專(zhuān)利名稱(chēng)：定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法和使用該方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法和使用所述定量方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種在皮膚細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)定由外感刺激所引起的細(xì)胞變化的方法，其中，通過(guò)細(xì)胞生物化學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞變化的程度，所述細(xì)胞變化是通過(guò)對(duì)待培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞施用適當(dāng)?shù)牧N外感病邪刺激而得到的， 使得能科學(xué)并定量地表達(dá)在現(xiàn)有技術(shù)中提出的六種外感病邪的概念性效果，并且本發(fā)明涉及一種使用所述測(cè)定方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法。
背景技術(shù)：
在中國(guó)本草醫(yī)學(xué)中，“六種外感病邪(six external evils) ”指的是對(duì)人體有副作用的因素，即，疾病的起因，并且通常指的是外感致病因素，包括風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火。通常，風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火為自然界中六種不同的氣候變化，并且被稱(chēng)為“六種大氣影響”。這六種大氣影響為萬(wàn)事萬(wàn)物生長(zhǎng)的條件。這六種大氣影響在正常狀態(tài)下對(duì)人體無(wú)害。但是， 如果氣候變化異常并且這六種大氣影響的產(chǎn)生過(guò)度或不足，則這六種大氣影響變成引起疾病的因素并且侵襲人體以引起疾病。在這種情況下，這六種大氣影響被稱(chēng)作“六種過(guò)度或六種病邪”。六種過(guò)度主要可以引起面部和皮膚區(qū)域的狀況變化。由于面部區(qū)域總是暴露于外部環(huán)境，面部區(qū)域必須承受外部條件的變化，包括風(fēng)、寒和暑。皮膚用作第一防御屏障用于保護(hù)人體免受六種過(guò)度的侵襲。如果六種過(guò)度侵襲人體，它們將引起皮膚老化，具體地，嚴(yán)寒、酷暑、干燥和強(qiáng)日光將對(duì)皮膚引起非常嚴(yán)重的破壞。在人類(lèi)生存環(huán)境中皮膚的生理學(xué)老化現(xiàn)象與六種過(guò)度緊密相關(guān)。六種過(guò)度用作皮膚老化現(xiàn)象的外部起因，以直接引起各種皮膚疾病和五種感覺(jué)器官疾病或者使疾病更嚴(yán)重。在化妝品領(lǐng)域，已開(kāi)發(fā)了多種草本化妝品產(chǎn)品，此外，各種草本理論已適用于制造化妝品產(chǎn)品。但是，即使這六種過(guò)度的概念用于制造草本化妝品產(chǎn)品，也不能科學(xué)和客觀(guān)地證明草本化妝品產(chǎn)品的材料的效果。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題因此，本發(fā)明人通過(guò)細(xì)胞生物化學(xué)技術(shù)，使用皮膚細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，直觀(guān)并定量了對(duì)應(yīng)于六種過(guò)度的外感刺激和由外感刺激所引起的皮膚細(xì)胞變化，從而開(kāi)發(fā)了一種篩選能防護(hù)皮膚免受六種外感病邪的材料的方法，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是構(gòu)建一種能科學(xué)表達(dá)由六種外感病邪所引起的皮膚變化的皮膚細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并且通過(guò)所構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法以及使用所述定量方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法。技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇適當(dāng)?shù)牧N外感病邪的皮膚刺激，所述六種外感病邪包括風(fēng)、寒、暑、濕、 燥和火病邪；(b)根據(jù)每一種刺激，確定能測(cè)定皮膚細(xì)胞變化的細(xì)胞生物化學(xué)方法；(c)通過(guò)所述生物化學(xué)方法測(cè)定受試者的皮膚狀況；(d)使用每一種刺激來(lái)刺激皮膚，隨后根據(jù)刺激的強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞變化的程度； 和(e)向皮膚施用防御皮膚免受六種外感病邪的藥草，隨后通過(guò)生物化學(xué)方法測(cè)定和定量皮膚狀況。本發(fā)明還提供了一種使用用于定量皮膚變化的所述方法來(lái)篩選改善皮膚狀況的材料的方法。有益效果用于定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的本發(fā)明的方法能科學(xué)和定量地表達(dá)在皮膚細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中施用對(duì)應(yīng)于六種外感病邪的刺激之后的皮膚變化。這種定量檢測(cè)的結(jié)果能通過(guò)對(duì)應(yīng)于所施用的刺激的藥草的效果再次確認(rèn)。因此，在發(fā)現(xiàn)的可用于制造草本化妝品產(chǎn)品的材料中，材料的草本效果能通過(guò)科學(xué)結(jié)論客觀(guān)地表達(dá)，由此提高化妝品產(chǎn)品的效果。另外，這種方法能廣泛地適用于從化妝品產(chǎn)品的使用者得到皮膚樣品并測(cè)定使用者的皮膚狀況的變化的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是針對(duì)一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇適當(dāng)?shù)牧N外感病邪的皮膚刺激，所述六種外感病邪包括風(fēng)、寒、暑、濕、 燥和火病邪；(b)根據(jù)每一種刺激，確定能測(cè)定皮膚細(xì)胞變化的細(xì)胞生物化學(xué)方法；(c)通過(guò)所述生物化學(xué)方法測(cè)定受試者的皮膚狀況；(d)使用每一種刺激來(lái)刺激皮膚，隨后根據(jù)刺激的強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞變化的程度； 和(e)向皮膚施用防御皮膚免受六種外感病邪的藥草，隨后通過(guò)生物化學(xué)方法測(cè)定和定量皮膚狀況。本文使用的術(shù)語(yǔ)“六種外感病邪”指的是刺激皮膚以引起皮膚老化的六種外部因素，包括風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火病邪。本文使用的短語(yǔ)“由六種外感病邪所引起的皮膚變化”意味著包括在暴露于六種外感病邪之前和之后期間的通常的皮膚變化。優(yōu)選地，所述短語(yǔ)是指由六種外感病邪所引起的皮膚破壞，并且皮膚破壞的例子包括但不限于皮膚老化、色素沉著、皮膚干燥和皮膚困擾。本文使用的術(shù)語(yǔ)“改善皮膚狀況的材料”指的是具有改善由六種外感病邪所引起的皮膚老化、色素沉著、皮膚干燥或皮膚困擾的效果的材料。
下文中將進(jìn)一步詳細(xì)描述用于定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的本發(fā)明方法的各步驟。首先，選擇適當(dāng)?shù)牧N外感病邪的刺激。在本發(fā)明中，基于中國(guó)醫(yī)藥書(shū)籍如《東醫(yī)寶鑒》(Donguibogam)的觀(guān)念，選擇誘導(dǎo)炎癥的因素作為風(fēng)刺激，選擇低溫刺激用于寒病邪， 選擇高溫刺激用于暑病邪，選擇活性氧物類(lèi)(R0Q用于濕病邪，選擇紫外光刺激用于火病邪。現(xiàn)在將進(jìn)一步詳細(xì)描述所選的刺激。1)風(fēng)病邪對(duì)應(yīng)于風(fēng)病邪的刺激為能在皮膚上引起炎癥的因素。能用于本發(fā)明的誘導(dǎo)炎癥的因素的例子包括大氣污染物如甲醛、變應(yīng)性材料如蜱和花粉、黃沙、細(xì)菌脂多糖(LPS)、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(phorbol myristate acetate) (PMA)和誘導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子。在本發(fā)明中，基于測(cè)試樣品(或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞)的重量，誘導(dǎo)炎癥的因素的用量可以是 0. 0001-10重量％。如果誘導(dǎo)炎癥的因素的用量小于0. 0001重量％，則不能誘導(dǎo)具有適當(dāng)強(qiáng)度的刺激，而如果超過(guò)10重量％，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死。通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任何常規(guī)方法，通過(guò)如上所述使用風(fēng)病邪作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)測(cè)定TNF- α和PGE2的產(chǎn)生的變化或誘導(dǎo)TNF- α和PGE2 的C0X-2蛋白質(zhì)的產(chǎn)生或活性的變化來(lái)測(cè)定皮膚變化。此外，還可以適當(dāng)使用與炎癥相關(guān)的或與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)。2)寒病邪對(duì)應(yīng)于寒病邪的刺激為能對(duì)皮膚引起破壞的寒刺激。寒刺激設(shè)定在低于皮膚溫度的溫度。所設(shè)定的溫度可以從室溫(約35°C )到低溫(約_40°C )。如果設(shè)定溫度低于_40°C，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死，而如果高于35°C，由于在正常體溫范圍內(nèi)，則作為寒刺激將沒(méi)有意義。通過(guò)如上所述使用寒病邪作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)適當(dāng)利用細(xì)胞增殖率的變化、細(xì)胞代謝的變化以及本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)來(lái)測(cè)定皮膚變化。3)暑病邪對(duì)應(yīng)于暑病邪的刺激為能對(duì)皮膚引起破壞的熱刺激。熱刺激設(shè)定在高于皮膚溫度的溫度。所設(shè)定的溫度可以從39°C到50°C。如果設(shè)定溫度低于39°C，由于在正常體溫范圍內(nèi)，則作為熱刺激將沒(méi)有意義，而如果高于50°C，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死。通過(guò)如上所述使用熱作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)適當(dāng)利用細(xì)胞破壞的變化、細(xì)胞代謝的變化以及本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)來(lái)測(cè)定皮膚變化。4)濕病邪在本發(fā)明中，因?yàn)橹饕捎谠谟昙静患兊暮团K的物質(zhì)的累積而發(fā)生由濕病邪所引起的皮膚破壞，我們認(rèn)為強(qiáng)潮濕的環(huán)境與不純的和臟的物質(zhì)在皮膚上累積以增加作為能量代謝的副產(chǎn)物而產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物類(lèi)的量有關(guān)。出于這種原因，選擇反應(yīng)性氧物類(lèi)刺激作為對(duì)應(yīng)于濕病邪的刺激。反應(yīng)性氧物類(lèi)刺激不僅包括直接處理的反應(yīng)性氧物類(lèi)，而且還包括處理體內(nèi)誘導(dǎo)反應(yīng)性氧物類(lèi)的材料或刺激。例如，反應(yīng)性氧物類(lèi)刺激可以包括能通過(guò)芬頓反應(yīng)誘導(dǎo)反應(yīng)性氧自由基的如狗(13或!^eCl2的材料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用H2A刺激，但是本發(fā)明的范圍不局限于此。H2O2刺激優(yōu)選地通過(guò)以0. OOl-IOmM的劑量施用H2O2來(lái)進(jìn)行。如果劑量小于 0. OOlmM,則刺激的強(qiáng)度低以至于難以與正常狀態(tài)比較。另一方面，如果劑量超過(guò)10mM，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死。通過(guò)如上所述使用濕病邪作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)適當(dāng)利用細(xì)胞破壞的變化、細(xì)胞抗氧化劑系統(tǒng)的變化以及本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)來(lái)測(cè)定皮膚變化。5)燥病邪對(duì)應(yīng)于燥病邪的刺激為能對(duì)皮膚引起破壞的干燥刺激。干燥刺激不僅包括將皮膚直接暴露于干燥空氣，而且還包括處理體內(nèi)誘導(dǎo)類(lèi)似反應(yīng)的材料或刺激。本文使用的術(shù)語(yǔ)“干燥空氣”是指水分含量低于60%的空氣。如果使用水分含量為35%的干燥空氣作為刺激，則暴露時(shí)間可以限定在5分鐘到20分鐘之間。如果暴露時(shí)間小于5分鐘，則干燥刺激的強(qiáng)度低，而如果超過(guò)20分鐘，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死。但是， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所室內(nèi)濕度的測(cè)定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地控制具體的實(shí)驗(yàn)條件(水分含量、暴露時(shí)間，等)。通過(guò)如上所述使用燥病邪作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)適當(dāng)利用細(xì)胞破壞的變化、細(xì)胞增殖率的變化、體內(nèi)鈣信導(dǎo)系統(tǒng)的變化以及本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)來(lái)測(cè)定皮膚變化。6)火病邪對(duì)應(yīng)于火病邪的刺激可以是能對(duì)皮膚引起破壞的日光刺激。日光刺激的例子包括UV-B刺激、UV-A刺激、可見(jiàn)光刺激和頂刺激。日光刺激優(yōu)選地通過(guò)以5-200mJ/ cm2的劑量照射日光來(lái)進(jìn)行。如果劑量小于5mJ/cm2，則刺激的強(qiáng)度低以至于難以與正常狀態(tài)比較，而如果超過(guò)200mJ/cm2，則刺激的強(qiáng)度太強(qiáng)而使得所有細(xì)胞被殺死。通過(guò)如上所述使用火病邪作為刺激的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)定量皮膚變化的方法能通過(guò)適當(dāng)利用細(xì)胞破壞的變化、身體防御系統(tǒng)的變化以及本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它與皮膚相關(guān)的生物學(xué)指數(shù)來(lái)測(cè)定皮膚變化。上述六種刺激對(duì)應(yīng)于六種外感病邪，而在六種內(nèi)感病邪的情況下，可以適用其它機(jī)理和刺激。在本發(fā)明中所述的六種外感病邪能單獨(dú)侵襲身體，并且兩種或更多種外感病邪能同時(shí)侵襲身體并且可以轉(zhuǎn)化為其它類(lèi)型的病邪。由此，適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)指數(shù)和適當(dāng)?shù)牡湫偷乃幉菘梢赃m用于六種外感病邪。例如，風(fēng)病邪可以侵襲身體并變化為暑病邪(稱(chēng)為“風(fēng)-暑病邪”)，并且寒病邪可以變化為濕病邪(稱(chēng)為“寒-濕病邪”)。接著，確定每一種刺激的強(qiáng)度和每一種刺激的適當(dāng)?shù)募?xì)胞生物化學(xué)方法。根據(jù)在選擇步驟中所述的刺激的種類(lèi)，使用能特性使用的細(xì)胞生物化學(xué)方法進(jìn)行這種確定步驟。 通過(guò)證實(shí)典型的藥草和對(duì)應(yīng)于此能恢復(fù)由六種外感病邪(即，風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火病邪) 所引起的變化的草本藥方減輕或抑制細(xì)胞反應(yīng)，能通過(guò)變化的顯著差異確定由風(fēng)病邪所引起的皮膚老化。用于定量所進(jìn)行的細(xì)胞生物化學(xué)方法可以包括本領(lǐng)域眾所周知的所有常規(guī)方法。 例如，細(xì)胞生物化學(xué)方法包括用于定量由風(fēng)病邪所引起的皮膚變化的TNF-α ELISA、PGE2 ELISA或白細(xì)胞介素表達(dá)分析；用于定量由寒病邪所引起的皮膚變化的細(xì)胞增殖檢測(cè)或 FAS分析；用于定量由暑病邪所引起的皮膚變化的RT-PCR或免疫細(xì)胞化學(xué)；用于定量由濕病邪所引起的皮膚變化的黑色素分析、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)或DCFH-DA( 二氯氫化熒光素二乙酸酯檢測(cè))；用于定量由燥病邪所引起的皮膚變化的免疫細(xì)胞化學(xué)；和用于定量由火病邪所引起的皮膚變化的DAPI染色法或β-gal染色法。這種分析方法共同的特性在于包括細(xì)胞因子的分析、抗氧化劑活性的分析、細(xì)胞毒性的分析、細(xì)胞增殖的分析以及特定蛋白質(zhì)和基因變化方式的分析。另外，在本發(fā)明中，使用MTT檢測(cè)、LDH檢測(cè)、彗星實(shí)驗(yàn)以及采用能測(cè)定細(xì)胞變化的特定抗體的蛋白質(zhì)印跡分析，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞生長(zhǎng)率、細(xì)胞膜破壞、DNA破壞和特定蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，能定量皮膚變化。能用于本發(fā)明的細(xì)胞為能使用單層培養(yǎng)和3D組織培養(yǎng)的所有皮膚細(xì)胞，包括能主要從人和動(dòng)物皮膚分離和培養(yǎng)的角質(zhì)化細(xì)胞。此外，也可以使用歸功于皮膚免疫力的巨噬細(xì)胞系如RAW沈4.7細(xì)胞。此外，也可以使用人活體解剖組織。最后，證實(shí)選作防御皮膚免受六種外感病邪的典型的藥草的上述方法的適用性。在這步中，通過(guò)確定選作為六種外感病邪的刺激和選作為度量指數(shù)的那些物質(zhì)是否能使藥草的效果被證實(shí)，能測(cè)定對(duì)照組與測(cè)試組之間的顯著差異。能用于本發(fā)明的藥草不僅包括具有常規(guī)藥草的性能和特性的那些，而且還包括基于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥書(shū)籍如《東醫(yī)寶鑒》和《傷寒論》(Sanghanrhon)(傷寒理論)所做出的藥方或者基于東方醫(yī)生的東方醫(yī)學(xué)診斷所做出的藥方。藥草的更具體的例子包括但不限于白芷 (Angelica dahurica)、干姜(Zingiberis officinale)、金銀花(Lonicera japonica)、貝力口爾黃零(Scutellaria baicalensis)、地黃(Rehmannia glutinosa)禾口知母(Anemarrhena asphodeloides)0另外，本發(fā)明涉及一種使用用于定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的上述方法來(lái)篩選改善皮膚狀況的材料的方法。用于篩選改善皮膚狀況的材料的本發(fā)明的方法包括以下步驟1)向細(xì)胞中加入候選物質(zhì)，并且使用至少一種選自六種外感病邪的刺激來(lái)刺激已加入候選物質(zhì)的細(xì)胞，所述六種外感病邪包括風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火病邪；2)在步驟1)的刺激之前或之后，使用作為正對(duì)照組的藥草與候選物質(zhì)一起處理細(xì)胞；3)通過(guò)細(xì)胞生物化學(xué)方法測(cè)定和定量皮膚狀況；和4)比較由候選物質(zhì)所得到的定量值與由作為正對(duì)照組的藥草所得到的定量值，以確定候選物質(zhì)的效果。用于上述篩選方法的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、六種外感病邪的刺激、細(xì)胞生物化學(xué)方法以及用作正對(duì)照組的藥草可以與用于定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的上述方法的那些相同。這種篩選方法不僅可以廣泛適用于單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，而且還可以適用于人皮膚。實(shí)施例下文中，將參考實(shí)施例和測(cè)試實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋成限制本發(fā)明的范圍，并且在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，可以進(jìn)行各種修改、替代和添加。參考實(shí)施例1 藥草提取物的制備將白芷、干姜、金銀花、貝加爾黃芩、地黃和知母每種Ikg分別用5L70%乙醇提取3 小時(shí)，隨后過(guò)濾。將剩余的濾出液減壓濃縮，由此得到每一種藥草的70%乙醇提取物。這些樣品用于進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1 用于定量由風(fēng)病邪所引起的皮膚變化的方法在37°C和5% CO2條件下，將人的角質(zhì)化HaCaT細(xì)胞在10% FBS-DMEM中培養(yǎng)。以 5 X IO5細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到6-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用1 μ g/ml LPS處理，以誘導(dǎo)風(fēng)病邪。將經(jīng)風(fēng)病邪誘導(dǎo)的測(cè)試組用具有驅(qū)風(fēng)、減輕外部綜合癥和驅(qū)風(fēng)濕性能的10yg/ml 的藥草白芷提取物(參考實(shí)施例1)處理，檢驗(yàn)用藥草提取物處理的效果。未用LPS和白芷提取物處理的所培養(yǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照組，相對(duì)于對(duì)照組，通過(guò)測(cè)定C0X-2(環(huán)加氧酶-2)蛋白質(zhì)的表達(dá)和活性的變化來(lái)定量由風(fēng)病邪所引起的皮膚變化。在用測(cè)試材料處理一天后，收集樣品，已分裂的細(xì)胞溶液用10% SDS-凝膠電泳展開(kāi)，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，隨后硝化纖維素膜用5%無(wú)脂奶阻斷。使用C0X-2單克隆抗體， 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析已阻斷的硝化纖維素膜，通過(guò)光密度計(jì)測(cè)定在炎性反應(yīng)中起到重要作用的C0X-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。測(cè)定結(jié)果示于下表1。表 1由用作風(fēng)刺激的LPS所引起的C0X-2表達(dá)的增加以及白芷提取物的效果
LPS處理白芷提取物的處理COX-2(AU)的表達(dá)程度COX-2表達(dá)的增加率(％)--7230.0+-1571117.3++121868.5由表1中的結(jié)果可見(jiàn)，白芷提取物顯示將LPS-誘導(dǎo)的炎癥抑制了約40%的效果。 這表明，誘導(dǎo)炎癥的因素如LPS能用作風(fēng)刺激并且蛋白質(zhì)如C0X-2能用作測(cè)定細(xì)胞變化的指數(shù)。實(shí)施例2 定量由寒病邪所引起的皮膚變化的方法在37°C和5% CO2條件下，將人的角質(zhì)化HaCaT細(xì)胞在10% FBS-DMEM中培養(yǎng)。以 2X IO5細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種到3. 5-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并在_15°C下溫育，以誘導(dǎo)寒病邪。將經(jīng)寒病邪-誘導(dǎo)的測(cè)試組用具有驅(qū)寒性能同時(shí)保持溫度的10 μ g/ml藥草干姜提取物(參考實(shí)施例1)處理，檢驗(yàn)用藥草處理的效果。未經(jīng)低溫處理但用干姜提取物處理的所培養(yǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照組，使用MMT分析，相對(duì)于對(duì)照組，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率的變化來(lái)定量由寒病邪所引起的皮膚變化。在低溫處理和用測(cè)試材料處理一天后，將待培養(yǎng)的細(xì)胞用0. 5 μ g/mlMMT試劑(溴化3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑，Sigma)處理2小時(shí)，將培養(yǎng)基移除。將剩余的紫色沉淀物溶解于DMSO中，隨后在560nm下測(cè)定吸光度。測(cè)定結(jié)果示于下表2。表2用寒刺激低溫處理之后細(xì)胞生長(zhǎng)率的下降以及干姜提取物的效果
低溫處理干姜提取物的處理OD560 (AU)細(xì)胞生長(zhǎng)率(％ )0. 9679100. 0
權(quán)利要求
1.一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇適當(dāng)?shù)牧N外感病邪的皮膚刺激，所述六種外感病邪包括風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火病邪；(b)根據(jù)每一種所述刺激，確定能測(cè)定皮膚細(xì)胞變化的細(xì)胞生物化學(xué)方法；(c)通過(guò)所述生物化學(xué)方法測(cè)定受試者的皮膚狀況；(d)用每一種所述刺激來(lái)刺激皮膚，隨后根據(jù)所述刺激的強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞變化的程度；和(e)向皮膚施用防御皮膚免受所述六種外感病邪的藥草，隨后通過(guò)生物化學(xué)方法測(cè)定和定量皮膚狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述風(fēng)病邪的刺激選自由大氣污染物包括甲醛、變應(yīng)性材料包括蜱和花粉、黃沙、細(xì)菌脂多糖(LPQ、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(PMA)和誘導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述寒病邪的刺激設(shè)定在從35°C的室溫到-40°C的低溫的溫度范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述暑病邪的刺激設(shè)定在從39°C到50°C 的高溫范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述濕病邪的刺激為反應(yīng)性氧物類(lèi)刺激。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述燥病邪的刺激是通過(guò)水分含量低于 60%的干燥空氣的刺激。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述火病邪的刺激選自由UV-B刺激、UV-A 刺激、可見(jiàn)光刺激和頂刺激組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞生物化學(xué)方法選自由TNF-α ELISA、PGE2 ELISA、白細(xì)胞介素表達(dá)分析、細(xì)胞增殖檢測(cè)、FAS分析、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、黑色素分析、 過(guò)氧化氫酶檢測(cè)、DCFH-DA (二氯氫化熒光素二乙酸酯檢測(cè))、DAPI染色法、β -gal染色法、 MTT檢測(cè)、LDH檢測(cè)、彗星實(shí)驗(yàn)和采用特定抗體的蛋白質(zhì)印跡分析組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥草選自由白芷(Angelicadahurica)、干姜(Zingiberis officinale)、金銀花(Lonicera japonica)、貝力口爾黃苳(Scutellaria baicalensis)、地黃(Rehmannia glutinosa)禾口知母(Anemarrhena asphodeloides)組成的組。
10.一種篩選改善皮膚狀況的材料的方法，所述方法包括以下步驟1)向細(xì)胞中加入候選物質(zhì)，并且使用至少一種選自六種外感病邪的刺激來(lái)刺激已加入候選物質(zhì)的細(xì)胞，所述六種外感病邪包括風(fēng)、寒、暑、濕、燥和火病邪；2)在步驟1)的所述刺激之前或之后，使用作為正對(duì)照組的藥草與候選物質(zhì)一起處理細(xì)胞；3)通過(guò)細(xì)胞生物化學(xué)方法測(cè)定和定量皮膚狀況；和4)比較由候選物質(zhì)所得到的定量值與由作為正對(duì)照組的藥草所得到的定量值，以確定候選物質(zhì)的效果。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述風(fēng)病邪的所述刺激選自由大氣污染物包括甲醛、變應(yīng)性材料包括蜱和花粉、黃沙、細(xì)菌脂多糖(LPQ、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(PMA)和誘導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述寒病邪的刺激設(shè)定在從35°C的室溫到-40°C的低溫的溫度范圍內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述暑病邪的刺激設(shè)定在從39°C到 50°C的高溫范圍內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述濕病邪的刺激為反應(yīng)性氧物類(lèi)刺激。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述燥病邪的刺激是通過(guò)水分含量低于60%的干燥空氣的刺激。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，對(duì)應(yīng)于所述火病邪的刺激選自由UV-B刺激、 UV-A刺激、可見(jiàn)光刺激和頂刺激組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述細(xì)胞生物化學(xué)方法選自由TNF-αELISA、 PGE2 ELISA、白細(xì)胞介素表達(dá)分析、細(xì)胞增殖檢測(cè)、FAS分析、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、黑色素分析、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)、DCFH-DA(二氯氫化熒光素二乙酸酯檢測(cè))、DAPI染色法、β -gal染色法、MTT檢測(cè)、LDH檢測(cè)、彗星實(shí)驗(yàn)和采用特定抗體的蛋白質(zhì)印跡分析組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述用作正對(duì)照組的藥草選自由白芷、干姜、 金銀花、貝加爾黃芩、地黃和知母組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求10-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述改善皮膚狀況的材料為具有改善由六種外感病邪所引起的皮膚老化、色素沉著、皮膚干燥或皮膚困擾的效果的材料。
全文摘要
本文公開(kāi)了一種定量由六種外感病邪所引起的皮膚變化的方法和使用所述定量方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法。更具體地，本文公開(kāi)了一種在皮膚細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)定由外部刺激所引起的細(xì)胞變化的方法，其中通過(guò)細(xì)胞生物化學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞變化的程度，所述細(xì)胞變化是通過(guò)對(duì)待培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞施用適當(dāng)?shù)牧N外感病邪的刺激而得到的，使得能科學(xué)并定量地表達(dá)在現(xiàn)有技術(shù)中提出的六種外感病邪的概念性效果，而且本文還公開(kāi)了一種使用所述測(cè)定方法篩選改善皮膚狀況的材料的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/16GK102203279SQ200980144315
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者廉明勳, 權(quán)純祥, 李真锳, 金德熙, 金漢坤 申請(qǐng)人:株式會(huì)社太平洋