專利名稱：用于在富含二氧化碳的空氣供應(yīng)下在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)胸膜炎肺炎放線桿菌毒素apxi或 ...的制作方法
用于在富含二氧化碳的空氣供應(yīng)下在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)胸膜炎肺炎放線桿菌毒素APXI或APCI I I的過程本發(fā)明涉及通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生產(chǎn) RTX-毒素 ApxI 或 ApxIII 的方法。豬胸膜肺炎，豬中的主要呼吸性疾病，在全世界傳播，并且由于過急性死亡、急性病豬的治療和慢性感染動(dòng)物銷售中的延遲，引起養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。病原體是胸膜炎肺炎放線桿菌。它主要通過動(dòng)物間的直接接觸傳染，并且所得到的感染產(chǎn)生從過急性到慢性不等的臨床過程。該疾病主要是呼吸道感染，具有高熱、嚴(yán)重呼吸性窘迫、咳嗽和厭食的臨床體征。該疾病的發(fā)作是快速的，并且發(fā)病率和死亡率很高?？刂菩啬ぱ追窝追啪€桿菌 (從現(xiàn)在開始也稱為“APP”)感染的方法之一是通過疫苗接種程序。菌苗在過去已用于此類程序中，但因其嚴(yán)重副作用而眾所周知?，F(xiàn)今基于APP毒素的亞單位疫苗是常用的。APP產(chǎn)生所謂的RTX-毒素(RTX代表重復(fù)子毒素(r印eat-in-toxin))。正是這些 RTX-毒素的存在高度促成這種細(xì)菌的致病性特征。RTX-毒素已在過去得到廣泛綜述，并且在文獻(xiàn)中得到描述。如通常已知的，并非所有APP血清型都產(chǎn)生所有RTX-毒素。例如，血清型1、5、9和11產(chǎn)生ApxI和ΑρχΙΙ。血清型2、3、4、6和8產(chǎn)生ApxII和ApxIII。血清型 10僅產(chǎn)生ApxI，并且血清型7和12僅產(chǎn)生ApxII。針對(duì)APP的目前商購(gòu)可得疫苗基于毒素 ApxI、ApxII和ApxIII。最近以來已發(fā)現(xiàn)所有APP血清型都產(chǎn)生第4種RTX毒素，目前稱為 ApxIV (參見 EP 0 875 574)。目前已知如何通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸膜炎肺炎放線桿菌來生產(chǎn)RTX-毒素 ApxI或ΑρχΙΙΙ。特別地，EP 0 453 OM已描述了生產(chǎn)ApxI的方法(參見“Example 2”， 1 2 "Purification andcharacterisation of hemolysin",子·( 胃“Methods，，)禾口 ΑρχΙΙΙ (參見“實(shí)施例4，，,段落2“Purification and characterisationof App macrophage toxin (Mat)”，子段落“Methods”)。應(yīng)當(dāng)指出ApxI習(xí)慣被稱為“HLY”，而ΑρχΙΙΙ通常被稱為 “Mat”(參見 Frey 等人在〃 J Gen Microbiol. 1993 Aug; 139 (8) :1723-8"中)。培養(yǎng)基必須支持APP細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常已知如何構(gòu)成支持細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基最初由fegle，Ham及其他人在20世紀(jì)50年代和60年代開發(fā)。他們發(fā)現(xiàn)滿足生長(zhǎng)的基本需要的培養(yǎng)基應(yīng)包括無機(jī)鹽、氮源(例如以含氮化合物的形式，例如肽或蛋白質(zhì))、碳源和維生素。培養(yǎng)基有利地進(jìn)行緩沖以阻止其變得太酸或太堿。在這個(gè)基本配方內(nèi)，許多不同構(gòu)成是可獲得的。例如，可以選擇動(dòng)物衍生的組分以提供氨基酸，但也可以選擇化學(xué)成分限定的氨基酸。對(duì)于其他化合物，眾多變化也是可能的。事實(shí)上，構(gòu)成支持細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是相對(duì)簡(jiǎn)單的。然而，生長(zhǎng)和/或代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的最佳化可以花費(fèi)一定的開發(fā)時(shí)間， 特別是當(dāng)不含血清或其他動(dòng)物衍生的組分的培養(yǎng)基是優(yōu)選的時(shí)。然而，用于改善發(fā)酵培養(yǎng)基性能的策略是本領(lǐng)域通常已知的，并且在文獻(xiàn)中得到充分描述(參見例如由Kennedy 禾口 Krouse 在 Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology (1999)23，456-475 中的綜述文章)。此類最佳化構(gòu)成發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)部分。在APP培養(yǎng)的情況下， NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)固有地構(gòu)成培養(yǎng)基的部分，因?yàn)锳PP是NAD依賴性的。如果沒有NAD，那么培養(yǎng)基將不支持胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌生長(zhǎng)，并且因此不能被視為在
3本申請(qǐng)和附加權(quán)利要求含義中用于支持APP生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。用于支持細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基，或構(gòu)成此類培養(yǎng)基的組分，可從各個(gè)公司商購(gòu)得到，例如Sigma Aldrich、Quest International、OxoicU Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech、Invitrogen、 Marcor> IrvinScientific 等。盡管現(xiàn)有技術(shù)提供了通過培養(yǎng)APP生產(chǎn)RTX-毒素ApxI和ApxIII的方法，但需要改善生產(chǎn)得率。迄今為止，改善生產(chǎn)得率的嘗試主要針對(duì)APP培養(yǎng)靜止期中的毒素生產(chǎn)率， 因?yàn)橐阎畲笙薅萊TX-毒素生產(chǎn)在高細(xì)胞密度時(shí)發(fā)生，因此在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)發(fā)生(參見例如Microbial Pathogenesis 37 Q004)四_3；3)。這些嘗試未導(dǎo)致總體生產(chǎn)得率的顯著改善。然而，令人驚訝的是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)當(dāng)空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌的所述RTX-毒素的生產(chǎn)期過程中(因此在APP細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或靜止期過程中)經(jīng)過培養(yǎng)基時(shí)，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量，RTX-毒素生產(chǎn)得到顯著增加。事實(shí)上，一般已知在平板上在細(xì)菌菌落培養(yǎng)過程中使用增加的二氧化碳水平(參見例如US 6，019，984:實(shí)施例〃 Bacterial Strains and GrowthConditions〃)。然而，這涉及細(xì)菌菌落的培養(yǎng)，所述細(xì)菌隨后用于接種發(fā)酵罐。在這個(gè)階段時(shí)，僅發(fā)生細(xì)菌其自身的生長(zhǎng)，不發(fā)生RTX毒素的生產(chǎn)(至少不以顯著水平)。一旦將APP細(xì)菌置于液體培養(yǎng)基中以朝向適合于RTX毒素生產(chǎn)的高細(xì)胞密度生長(zhǎng)，現(xiàn)有技術(shù)就教導(dǎo)免除增加的二氧化碳水平。這當(dāng)然與上文提及的現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)一致在發(fā)酵罐中的最大限度Apx生產(chǎn)僅在高細(xì)胞密度下發(fā)生，因此在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)發(fā)生。在這個(gè)階段時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)已結(jié)束并且完全不再變動(dòng)(Plays no roll)，并且因此二氧化碳先前被視為不是重要的。此外，APP細(xì)菌其自身在形成RTX-毒素時(shí)生產(chǎn)二氧化碳。因此，有目的的將二氧化碳加入培養(yǎng)基中被認(rèn)為甚至抑制毒素生產(chǎn)。這些事實(shí)解釋了為何二氧化碳從未被認(rèn)為是關(guān)于RTX-毒素生產(chǎn)得率的刺激因子。然而，為何二氧化碳的確刺激ApxI和ApxIII生產(chǎn)的原因仍不明了，特別是因?yàn)槎趸妓坪鯇?duì)RTX-毒素ApxII 的生產(chǎn)水平?jīng)]有正面作用。應(yīng)當(dāng)指出存在使得空氣能夠經(jīng)過培養(yǎng)基的許多技術(shù)。常用概念是經(jīng)由使空氣以氣泡的形式在某處漏出到培養(yǎng)基內(nèi)(即在培養(yǎng)基表面下)的裝置使空氣通過。此類裝置可能具有一個(gè)單噴嘴或多個(gè)噴嘴，依賴于是否希望建立培養(yǎng)基中的(近)平衡狀態(tài)，并且如果希望，那么這個(gè)平衡應(yīng)多快確定。在任何情況下，使空氣經(jīng)過培養(yǎng)基與使用空氣的頂部空間且僅僅主要依賴于擴(kuò)散形成對(duì)比。已發(fā)現(xiàn)此類技術(shù)提供不充足的結(jié)果。在本發(fā)明背景下的 “空氣”意指包含通常存在于大氣空氣中的一種或多種氣態(tài)組分的氣態(tài)介質(zhì)，所述氣態(tài)組分例如氧、氮、二氧化碳、氦、氖、氬、氙、氡等?！瓣P(guān)于二氧化碳的正常大氣水平”是空氣總體積的 0，04% 體積 CO2，，。在一個(gè)實(shí)施方案中，空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期過程中通過。 與現(xiàn)有技術(shù)中已描述的形成對(duì)比，指數(shù)生長(zhǎng)期看起來是RTX-毒素總體生產(chǎn)期的部分的時(shí)期(緊接靜止期)。令人驚訝的是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在指數(shù)生長(zhǎng)期過程中使二氧化碳通過提供非常顯著刺激的RTX-毒素生產(chǎn)，從而使得即使在這個(gè)時(shí)期結(jié)束時(shí)，發(fā)酵罐中也存在經(jīng)濟(jì)上相關(guān)量的毒素。因此，這個(gè)實(shí)施方案提供了在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)或在靜止期早期結(jié)束發(fā)酵的選項(xiàng)。重要優(yōu)點(diǎn)是它可以節(jié)省大量生產(chǎn)時(shí)間以及可以減少最終產(chǎn)物中的脂多糖量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中培養(yǎng)基進(jìn)行緩沖(即加入當(dāng)酸或堿加入溶液中時(shí)使溶液酸度中的改變降到最低的物質(zhì))，通過使用碳酸氫鹽進(jìn)行緩沖(即含有HCO3-離子的鹽)。通過使用碳酸氫鹽緩沖液，看起來可以非常有效地抵消過量二氧化碳的固有PH降低效應(yīng)。 很明顯，使用此類緩沖液，例如碳酸氫鈉或另一種堿金屬碳酸氫鹽緩沖液，將幾乎立即達(dá)到培養(yǎng)基中的(近)平衡狀態(tài)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由恒流使空氣經(jīng)過培養(yǎng)基。事實(shí)上，可以設(shè)計(jì)使氣體經(jīng)過培養(yǎng)基的許多不同方法。具有極高二氧化碳含量(高達(dá)例如90%)的脈動(dòng)流是其中之一。然而，我們發(fā)現(xiàn)用恒流可以獲得非常良好的結(jié)果。用此類恒流，可以在空氣中使用中等二氧化碳水平。這提供了緩沖液將能夠更好地在任何時(shí)候使PH維持在平衡值周圍的有利作用。應(yīng)當(dāng)指出恒流不一定意指總體二氧化碳添加在時(shí)間中的某些點(diǎn)時(shí)不中斷。例如，在培養(yǎng)過程中流的短暫中斷不排除在中斷前和后，流是恒定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期過程中連續(xù)通過，即在指數(shù)生長(zhǎng)期過程中，流不中斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，二氧化碳含量可高達(dá)10% ν/ν。在這個(gè)實(shí)施方案中，空氣中二氧化碳的最大限度體積含量是10%。超過這個(gè)水平，可能緩沖液將不能以高速度在所有時(shí)間提供平衡。這可能負(fù)面影響RTX-毒素生產(chǎn)得率。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，二氧化碳含量是5% ν/ν。用這個(gè)二氧化碳含量已達(dá)到良好結(jié)果，并且從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來看，這是二氧化碳優(yōu)選量，因?yàn)榇祟惢旌衔镆詷O低價(jià)格商購(gòu)可得。在其中RTX-毒素是ApxI的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有硼葡萄糖酸鈣。事實(shí)上， 通常已知ApxI操縱子的轉(zhuǎn)錄活性通過將鈣加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中得到增強(qiáng)(參見=Microbiol Pathogenesis 37(2004)29-33)。當(dāng)使用硼葡萄糖酸(2，3-二羥基 _3-[2_ 羥基 _5_(羥甲基)-1，3，2_二氧硼戊烷(di0Xab0r0lan)-4-基]丙酸)絡(luò)合鈣離子時(shí)，已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，看起來可以預(yù)防或至少顯著減少在下游加工中一般遇到的鈣鹽沉淀問題，特別是趨于變得淤塞的濾器。其次，看起來當(dāng)與使用其他絡(luò)合劑例如EDTA的現(xiàn)有技術(shù)方法比較時(shí)，可以以顯著增加的水平生產(chǎn)ΑρχΙ。很明顯，通過使用這種特定絡(luò)合劑，從而使得培養(yǎng)基含有絡(luò)合硼葡萄糖酸鈣(即，2，3- 二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1，3，2- 二氧硼戊烷_4_基] 丙酸鈣)也稱為D-葡萄糖酸，具有硼酸的環(huán)狀4，5-酯，鈣鹽2 1)，可以預(yù)防鈣離子與其他陰離子的大量沉淀，與此同時(shí)鈣離子仍可用于增強(qiáng)胸膜炎肺炎放線桿菌的ApxI操縱子的轉(zhuǎn)錄活性。盡管不是本發(fā)明所需的，但培養(yǎng)基可以不含動(dòng)物衍生的組分。許多現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)是它們依賴于含有動(dòng)物衍生組分的培養(yǎng)基例如Columbia肉湯的使用?，F(xiàn)有技術(shù)中提及的其他動(dòng)物衍生的組分是例如Columbia Broth Modified或Brain Heart hfusion肉湯。如通常已知的，動(dòng)物組分的使用具有某些嚴(yán)重缺陷。首先，化學(xué)組成在生產(chǎn)批次之間可以相當(dāng)大地不同。此外，動(dòng)物起源的補(bǔ)充劑可能被傳染物質(zhì)污染。主要擔(dān)心是在人或動(dòng)物中引起TSE的朊病毒的存在?？梢詢H僅選擇不含動(dòng)物組分的培養(yǎng)基(通常被稱為“ACF”培養(yǎng)基)。以這個(gè)含義的“動(dòng)物組分”意指像這樣存在于動(dòng)物中(例如，血液或蛋白質(zhì))或衍生自此類組分的任何組分(例如衍生自血液的經(jīng)修飾的血清，或衍生自蛋白質(zhì)的氨基酸)。然而，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)當(dāng)與含有動(dòng)物衍生的組分的培養(yǎng)基比較時(shí)，即使當(dāng)鈣濃度處于足夠水平時(shí)， 使用此類ACF培養(yǎng)基，ApxI生產(chǎn)效率低得多。不受理論束縛，伴隨血清的使用，關(guān)于鈣鹽沉淀的問題不是如此嚴(yán)重(由于形成鈣離子的可溶性絡(luò)合物的試劑的存在)。在任何情況下， 當(dāng)硼葡萄糖酸用于絡(luò)合鈣離子時(shí)，可以獲得顯著的ApxI得率增加，令人驚訝地導(dǎo)致甚至高于可用常規(guī)含血清培養(yǎng)基獲得的得率。
材料與方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基使用生產(chǎn)ApxI的胸膜炎肺炎放線桿菌菌株，血清型10，下文稱為APP 10，和生產(chǎn)ApxII和ApxIII，即血清型2的菌株，下文稱為APP 2，執(zhí)行研究。在所有情況下，使用 Columbia Blood Agar BASE (BAB)平板(可從 Becton，Dickinson USA 獲得)重建這些菌株的工作種子。所使用的液體培養(yǎng)基是Columbia肉湯(可從Becton，Dickinson USA 獲得)或不含動(dòng)物組分的培養(yǎng)基(稱為“ACF”)。后面一種培養(yǎng)基含有K2HP04(14.6g/l) 和NaH2PO4(3. 6g/l)的混合物作為緩沖液，以及NaNO3(0. 2g/l)、50%葡萄糖溶液(IOml)、 酵母提取物15g/l (可從Becton Dickinson獲得)、微量元素(例如，如Handbook of Microbiological Media，第 3 版，Ronald Atlas, CRC Press, 2004 中提及的 2. 5ml 溶液 SL-10)和IOmM氨基酸溶液(含有所有20種氨基酸，除色氨酸外)。測(cè)試的可替代不含動(dòng)物組分的培養(yǎng)基(稱為“ACF-alt”)含有半胱氨酸.HCl (0. lg/1),NaNO3 (0. 5g/l)，KC1 (0. lg/ 1)、微量元素(如上)、50%葡萄糖溶液(IOml)和IOmM氨基酸溶液(如上)、HEPES緩沖液 (6g/l ；例如可從Sigma Aldrich獲得)和酵母提取物(10g/l)。這些培養(yǎng)基用于預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵中。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 01% )用于預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵中。所有培養(yǎng)基通過0.22 μ m過濾進(jìn)行滅菌。在用于發(fā)酵之前，培養(yǎng)基在85°C下加熱1分鐘。預(yù)培養(yǎng)APP菌株的工作種子在Columbia BAB平板上鋪展開，并且在約M小時(shí)過程中在 37°C下進(jìn)行溫育。挑選幾個(gè)菌落以接種包含75mlC0lumbia肉湯的500mL瓶。使瓶在約6 小時(shí)過程中在37°C下在攪動(dòng)下溫育，以形成預(yù)培養(yǎng)物。用這些預(yù)培養(yǎng)物，執(zhí)行幾種發(fā)酵。在SIXF0RS發(fā)酵罐中的培養(yǎng)在含有約400mL培養(yǎng)基的SIXF0RS發(fā)酵槽(Infors AG，瑞士 )中，加入約20mL預(yù)培養(yǎng)物作為接種物。培養(yǎng)溫度是37°C，pH = 7. 2士0. 1 (通過加入4N氫氧化鈉或4N乙酸)， 并且充氣(aereation)是以50% p02。發(fā)酵器培養(yǎng)在約M小時(shí)后停止在Biostat發(fā)酵罐中的培養(yǎng)在含有10L培養(yǎng)基的Biostat C發(fā)酵器(B. Braun Biotech，德國(guó))中，加入500mL APP預(yù)培養(yǎng)物作為接種物。應(yīng)用與SIXF0RS發(fā)酵罐中相同的設(shè)置。然而，對(duì)于空氣/(X)2 95/5 ν/ν氣體混合物，通過維持lvvm(=氣體體積/培養(yǎng)基體積/分鐘)恒氣流，增加二氧化碳水平。這導(dǎo)致具有約5% pC02的充氣設(shè)置。發(fā)酵器培養(yǎng)在指數(shù)期結(jié)束時(shí)停止，在約8. 5小時(shí)后。在中試工廠規(guī)模下的培養(yǎng)中試工廠實(shí)驗(yàn)在1001可分批滅菌發(fā)酵罐中執(zhí)行。攪拌器軸配備3個(gè)六葉片 Rushton渦輪推進(jìn)器。使發(fā)酵罐充滿75升培養(yǎng)基，并且用3升預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行接種。溫度維持在37°C下，通過自動(dòng)pH控制器使用20% (W/V)Na0H和8N乙酸使pH維持在7.3下。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)在CO2頂部空間超壓(500mbar)下執(zhí)行，并且推進(jìn)器以250rpm恒速旋轉(zhuǎn)。氧壓力不受控制。對(duì)于噴射(X)2培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基用NaHCO3補(bǔ)充至IOmM的終濃度，并且用富含0. 014vvm CO2的0. 25vvm空氣恒定氣流充氣。這導(dǎo)致約5 %的pC02。在APP 10菌株的情況下，培養(yǎng)基補(bǔ)充有25mMCaCl2，并且充氣是以50% p02。

分析在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從發(fā)酵罐中無菌取出細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物樣品，以測(cè)定在648nm 下的光密度，以及Apxl、ApxII和/或ApxIII水平(ELISA ；單位/ml)和任選地LPS水平 (LAL測(cè)定法；單位*105/ml)。結(jié)果用菌株APP 2在中試工廠規(guī)模下執(zhí)行第一次實(shí)驗(yàn)，以研究經(jīng)過培養(yǎng)基的二氧化碳的作用(“噴射”CO2實(shí)驗(yàn))。所使用的培養(yǎng)基是Columbia肉湯。結(jié)果在表1中描述。給出 2次實(shí)驗(yàn)(exp 1和exp 2)的結(jié)果。表 權(quán)利要求
1.通過在支持細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌來生產(chǎn)RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空氣在所述RTX-毒素的生產(chǎn)期過程中經(jīng)過所述培養(yǎng)基，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述空氣在所述胸膜炎肺炎放線桿菌的指數(shù)生長(zhǎng)期過程中通過。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)所述培養(yǎng)基進(jìn)行緩沖，其特征在于所述培養(yǎng)基通過使用碳酸氫鹽進(jìn)行緩沖。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述空氣經(jīng)由恒流經(jīng)過所述培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述空氣在所述胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期過程中連續(xù)通過。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述二氧化碳含量不超過10%ν/Vo
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述二氧化碳含量是5%ν/ν。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述RTX-毒素是ΑρχΙ，其特征在于所述培養(yǎng)基含有硼葡萄糖酸鈣。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過在支持細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸膜炎肺炎放線桿菌細(xì)菌來生產(chǎn)RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空氣經(jīng)過培養(yǎng)基，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量，以增加在RTX-毒素生產(chǎn)期過程中的RTX-毒素生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102171362SQ200980138626
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者C·T·G·斯米茨, S-J·斯萊格曼 申請(qǐng)人:英特威國(guó)際有限公司