(ThermoFischerScientific,ffaltham,MA,USA)確定，其中牛血清白蛋白用作蛋白質(zhì)標(biāo)樣。實(shí)施例3玉米秸稈的預(yù)處理玉米禾吉禾干是在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)使用稀硫酸進(jìn)行預(yù)處理的。使用下述條件用于預(yù)處理在165°C和107psi用1.硫酸進(jìn)行8分鐘。依照NREL，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)中的水不溶性固體含有56.5%纖維素、4.6%半纖維素和28.4%木質(zhì)素。纖維素和半纖維素通過使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002進(jìn)行兩階段硫酸水解隨后通過高效液相色譜進(jìn)行糖分析來確定。木質(zhì)素是使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003通過重量分析在用硫酸水解纖維素和半纖維素級分之后確定的。在玻璃過濾器中用大體積的DDI水洗滌PCS。實(shí)施例4過氧化物酶在纖維二糖脫氫酶存在或不存在下對經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)水解的作用在嗜熱毀絲霉CBS117.65纖維二糖脫氫酶(⑶H)的存在或不存在下評價(jià)辣根過氧化物酶(HRP)對PCS水解的作用。PCS水解是使用含有總反應(yīng)體積1.Oml的2.2ml深孔板(Axygen，UnionCity,CA,USA)進(jìn)行的。水解是用在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.O緩沖液中每ml的50mg未洗滌的PCS和^ig每gPCS的里氏木霉纖維素酶組合物(補(bǔ)充了可從NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark或的的米曲霉β-葡糖苷酶的CELLUCLAST;該纖維素酶組合物在本文中在實(shí)施例中命名為“里氏木霉纖維素酶組合物”)進(jìn)行的。將纖維二糖脫氫酶以O(shè)至10%(w/w)總蛋白的濃度添加。然后將板使用ALPS-300板熱密封器(Abgene，Epsom，UnitedKingdom)密封，充分混合，并在50°C以150rpm振蕩溫育72小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。在M至72小時(shí)溫育的多個(gè)時(shí)點(diǎn)，移出100μ1等分試樣并通過HPLC使用下述實(shí)驗(yàn)方案測定水解程度。確立纖維二糖脫氫酶依賴性纖維素酶抑制，然后添加辣根過氧化物酶以消除任何任何產(chǎn)生的過氧化物。將辣根過氧化物酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)從每μ1為1單位的儲液以圖1中所示終濃度添加。一個(gè)單位的辣根過氧化物酶定義為在20°C在pH6.O以20秒從連苯三酚形成1.Omg紅掊酚(purpurogallin)所需的酶量。添加高濃度的辣根過氧化物酶以確保存在充分的過氧化物酶活性。未添加AmplexRed或其他電子受體。對于HPLC分析，用0.45μmMULTISCREEN96-孔過濾板(Millipore，Bedford,MA,USA)過濾樣品，并如下所述對濾過物就糖含量進(jìn)行分析。當(dāng)不立即使用時(shí)，將經(jīng)過濾的等分試樣凍結(jié)于-20°C。在0.005MH2SO4中稀釋的樣品的糖濃度是使用4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)通過用0.5%w/w苯甲酸-5mMH2SO4以每分鐘0.6ml的流速在65°C洗脫11分鐘，并通過用純糖樣品校準(zhǔn)的、積分來自折射率檢測(CHEMSTATION,AGILENT1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)的葡萄糖和纖維二糖信號的定量來進(jìn)行測量的。所得的當(dāng)量用于計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。每個(gè)水解的程度確定為總纖維素轉(zhuǎn)化為纖維二糖+葡萄糖的分?jǐn)?shù)，且不對PCS液中存在的可溶性糖進(jìn)行校正。所有HPLC數(shù)據(jù)處理是使用Kaleidagraph軟件(Synergysoftware,Reading,PA,USA)進(jìn)行的。對測得的糖濃度就適當(dāng)?shù)南♂屢蜃舆M(jìn)行調(diào)整。將葡萄糖和纖維二糖通過色譜法分離并整合，并分別確定其相應(yīng)的濃度。然而，為了計(jì)算總轉(zhuǎn)化，合并葡萄糖和纖維二糖的值。水解分?jǐn)?shù)確定為總質(zhì)量轉(zhuǎn)化率[葡萄糖+纖維二糖]/[總纖維素]。對三次重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果(圖1)說明嗜熱毀絲霉纖維二糖脫氫酶的遞增濃度導(dǎo)致減少的水解。在這些具體水解條件下，10%纖維二糖脫氫酶的添加導(dǎo)致大約5%的水解喪失。在4%的纖維二糖脫氫酶，其中里氏木霉纖維素酶組合物受中等抑制，水解程度在最低濃度的每ml1單位辣根過氧化物酶時(shí)得到完全恢復(fù)。實(shí)施例5辣根過氧化物酶對經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)水解的作用在不存在嗜熱毀絲霉CBS117.65纖維二糖脫氫酶時(shí)確定辣根過氧化物酶(HRP)對里氏木霉纖維素酶組合物水解PCS的作用。PCS水解是使用含有總反應(yīng)體積1.Oml的2.2ml深孔板進(jìn)行的。水解是用在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.0緩沖液中每ml的50mg未洗滌的PCS和4mg每gPCS的里氏木霉纖維素酶組合物進(jìn)行的。將辣根過氧化物酶以每ml0-4單位添加。然后將板使用ALPS-300板熱密封器密封，充分混合，并在50°C以150rpm振蕩溫育72小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。水解程度的HPLC分析是依照實(shí)施例4中所述的步驟進(jìn)行的。結(jié)果(圖2)說明水解程度隨辣根過氧化物酶活性在測試的過氧化物酶活性范圍內(nèi)線性增加，且在3日溫育，水解程度對辣根過氧化物酶活性的依賴性大約高至2倍。以每ml4單位添加辣根過氧化物酶與不用辣根過氧化物酶進(jìn)行的反應(yīng)相比水解增加了大約10%，無論是進(jìn)行1日還是3日水解。實(shí)施例6灰蓋鬼傘過氧化物酶的制備灰蓋鬼傘過氧化物酶如WO1992/016634和Xu等，2003，“FusionproteinscontainingCoprinuscinereusperoxidaseandthecellulose-bindingdomainofHumicolainsolensfamily45endoglucanase，，inApplicationofEnzymestoLignocellulosics(Mansfield,S.D.禾口Saddler,J.N.編)pp.382-402,AmericanChemicalS0Ciety，Washingt0n，DC中所述進(jìn)行純化。純化方案包括超濾和陰離子交換層析。無細(xì)胞的灰蓋鬼傘過氧化物酶液(pH7.7，IlmS電導(dǎo)率)用Whatman#2紙過濾，并用聚醚砜膜(30kD分子量截?cái)嘀?超濾。然后將經(jīng)洗滌和濃縮的液(pH7.7，lmS)加載于用5mMCaCl2-IOmMTris-HClpH7.6(BufferΑ)預(yù)平衡的Q-SEPHAROSEBIGBEAD柱。將用5%BufferB(BufferA加上2MNaCl)洗脫的活性級分洗滌至lmS，然后施于用BufferA預(yù)平衡的M0N0-Q柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)。再次使用BufferB進(jìn)行洗脫。將級分就過氧化物酶活性和通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。過氧化物比活性是在30°C用0.IM磷酸鈉pH7,0.9mMH2O2和1.7mM2，2，-聯(lián)氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2，-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid))(ABTS)通過監(jiān)測在418nm的吸光度增加來測定的。使用630μM過氧化物酶儲液濃度。實(shí)施例7多種過氧化物酶對經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)水解的作用確定了多種過氧化物酶對里氏木霉纖維素酶組合物水解PCS的作用。所述過氧化物酶包括錳過氧化物酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)、牛乳乳過氧化物酶(bovinemilklactoperoxidase)(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0,USA)、木質(zhì)素過氧化物酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0,USA)和灰蓋鬼傘過氧化物酶(實(shí)施例6)。一個(gè)單位的錳過氧化物酶定義為在PH4.5和25°C每分鐘將1μmolMn2+氧化為Mn3+所需的酶量。一個(gè)單位的乳過氧化物酶定義為在PH6.0和20°C以20秒從連苯三酚生成1.Omg紅掊酚所需的酶量。一個(gè)單位的木質(zhì)素過氧化物酶定義為在PH3.0和30°C每分鐘氧化Iymol3，4_二甲氧基芐醇所需的酶量。一個(gè)單位的灰蓋鬼傘過氧化物酶定義為每分鐘消耗1μmolH2O2所需的酶量。PCS水解是使用含有總反應(yīng)體積1.Oml的2.2ml深孔板進(jìn)行的。水解是用在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.0緩沖液中每ml的50mg未洗滌的PCS和4mg每gPCS的里氏木霉纖維素酶組合物進(jìn)行的。將錳過氧化物酶、乳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和灰蓋鬼傘過氧化物酶從下述儲液錳過氧化物酶每μ10.005單位，每μ150Ug；木質(zhì)素過氧化物酶每μ10.04單位，每μ120μg；乳過氧化物酶每μ10.2單位，每μ15μg；和灰蓋鬼傘過氧化物酶630μM；以0-100μ1的體積添加以給出圖3所示的終濃度。然后將板使用ALPS-300板熱密封器密封，充分混合，并在50°C以150rpm振蕩溫育72小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。水解程度的HPLC分析是依照實(shí)施例5中所述的步驟進(jìn)行的。結(jié)果(圖幻說明除了錳過氧化物酶之外，每個(gè)過氧化物酶以濃度依賴性方式增強(qiáng)PCS水解。該作用在所用的濃度下并未飽和。本發(fā)明進(jìn)一步通過下述段落描述[1]用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。[2]段落1的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[3]段落1或2的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。[4]段落1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。[5]段落1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。[6]段落1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料是玉米秸稈。[7]段落1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[8]段落1-7任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包含回收經(jīng)降解的纖維素材料。[9]段落8的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。[10]段落9的方法，其中所述糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。[11]段落1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM的范圍。[12]段落1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的存在與所述具有過氧化物酶活性的多肽不存在相比增加纖維素材料的水解。[13]用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[14]段落13的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[15]段落13或14的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。[16]段落13-15任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。[17]段落13-16任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。[18]段落13-17任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料是玉米秸稈。[19]段落13-18任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[20]段落13-19任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[21]段落13-20任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM的范圍。[22]段落13-21任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的存在與所述具有過氧化物酶活性的多肽不存在相比增加纖維素材料的水解。[23]發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物水解所述纖維素材料。[24]段落23的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[25]段落23或M的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。[26]段落23-25任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。[27]段落2346任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。[28]段落23-27任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料是玉米秸稈。[29]段落2318任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[30]段落23-任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[31]段落30的方法，進(jìn)一步包括回收發(fā)酵產(chǎn)物。[32]段落31的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[33]段落23-32任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM的范圍。[34]段落23-33任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的存在與所述具有過氧化物酶活性的多肽不存在相比增加纖維素材料的水解。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM。10.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。13.權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。14.權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。16.權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM。17.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物水解所述纖維素材料。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶和漆酶。21.權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。22.權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。23.權(quán)利要求17-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。24.權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收發(fā)酵產(chǎn)物。25.權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述具有過氧化物酶活性的多肽的Km為優(yōu)選0.0001至50mM，更優(yōu)選0.001至10mM，甚至更優(yōu)選0.005至ImM，且最優(yōu)選0.01至0.ImM。全文摘要本發(fā)明涉及用于增加纖維素材料水解的方法，包括在具有過氧化物酶活性的多肽存在下用酶組合物水解所述纖維素材料。文檔編號C12P7/10GK102325893SQ200980157177公開日2012年1月18日申請日期2009年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者J.奎因蘭,徐豐申請人:諾維信股份有限公司