專利名稱：產(chǎn)生抗體的非人哺乳動(dòng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能產(chǎn)生抗體及其衍生物的非人動(dòng)物的產(chǎn)生和應(yīng)用，所述抗體或者其衍 生物從至少部分是外源的核酸(轉(zhuǎn)基因)表達(dá)。本發(fā)明揭示了產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基 因以及產(chǎn)生這種異源抗體的方法，以及產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法和載體。
背景技術(shù)：
B細(xì)胞通過產(chǎn)生特異性抗體介導(dǎo)體液免疫。抗體(Ab)的基本結(jié)構(gòu)亞單位是免疫球 蛋白(Ig)分子。Ig分子由兩個(gè)相同的重(H)多肽鏈和兩個(gè)相同的輕(L)多肽鏈組成。在 每個(gè)H鏈和L鏈的氨基末端是稱作可變區(qū)(V)的區(qū)域，其氨基酸序列可改變。H鏈和L鏈的 剩余部分在氨基酸序列中相對(duì)恒定，稱作恒定區(qū)(C)。在Ig分子中，H鏈和L鏈的V區(qū)(VH 和VL)并列形成潛在的抗原結(jié)合位點(diǎn)。編碼H鏈和L鏈的V區(qū)的基因在前體B (pre-B)細(xì) 胞分化期間從種系DNA區(qū)段中經(jīng)體細(xì)胞裝配對(duì)于H鏈，V、D和J基因區(qū)段；對(duì)于L鏈，V和 J基因區(qū)段。在Ig V區(qū)內(nèi)是最大氨基酸序列可變性的三個(gè)區(qū)域，其相互作用形成抗原識(shí)別 位點(diǎn)，并因此稱作互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。V基因區(qū)段編碼大部分V區(qū)結(jié)構(gòu)域，包括⑶Rl和⑶R2。⑶Rl和⑶R2中的多樣性 得自多個(gè)不同的種系編碼的V區(qū)段中的序列異質(zhì)性。CDR3由通過連接H鏈V、D和J基因 區(qū)段與L鏈V和J基因區(qū)段以及通過組合這些區(qū)段產(chǎn)生核苷酸序列異質(zhì)性的機(jī)制形成的序 列編碼。另外的多樣性可得自不同的H和L鏈V區(qū)的配對(duì)。綜合這些處理產(chǎn)生由種系基因 區(qū)段編碼的并由新形成的B細(xì)胞表達(dá)的最初的抗體儲(chǔ)備庫(repertoire)?？贵w多樣性的另一來源是通過重組Ig基因區(qū)段產(chǎn)生的多樣性。B細(xì)胞能在其表達(dá) 的抗體V區(qū)中導(dǎo)入突變，這是被稱作體細(xì)胞超突變的過程。因此，當(dāng)動(dòng)物首次遭遇抗原時(shí)， 該抗原結(jié)合恰好攜帶具有結(jié)合該抗原的V區(qū)的抗體的特定B細(xì)胞。這種初始應(yīng)答可激活這 種B細(xì)胞繼續(xù)分泌同種抗體(cognate antibody)。這些激活的B細(xì)胞此時(shí)也以其重排的抗 體基因片段為目標(biāo)發(fā)生體細(xì)胞突變，并因此產(chǎn)生子細(xì)胞，其產(chǎn)生初始應(yīng)答的抗體的變體。選 擇處理擴(kuò)增這些變體B細(xì)胞后代，產(chǎn)生抗原親和性改良的抗體。在B細(xì)胞中，體細(xì)胞超突變 被靶向受限的基因組區(qū)域，包括重排的VH和VL基因。因此，體細(xì)胞突變使得發(fā)生親和性成 熟——產(chǎn)生和選擇高親和性抗體。因此，體細(xì)胞突變對(duì)于高親和性抗體的產(chǎn)生是重要的。抗體的精確特異性和高親和性以及發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)的雜交瘤技 術(shù)給抗體在人體疾病的靶向治療中的應(yīng)用帶來了巨大希望。mAb是相同的，因?yàn)槠涫怯蓡我?B細(xì)胞及其后代產(chǎn)生的。mAb是通過融合已經(jīng)用希望的抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞產(chǎn)生永生化的雜交瘤而產(chǎn)生的。mAb在人體內(nèi)應(yīng)用的進(jìn)展面臨的一個(gè)主要障礙是非人Ig 的固有的免疫原性?；颊咄ㄟ^產(chǎn)生抗小鼠Ig序列的抗體(人抗小鼠抗體，HAMA)而對(duì)于治 療劑量的小鼠mAb作出反應(yīng)，導(dǎo)致急性毒性，改變其生物分布及加速清除，因此降低后續(xù)給 藥的效力(Mirick, et al.，(2004) Q. Nucl. Med. Mol. Imaging 48，251-257)。為了克服HAMA的產(chǎn)生，已經(jīng)開發(fā)了抗體人源化方法，試圖產(chǎn)生當(dāng)用于人體時(shí)免疫 原性降低的mAb。這些嘗試產(chǎn)生不同的基于重組DNA方法，目的在于增加mAb中人氨基酸 序列的含量，同時(shí)保留親代非人抗體的特異性和親和性。人源化起自構(gòu)建小鼠-人嵌合型mAb (Morrison, S. L.，et al.，(1984) · Proc. Natl. Acad. ki. USA.，81，6851-5)，其中小鼠 mAb中Ig C區(qū)域由人C區(qū)置換。嵌合型mAb含有60-70%的人氨基酸序列，且當(dāng)注射進(jìn)人 體內(nèi)時(shí)與其小鼠相應(yīng)物相比免疫原性明顯降低，但是仍觀測(cè)到人抗嵌合抗體應(yīng)答(Hwang， W. Y.，et al. (2005). Methods, 36，3-10)。在試圖進(jìn)一步人源化小鼠mAb中，開發(fā)了 CDR移植法。在CDR移植法中，小鼠抗體 被人源化，通過將小鼠抗體的CDR移植至人Ig分子的VL和VH構(gòu)架上，同時(shí)保留認(rèn)為是特異 性和親和性必需的那些小鼠構(gòu)架，進(jìn)行人源化(Jones, P. Τ.，et al.，(1986). Nature, 321, 522)?？傊?，CDR-移植的抗體由80%以上的人氨基酸序列組成(Queen, C. et al. (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86,10029 ；Carter, P. et al. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89,4285)。盡管取得這些成就，但是⑶R-移植的人源化抗體仍示出產(chǎn)生抗移植的V 區(qū)的抗體應(yīng)答(Hwang, W. Y.，et al. (2005). Methods, 36，3)。在CDR移植法之后，開發(fā)了基于不同模式的人源化方法，如表面再建 (resurfacing) (Padlan, Ε. Α.，et al.，(1991). Mol. Immunol. , 28，489)、超人源化(Tan, P. , D. A. , et al. , (2002) J. Immunol. , 169,1119)、人 string content 優(yōu)化(Lazar, G. A., et al.，(2007). Mol. Immunol.，44，1986)以及人工程化(humaneering)，試圖進(jìn)一步降低治 療性 mAb 中非人序列的含量(Almagro, J. C.，et al.，(2008). Frontiers in Bioscience 13，1619)。如⑶R移植法一樣，這些方法依賴于分析抗體結(jié)構(gòu)及非人和人mAb的序列對(duì)比， 以評(píng)估終產(chǎn)物的免疫原性中人源化處理的影響。當(dāng)對(duì)比嵌合型和人源化抗體的免疫原性 時(shí)，可變區(qū)的人源化看起來進(jìn)一步降低免疫原性(Hwang，W. Y.，et al. (2005). Methods, 36, 3-10)。去免疫化(De-immunization)是降低嵌合型或者小鼠抗體的免疫原性的另一種 方法。其包括使用生物信息學(xué)鑒別感興趣的抗體中的線性T細(xì)胞表位，隨后通過位點(diǎn)定向 誘變置換為人或者無免疫原性序列(W00985^76A1)。盡管去免疫化的抗體在靈長類動(dòng)物 中呈現(xiàn)出與其嵌合的相應(yīng)物相比降低的免疫原性，但是觀測(cè)到喪失一些結(jié)合親和性(Jain， Μ.，et al.，(2007). Trends in Biotechnol. 25，307)。噬菌體展示技術(shù)補(bǔ)充并擴(kuò)展了人源化方法，以獲得較低免疫原性mAb，以用于人 體治療中。在噬菌體展示中，人抗體VH和VL區(qū)的大量集合(文庫)在絲狀噬菌體顆粒 的表面上表達(dá)。從這些文庫中，通過與抗原的結(jié)合相互作用選擇罕見的噬菌體；從感染的 細(xì)菌中表達(dá)可溶的抗體片段以及通過突變改良選擇的抗體的結(jié)合親和性(Winter，G.，et al. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12,433) 0這種方法模擬免疫選擇，使用這種方法已經(jīng)分離 了具有許多不同結(jié)合特異性的抗體(Hoogenboom, H. R.，et al. (2005). Nat. Biotechnol.， 23，1105)。不同來源的H和L鏈V區(qū)用于構(gòu)建噬菌體展示文庫，包括從非免疫或者免疫供 體中分離的那些區(qū)域。此外，已經(jīng)由含有人工隨機(jī)合成的CDR區(qū)的V區(qū)構(gòu)建噬菌體展示文 庫，以產(chǎn)生額外的多樣性。通常地，對(duì)得自噬菌體展示文庫的抗體進(jìn)行體外親和性成熟，以 獲得高親和性抗體(Hoogenboom, H. R.，et al. (2005). Nat. Biotechnol. ,23,1105)。在不存在小鼠抗體條件下產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠株系的產(chǎn)生，提供了產(chǎn)生用于 人體的特異性和高親和性人mAb的另一技術(shù)平臺(tái)。在這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，內(nèi)源小鼠抗體機(jī) 制被失活，并由人Ig基因座置換，以在小鼠中充分再生人免疫系統(tǒng)(Jakobovits，A.，et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25,1134. Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23，1117)。通過重組基因區(qū)段的B細(xì)胞發(fā)育以及Ig多樣化在這些小鼠中真實(shí)再生，產(chǎn)生表達(dá)人Ig的小 鼠B細(xì)胞的不同儲(chǔ)備庫。通過用抗原免疫這些小鼠，進(jìn)一步證實(shí)這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在重鏈和 輕鏈的V區(qū)中積聚了體細(xì)胞突變，以產(chǎn)生多種不同的高親和性人mAb (Lonberg，N. (2005). Nat. Biotechnol. 23，1117)。然而目前還不能回答“完全人的”mAb，如得自噬菌體展示文庫或者轉(zhuǎn)基因小鼠的 mAb,是否比人源化mAb的免疫原性低的問題，因?yàn)槟壳爸猾@得了兩種人mAb的全部免疫 原性數(shù)據(jù)。得自噬菌體展示的人文庫的抗腫瘤壞死因子mAb在12%患者中誘導(dǎo)了抗體應(yīng) 答——這在人源化抗體的抗抗體應(yīng)答發(fā)生率中也是較高的(Hwang，W. Y.，et al. (2005). Methods,36,3-10)。評(píng)估通過轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生的第一個(gè)注冊(cè)的人mAb的免疫原性證實(shí)mAb治療 導(dǎo)致在大約5. 5%治療的癌癥患者中產(chǎn)生抗體(Jakobovits，A.，et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25，1134.，Lofgren, J. Α.，et al. (2007). J. Immunol. 178，7467)。因此仍需要產(chǎn)生特異于其靶位、但是免疫原性較低的抗體的方法和手段。根據(jù)本 發(fā)明，免疫原性的降低至少部分通過提供轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物動(dòng)物而實(shí)現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)基因非 人哺乳動(dòng)物至少在其B細(xì)胞譜系中包含編碼至少免疫球蛋白輕鏈或者重鏈的核酸，其中所 述重鏈或輕鏈編碼序列具有使其對(duì)于DNA重排和/或體細(xì)胞超突變有抗性的手段(means)， 優(yōu)選這種非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，更特別優(yōu)選是小鼠。所述核酸優(yōu)選編碼人、人樣或者人源化 免疫球蛋白鏈。在本說明書隨后的部分中，小鼠被典型用作非人哺乳動(dòng)物的實(shí)例。所述轉(zhuǎn)基因非 人哺乳動(dòng)物宿主能發(fā)起對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，其中所述應(yīng)答產(chǎn)生具有靈長類動(dòng)物、特別是人 的可變區(qū)的抗體?？梢詰?yīng)用不同的轉(zhuǎn)基因宿主，特別是鼠、兔、綿羊、avine、豬、馬、犬、貓等 等。小鼠已經(jīng)用于產(chǎn)生B-淋巴細(xì)胞以永生化，用于產(chǎn)生抗體。由于小鼠易于處理，可以大 量繁殖，且已知具有強(qiáng)大的免疫儲(chǔ)備庫，因此小鼠通常是選擇的動(dòng)物。因此，在下文的討論 中，是針對(duì)小鼠進(jìn)行討論，但是應(yīng)理解其它動(dòng)物、特別是非靈長類哺乳動(dòng)物可以代替小鼠進(jìn) 行相同程序。防止重排和超突變的原因是以這種方式可以提前選擇非免疫原性多肽，已知這種 多肽鏈將保持非免疫原性。所得免疫球蛋白的至少一條鏈因此是低免疫原性的。所得抗體 (通常)需要既具有輕鏈也具有重鏈。非免疫原性鏈因此必須能與其它鏈配對(duì)。其它鏈可 以是內(nèi)源鏈、外源鏈或者這兩種鏈的雜交體。對(duì)于人體治療，所述非免疫原性鏈應(yīng)盡可能地 接近人。使編碼免疫球蛋白鏈的基因?qū)τ贒NA重排和/或突變有抗性的手段當(dāng)然是除去造 成所述重排和/或突變的所有遺傳元件。其缺點(diǎn)是消除了這兩條鏈的可變性，而本發(fā)明優(yōu) 選保留了一條鏈(優(yōu)選重鏈)的可變性，并抑制和/或防止另一鏈(優(yōu)選輕鏈)的重排-突變。迄今為止鑒定的重排和/或超突變的元件位于免疫球蛋白的基因座內(nèi)。因此，使 免疫球蛋白編碼序列對(duì)DNA重排和/或突變有抗性的手段是在免疫球蛋白基因座外部的基 因座中插入基因。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中輕鏈/重鏈編碼序列整合進(jìn)非人 哺乳動(dòng)物的基因組免疫球蛋白基因座外部的基因座中。優(yōu)選地，所述插入位于對(duì)基因沉默具有抗性的基因座中。根據(jù)本發(fā)明，所述整合位于Rosa-基因座或者相應(yīng)基因座。優(yōu)選提供這樣的表達(dá)盒，其可以通過一定手段插入Rosa基因座或者相應(yīng)基因座 中，使得免疫球蛋白鏈的表達(dá)基本限于B細(xì)胞譜系細(xì)胞，優(yōu)選使用使輕鏈編碼核酸在B細(xì)胞 發(fā)育一定階段期間表達(dá)的手段。術(shù)語“表達(dá)基本限于”是指所述表達(dá)主要在B細(xì)胞譜系的 細(xì)胞中，但是在其它細(xì)胞中與在B細(xì)胞中表達(dá)水平相比可以較低水平表達(dá)。在一優(yōu)選的實(shí) 施方案中，術(shù)語“表達(dá)基本限于”是只在B細(xì)胞譜系細(xì)胞中表達(dá)。這種手段典型且優(yōu)選包括 B細(xì)胞(發(fā)育階段)特異性啟動(dòng)子，如CD19、CD20、μ HC (所有V基因)、VpreBl、VpreB2、 VpreB3、X5、Iga、Ig0、κ LC(所有基因)、λ LC(所有基因)、BSAP (Pax5)。盡管非?？赡?通過這種啟動(dòng)子指導(dǎo)DNA重排和/或突變抗性鏈的表達(dá)，但是其相對(duì)較弱。典型需要強(qiáng)啟動(dòng) 子以保證B細(xì)胞受體(由膜附著的Ig H和L鏈組成)足夠的表面表達(dá)，以及通過等位基因 排斥與內(nèi)源鏈(如果存在的話)的表達(dá)和配對(duì)競爭。然而這種啟動(dòng)子通常不是組織特異性 的。為了賦予組織特異性，優(yōu)選應(yīng)用Cre/lox等的間接系統(tǒng)。將希望的鏈置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制 下，所述強(qiáng)啟動(dòng)子由可以通過Cre-蛋白質(zhì)的作用除去的元件抑制，導(dǎo)致希望的免疫球蛋白 編碼基因活化。這種系統(tǒng)在如下文獻(xiàn)中詳細(xì)描述mmderlich F. T. (2004), " Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice ", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwi ssenschaftlichen Fakultat der Universitat ZU Koln; http: //deposit, ddb. de/cgi-bin/ dokserv ？ idn = 97557230x&dok_var = dl&dok_ext = ρdf&filename = 97557230x. pdf.優(yōu)選地，以重排和超突變抗性方式產(chǎn)生的免疫球蛋白鏈?zhǔn)悄芘c非人哺乳動(dòng)物編碼 的不同的重鏈配對(duì)的輕鏈。所述輕鏈在所有抗體中均是相同的(且免疫原性較低)，但是通 過重鏈中的重排和超突變保留特異性的不同。優(yōu)選沉默編碼輕鏈的至少一個(gè)內(nèi)源基因座， 不過等位基因排斥可使其不必要。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選內(nèi)源κ (kappa)輕鏈被功能性沉默。如果內(nèi)源κ輕鏈基因座被沉默，并且由于其它原因，優(yōu)選所述抗性輕鏈?zhǔn)铅瘦p 鏈，優(yōu)選具有種系樣序列的輕鏈。根據(jù)本發(fā)明，這種輕鏈將導(dǎo)致抗體具有降低的免疫原性。 優(yōu)選的種系序列基于人IGKV1-39 (012)，因?yàn)檫@個(gè)輕鏈在人儲(chǔ)備庫中非常常見(de Wildt et al. 1999. J. Mol. Biol. 285 (3) :895)，且具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性、產(chǎn)量和可溶性(Ewert et al.2003. J. Mol. Biol. 325 (3) :531)。下文提供了所述表達(dá)盒的更特異性的實(shí)施方案，使用該表達(dá)盒可以提供本發(fā)明的 非人動(dòng)物。盡管這對(duì)于免疫球蛋白是典型有利的，但是也涵蓋其它感興趣的基因。因此，本發(fā)明在一特定實(shí)施方案中提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中輕鏈編碼核 酸在5’_3’方向包含B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列，重排的人V基因，任選存在的MoEk i 增強(qiáng)子，恒定區(qū)(κ)及任選存在的(截短的)MoE κ 3’增強(qiáng)子。Neuberger鑒別和檢驗(yàn)了 位于κ恒定區(qū)下游的一個(gè)新的B細(xì)胞特異性增強(qiáng)子(EP004690251)。808bp增強(qiáng)子在κ 基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用，因?yàn)殡S著這個(gè)增強(qiáng)子的除去表達(dá)顯著降低。3’ κ增強(qiáng)子的缺 失也顯著降低體細(xì)胞超突變(SHM)的水平。在轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞表達(dá)研究中，已經(jīng)揭示縮小的 (reduced)、突變的或者缺失的3’ κ增強(qiáng)子不僅降低表達(dá)水平，而且還降低體細(xì)胞超突變 水平。目前不能確定3’ κ增強(qiáng)子是否包含于SHM加工、表達(dá)調(diào)節(jié)或者這兩個(gè)過程中(參 見 Odegard, V. H.，et al. (2006) · Nat. Rev. Immunol. 6，573 ；Inlay, Μ.，et al. (2002) · Nat.Immunol. 3,463)。使用3’ κ增強(qiáng)子的工程化變體進(jìn)行的詳細(xì)表達(dá)研究表明50個(gè)核苷酸的區(qū)域足以 驅(qū)動(dòng)表達(dá)。然而對(duì)于適當(dāng)表達(dá)而言，優(yōu)選145個(gè)核苷酸的縮小的序列(EP04690251 ；Meyer, K. B.，et al. (1990)Nucleic Acids Res. 18(19) :5609-15)。因此，本發(fā)明一方面提供了插入非人動(dòng)物基因組中的核酸，其是在細(xì)胞發(fā)育一定 階段期間在發(fā)育成為成熟B細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒 包含在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中之后防止希望的蛋白質(zhì)樣分子表達(dá)沉默的手段，以及用希望發(fā)育階 段的宿主細(xì)胞定時(shí)表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子的手段。表達(dá)盒被定義為這樣的核酸，其具有導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的手段，例如可以與 基因組中一定位點(diǎn)同源重組的序列。通常所述核酸是DNA，典型是雙鏈DNA。典型地，所述 表達(dá)盒在載體中提供給細(xì)胞，從載體中其被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞基因組中。所述表達(dá)盒進(jìn)一步包含 在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)所需的所有元件，但是在一些實(shí)施方案中，一些這樣的元件可 以存在于導(dǎo)入的第二個(gè)核酸上，從而這些元件反式作用。在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的元件包 括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其它調(diào)節(jié)元件。只有宿主細(xì)胞不能提供的那些元件是必需的。根據(jù)本發(fā)明，重要的是感興趣的基因的表達(dá)在宿主基因組中不是沉默的，特 別是在表達(dá)需要的發(fā)育階段不是沉默的。這可以通過各種手段進(jìn)行，如插入內(nèi)源基因 座中或者通過提供具有防止沉默的核酸元件的表達(dá)盒(Kwaks et al. (2006)Trends Biotechnol. 24(3)，p. 137-142 ；并入本文作參考)。優(yōu)選所述表達(dá)盒插入在宿主細(xì)胞中不 沉默的基因座中(EP 01439234 ；并入本文作參考)。所述防止沉默的手段包括穩(wěn)定化抗抑制序列(STabilizing Anti-Repression-sequences, STAR -序列)禾口基質(zhì)附著區(qū)(Matrix Attachment Regi0ns，MAR)。STAR序列是包含順式影響基因轉(zhuǎn)錄能力的核酸序列。典型地，盡管非必需， STAR序列自身不編碼功能性蛋白質(zhì)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用一個(gè)STAR元件。然而優(yōu) 選使用一個(gè)以上的STAR元件。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒具有兩個(gè)STAR 序列一個(gè)STAR序列在免疫球蛋白基因編碼序列的5’端，一個(gè)STAR序列在免疫球蛋白基 因編碼序列的3，端。MAR是參與使DNA/染色質(zhì)錨定核基質(zhì)的DNA序列，且其已經(jīng)在哺乳動(dòng) 物和植物物種中描述。MAR具有促進(jìn)常染色質(zhì)打開和維持的許多特征。MAR可增加轉(zhuǎn)基因 表達(dá)及限制位置效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，重要的是從所述表達(dá)盒中表達(dá)只在細(xì)胞發(fā)育的一定階段期間發(fā)生， 特別是發(fā)育中的B細(xì)胞，更特別是在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物特別是小鼠中的B細(xì)胞。在這種特殊 情況中，選擇發(fā)育時(shí)期，由此基因從表達(dá)盒(典型為輕鏈或者重鏈樣多肽)中的表達(dá)不明顯 干擾所述細(xì)胞的正常分化和/或成熟，且當(dāng)適當(dāng)時(shí)使得產(chǎn)生的多肽鏈與其配對(duì)體配對(duì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這可以通過提供本發(fā)明的核酸而實(shí)現(xiàn)，其中定時(shí)表 達(dá)的手段是啟動(dòng)子，其活性基本限于一定發(fā)育階段。在發(fā)育中的的B細(xì)胞中，例如在免疫之 后其成熟和/或分化，當(dāng)感興趣的基因是免疫球蛋白的多肽鏈之一時(shí)，其表達(dá)必須不(明 顯)干擾所述成熟和/或分化，且需要定時(shí)表達(dá)，由此所得多肽可以與其配對(duì)體配對(duì)。因此 本發(fā)明提供了這樣的核酸，其中所述一定階段起自所述細(xì)胞在發(fā)育成成熟B細(xì)胞的一定階 段即將發(fā)生輕鏈分子表達(dá)之前或者與發(fā)生輕鏈分子表達(dá)相同的階段。這可以通過選擇僅在所述合適時(shí)期期間是活性的啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。這種啟動(dòng)子可以是⑶19啟動(dòng)子、Ig-α啟動(dòng)子、Ig-β啟動(dòng)子、μ he (所有基因)啟動(dòng)子、Vk啟動(dòng)子或者其 類似物或者同源物。在本發(fā)明的一特定實(shí)施方案中，如上述的啟動(dòng)子不直接驅(qū)動(dòng)感興趣的基因表達(dá)。 代之的是其驅(qū)動(dòng)其產(chǎn)物皿激活感興趣的基因表達(dá)的基因的表達(dá)。這種激活基因可以是編 碼所謂Cre重組酶或者Cre-樣蛋白質(zhì)的基因。感興趣的基因的表達(dá)盒可以例如具有抑制 感興趣的基因表達(dá)的序列。所述序列可以通過Cre重組酶的作用除去，其在希望的啟動(dòng)子 (在發(fā)育的適當(dāng)階段是活性的)控制下。在這個(gè)實(shí)施方案中，需要一組表達(dá)盒。因此本發(fā)明提供了一組作為表達(dá)盒的核酸，其中一個(gè)核酸包含在啟動(dòng)子控制下的 編碼Cre-樣蛋白質(zhì)的表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子在希望的宿主細(xì)胞發(fā)育階段期間是活性的，第二 種核酸包含在組成型啟動(dòng)子控制下的編碼希望的蛋白質(zhì)樣分子的序列，所述啟動(dòng)子可以通 過Cre-樣蛋白質(zhì)的作用而被激活。所述激活優(yōu)選通過除去在IoxP位點(diǎn)兩側(cè)的終止序列而 實(shí)現(xiàn)。所述 Cre/lox 系統(tǒng)在 Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest. 98，p. 600-603 中詳細(xì) 描述，所述文獻(xiàn)并入本文作參考。這種系統(tǒng)參見mmderlich F. T. (2004), ‘‘ Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice ", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwis senschaftlichenFakultatderUniversitatzuKoln :http://deposit, ddb. de/cRi-bin/ dokserv ？ idn = 97557230x&dok var = dl&dok ext = pdf&filename = 97557230x. pd, 其并入本文作參考。本發(fā)明進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其具有本發(fā)明的表達(dá)盒，其中希望的蛋白 質(zhì)樣分子是免疫球蛋白的多肽鏈。優(yōu)選的多肽鏈?zhǔn)禽p鏈。更優(yōu)選的多肽是種系或者種系樣 輕鏈。最優(yōu)選的多肽是012，優(yōu)選重排的種系κ輕鏈IGKV1-39*01/IGKJ1*01(根據(jù)IMGT數(shù) 據(jù)庫命名,http://www. imRt. orR)。進(jìn)一步優(yōu)選所述多肽鏈?zhǔn)沟没静荒苤嘏藕?或排除任何序列修飾，如在B細(xì)胞 親和性成熟過程期間對(duì)Ig正常操作的序列修飾。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其 具有本發(fā)明的表達(dá)盒，其中所述重排和/或序列修飾由于不存在至少部分造成體細(xì)胞超突 變的元件而被阻止，所述元件例如是MoEK i增強(qiáng)子。本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)盒包含防止沉默的手段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述防止沉默的 手段是插入宿主細(xì)胞基因組的對(duì)沉默具有抗性的基因座中的手段。所述插入手段優(yōu)選是同 源重組進(jìn)所述對(duì)沉默具有抗性的位點(diǎn)中的手段。當(dāng)所述非人動(dòng)物是小鼠時(shí)，優(yōu)選的基因座 是rosa-基因座。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的表達(dá)盒在5’ -3’方向包含VK啟動(dòng)子，小鼠前導(dǎo)序列，人V 基因，任選存在的MoEKi增強(qiáng)子，大鼠恒定區(qū)(CK)以及任選存在的(截短的)ΜοΕκ3’增強(qiáng)子。本發(fā)明再進(jìn)一步優(yōu)選的表達(dá)盒在5’ -3’方向包含V κ啟動(dòng)子，人前導(dǎo)序列，人V 基因，任選存在的MoEKi增強(qiáng)子，大鼠恒定區(qū)(CK)及任選存在的(截短的)ΜοΕκ3’增強(qiáng)子。當(dāng)然，本發(fā)明的最終目的是產(chǎn)生用于人體治療中的抗體。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生 希望的抗體的方法，所述方法包括使部分的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗原，由此抗體應(yīng)答被誘 導(dǎo)，并分離特異于所述抗原的抗體。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生希望的抗體的方法，所述方法包括使本發(fā) 明的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗原，由此抗體應(yīng)答被誘導(dǎo)，分離產(chǎn)生這種抗體的細(xì)胞，培養(yǎng)并使 所述細(xì)胞永生化，并收獲所述抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生希望的抗體的方法，所述方法包括使 本發(fā)明的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗原，由此抗體應(yīng)答被誘導(dǎo)，分離編碼至少一部分這種抗體 的核酸，將所述核酸或者其拷貝或者衍生物插入表達(dá)盒中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述抗體。從轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。特別優(yōu)選的是從一個(gè)細(xì) 胞中產(chǎn)生抗體混合物的方法，其中編碼這些抗體的核酸得自本發(fā)明的小鼠。這些所謂的寡克隆(oligoclonics)在W004106375和W005068622中揭示，所述文 獻(xiàn)在此并入本文作參考。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，優(yōu)選小鼠，其能產(chǎn)生特異的及高親和性的雜 交小鼠-人抗體，其優(yōu)選具有種系構(gòu)型或者近種系構(gòu)型的人免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(qū)， 以及優(yōu)選鼠免疫球蛋白重鏈可變(VH)區(qū)，其在抗原驅(qū)動(dòng)的親和性成熟處理期間積聚體細(xì) 胞突變?？梢詫?duì)所述雜交抗體的鼠VH區(qū)進(jìn)行人源化處理，以產(chǎn)生當(dāng)用于人體中時(shí)基于種系 或者近種系VL區(qū)和已經(jīng)人源化的鼠VH區(qū)而免疫原性降低的mAb。特別地，本發(fā)明示出轉(zhuǎn)基因小鼠能產(chǎn)生具有基本上未突變的L鏈的特異性及高親 和性小鼠-人雜交抗體，所述轉(zhuǎn)基因小鼠具有在順式作用遺傳元件控制下的編碼重排的人 VL區(qū)的DNA表達(dá)構(gòu)建體，在B細(xì)胞發(fā)育期間，所述順式作用遺傳元件使得轉(zhuǎn)基因在大部分B 細(xì)胞上的適時(shí)和受調(diào)節(jié)的表達(dá)，但缺少對(duì)轉(zhuǎn)基因造成體細(xì)胞超突變機(jī)制的元件。本發(fā)明示 出重排的人轉(zhuǎn)基因能與不同的內(nèi)源鼠免疫球蛋白H鏈配對(duì)，形成在B細(xì)胞表面上表達(dá)的小 鼠-人雜交免疫球蛋白，以及足以促進(jìn)鼠B細(xì)胞發(fā)育以獲得相當(dāng)大的且不同的周圍B細(xì)胞 組份。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體具有人重排的L鏈V區(qū)的編碼序 列，其在人VL啟動(dòng)子控制下以指導(dǎo)B細(xì)胞特異性表達(dá)。此外，所述構(gòu)建體具有鼠3’Ck增強(qiáng) 子序列，以進(jìn)行B細(xì)胞特異性的及可誘導(dǎo)的且高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，所述構(gòu)建體被設(shè) 計(jì)為缺少促進(jìn)體細(xì)胞超突變機(jī)制募集到轉(zhuǎn)基因的調(diào)節(jié)元件，如內(nèi)含子增強(qiáng)子和3’ C-κ增 強(qiáng)子。在一相關(guān)的實(shí)施方案中，重排的人VL基因通過位點(diǎn)特異性整合插入在鼠Rosd6 基因座中。就“靶向轉(zhuǎn)基因”方法而言，Rosde基因座可用于有效產(chǎn)生具有可預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)模式的轉(zhuǎn)基因生物體(如小鼠)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)其與許多不同的鼠VH基因配對(duì)的能力選擇重排的 人VL區(qū)域，以保證具有不同的VH基因儲(chǔ)備庫的一群B細(xì)胞的產(chǎn)生。獲得這種VL區(qū)的方法 包括從小鼠B細(xì)胞中擴(kuò)增重排的VH基因的儲(chǔ)備庫以及從人B細(xì)胞中擴(kuò)增人重排的種系VL 區(qū)的儲(chǔ)備庫，并將其克隆進(jìn)噬菌粒展示載體中，以在細(xì)菌中制備雜交免疫球蛋白的不同文 庫。通過未選擇的及經(jīng)抗原選擇的成對(duì)VH/VL集合的核苷酸序列分析，鑒別了與許多不同 的鼠VH基因配對(duì)的人種系VL基因。本文描述了具有這種能力的人種系VL基因的集合。在一個(gè)實(shí)施方案中，示出當(dāng)用抗原免疫時(shí)，B細(xì)胞能發(fā)起免疫應(yīng)答，導(dǎo)致分泌具有 高特異性和親和性的雜交抗體的B細(xì)胞產(chǎn)生。編碼這些抗體的V區(qū)通過不具有或者具有極 少突變的人轉(zhuǎn)基因輕鏈以及具有通過體細(xì)胞超突變機(jī)制導(dǎo)入的不同數(shù)目的突變的鼠重鏈而鑒定。在一相關(guān)的實(shí)施方案中，涵蓋了通過雜交瘤和展示技術(shù)從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得高親 和性雜交的單克隆抗體的策略，以及人源化鼠VH區(qū)以獲得用于人體中的免疫原性較低的 抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫球蛋白L鏈轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其包含編碼人 免疫球蛋白VL區(qū)組合動(dòng)物免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(CL)的DNA序列，該序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序 列可操縱地連接，當(dāng)整合進(jìn)非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中時(shí)產(chǎn)生具有無或者很少經(jīng)歷體細(xì)胞超突變的 人VL區(qū)的Ig VL-CL多肽。所述Ig VL能與在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中在B細(xì)胞發(fā)育期間產(chǎn)生的 重排的VH-CH多肽配對(duì)，所述VH-CH多肽保留在刺激時(shí)經(jīng)歷體細(xì)胞超突變的能力。所述CL 區(qū)可以是任何動(dòng)物物種的，通常能與非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的CH區(qū)配對(duì)。本發(fā)明還包括上述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因非 人動(dòng)物能產(chǎn)生由VL-CL多肽和VH-CH多肽組成的雜交抗體，其中VL區(qū)是人源的，CL、VH和 CH可以源于任何動(dòng)物物種包括人。在免疫時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能產(chǎn)生由體細(xì)胞超突變的VH 基因及由所述轉(zhuǎn)基因編碼的基本未突變的VL基因編碼的高親和性抗體。另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法，所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物應(yīng)答 抗原攻擊能產(chǎn)生雜交抗體，所述方法包括功能性破壞內(nèi)源免疫球蛋白輕鏈基因座并在動(dòng)物 基因組中插入本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。本發(fā)明包括通過這種方法可獲得的動(dòng)物在產(chǎn)生B細(xì)胞中的應(yīng)用，所述B細(xì)胞產(chǎn)生 具有人VL輕鏈的免疫球蛋白。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生B細(xì)胞的方法，所述B細(xì)胞產(chǎn)生 具有人VL且結(jié)合選擇的抗原的免疫球蛋白，所述方法包括用所述抗原攻擊通過上述方法 可獲得的動(dòng)物，并且從所述動(dòng)物中篩選結(jié)合所述抗原的B細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過這 種方法可獲得的B細(xì)胞以及通過使這種B細(xì)胞永生化可獲得的雜交瘤，例如通過融合上述B 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞獲得的雜交瘤。本發(fā)明還包括產(chǎn)生單克隆抗體的方法，所述方法包括培 養(yǎng)這種雜交瘤。再一方面，本發(fā)明提供了上述B細(xì)胞在產(chǎn)生雜交瘤或者相應(yīng)單克隆抗體中 的應(yīng)用。本發(fā)明再一方面提供了產(chǎn)生具有人VL鏈且結(jié)合選擇的抗原的免疫球蛋白的方 法，所述方法包括用所述抗原攻擊上述獲得的動(dòng)物，并且從中獲得免疫球蛋白。在一種策略中，作為單獨(dú)的步驟，將由人種系V和J基因區(qū)段編碼的重排的VL區(qū) 及任何動(dòng)物物種的輕鏈恒定區(qū)但優(yōu)選鼠的恒定區(qū)導(dǎo)入小鼠種系中。轉(zhuǎn)基因DNA可以導(dǎo)入受 精卵或者胚胎干細(xì)胞的中前核中。所述整合根據(jù)應(yīng)用的特殊策略可以是隨機(jī)或者同源的。 例如，VL轉(zhuǎn)基因可以通過隨機(jī)插入而導(dǎo)入，導(dǎo)致小鼠基因組中攜帶所述轉(zhuǎn)基因的一或多個(gè) 拷貝?；蛘?，使用本領(lǐng)域描述的位點(diǎn)特異性重組可以使人VL轉(zhuǎn)基因靶向于特定基因組基因 座。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，VL轉(zhuǎn)基因靶向鼠ROSA^基因座，該基因座是使插入的 轉(zhuǎn)基因強(qiáng)力且可預(yù)測(cè)地表達(dá)的合適整合位點(diǎn)(EP 1439234)。所述靶向載體使得可以插入基 因表達(dá)盒的一個(gè)拷貝，因此避免了通過多個(gè)拷貝的重排調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。通過選擇常染色 體Rosd6基因座作為插入位點(diǎn)，插入的轉(zhuǎn)基因在非人動(dòng)物中的表達(dá)模式可預(yù)測(cè)。此外，避 免了隨機(jī)X失活和/或通過染色體位置效應(yīng)的調(diào)節(jié)。這也不需要產(chǎn)生和分析任何指定轉(zhuǎn)基 因的多個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。最后，針對(duì)位點(diǎn)特異性整合的Rosd6靶向載體可用于多個(gè)基因表達(dá)盒。因此，可以設(shè)想2或多個(gè)不同的重排的種系人VL區(qū)被插入Rosd6基因座中，以進(jìn)一步 增加雜交或者人抗體的儲(chǔ)備庫的多樣性。在另一實(shí)施方案中，重排的人VL區(qū)可以靶向鼠IgK或者λ輕鏈，以功能性失活 內(nèi)源基因座，或者含有重排的人VL區(qū)的小鼠可以與沒有功能性κ或者λ Ig或者這兩個(gè)基 因座的小鼠繁殖。因此，通過使用轉(zhuǎn)化、使用重復(fù)步驟或者組合繁殖，可以獲得能產(chǎn)生在基 本不存在內(nèi)源宿主免疫球蛋白輕鏈時(shí)攜帶人VL轉(zhuǎn)基因的抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)其與大部分(substantial portion)鼠VH區(qū)的配對(duì)形成 在B細(xì)胞表面上表達(dá)的功能性小鼠-人雜交抗體的多樣的儲(chǔ)備庫的能力選擇人VL轉(zhuǎn)基因。 大部分鼠VH區(qū)是指人VL與在B細(xì)胞發(fā)育期間產(chǎn)生的至少0. 的鼠VH區(qū)配對(duì)，更優(yōu)選與 至少及最優(yōu)選至少10%的鼠VH區(qū)配對(duì)。鑒別具有這種特性的人VL基因的方法包括人 VL區(qū)的儲(chǔ)備庫與鼠VH區(qū)的儲(chǔ)備庫的隨機(jī)配對(duì)，VH與VL區(qū)在合適的真核或者原核表達(dá)載體 中的共表達(dá)，以及篩選域大部分鼠VH區(qū)配對(duì)的人VL區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用噬菌 粒載體指導(dǎo)小鼠-人抗體片段在細(xì)菌細(xì)胞中或者絲狀噬菌體表面的表達(dá)，及通過本領(lǐng)域已 知方法分析抗體片段的結(jié)合能力。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)其與大部分人VH區(qū)配對(duì)形成在B細(xì)胞表面上表達(dá)的人抗 體的不同的儲(chǔ)備庫的能力選擇人VL轉(zhuǎn)基因。大部分人VH區(qū)是指與所述人VL與在B細(xì)胞 發(fā)育期間產(chǎn)生的至少0. 的人VH區(qū)配對(duì)，優(yōu)選與至少及更優(yōu)選至少10%的人VH區(qū)配對(duì)。在后一實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域所述使人VL轉(zhuǎn)基因小鼠與攜帶功能性重排或者非 重排的人H鏈免疫球蛋白基因座及功能性失活的內(nèi)源H鏈基因座的小鼠雜交。三個(gè)宿主Ig 基因座(重鏈，κ和λ輕鏈)的每一個(gè)基因座的兩個(gè)拷貝的功能性失活使得可以產(chǎn)生純 人抗體分子，而沒有宿主抗體或者宿主人嵌合抗體產(chǎn)生，其中所述宿主含有人IgH及重排 的人VL轉(zhuǎn)基因。通過用特異性抗原免疫，這種宿主株系通過產(chǎn)生特異性人抗體的小鼠B細(xì) 胞的產(chǎn)生而作出應(yīng)答，該B細(xì)胞隨后與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合或者以任何其它方式永生化， 以持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)生人單克隆抗體?；蛘?，所述B細(xì)胞群用作VH區(qū)的來源，其可以通過如本領(lǐng) 域已知的構(gòu)建cDNA文庫或者通過使用人VH區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而獲得。人重排的VL基因在合適的真核或者原核微生物中重建，所得DNA片段可以導(dǎo)入小 鼠受精卵或者胚胎干細(xì)胞的前核中。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了指導(dǎo)B細(xì)胞特異性表達(dá)的VL轉(zhuǎn)基 因的各種構(gòu)建體，其通常具有如下通式前導(dǎo)序列和相關(guān)的上游序列以指導(dǎo)B細(xì)胞特異性 表達(dá)轉(zhuǎn)基因，人VL轉(zhuǎn)基因的編碼序列，指導(dǎo)B細(xì)胞特異性和高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因和鼠恒定區(qū) 基因的增強(qiáng)子序列。在優(yōu)選式中，所述增強(qiáng)子是C-K 3’增強(qiáng)子，因?yàn)楫?dāng)用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體 中時(shí)，其指導(dǎo)在B細(xì)胞譜系細(xì)胞中高水平表達(dá)，但是不募集體細(xì)胞超突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離動(dòng)物并針對(duì)穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行分析，所述動(dòng)物優(yōu)選小鼠，其基 因組中包含轉(zhuǎn)基因的一或多個(gè)拷貝。選擇示出優(yōu)選在B細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的動(dòng) 物。如果需要，使優(yōu)選在不同染色體上包含單獨(dú)插入轉(zhuǎn)基因的一或多個(gè)拷貝的不同動(dòng)物株 系雜交，以獲得具有不同的插入轉(zhuǎn)基因的一或多個(gè)拷貝的動(dòng)物，以增加轉(zhuǎn)基因在動(dòng)物、優(yōu)選 在B細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代，所述后代至少在其B細(xì)胞 譜系中包含重鏈或者輕鏈編碼序列以及使所述序列對(duì)于DNA重排和/或體細(xì)胞超突變有抗性的手段。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代，所述后代包含在細(xì)胞發(fā)育 成成熟B細(xì)胞的一定發(fā)育階段期間在細(xì)胞中表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子的表達(dá)盒。本發(fā)明另外提供了分離自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含重鏈或者 輕鏈編碼序列以及使所述序列對(duì)于DNA重排和/或體細(xì)胞超突變有抗性的手段。本發(fā)明另 外提供了分離自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含在細(xì)胞發(fā)育成成熟B細(xì)胞的 一定發(fā)育階段期間在細(xì)胞中表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子的表達(dá)盒。本發(fā)明的細(xì)胞，優(yōu)選產(chǎn)生 抗體的B細(xì)胞或者能分化或者成熟為產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞的細(xì)胞，可用于在體外產(chǎn)生抗體，如 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如Gascan et al. 1991. J. Exp. Med. 173 :747-750所述。永生化本 發(fā)明的細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域已知，包括例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤，用EB病毒 轉(zhuǎn)化；活化和轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(STAT)的表達(dá)，通過CD40和IL4受體信號(hào)傳導(dǎo)的活化， 禾口 / 或 Bcl6 的表達(dá)(Shvarts et al. 2002. Genes Dev 16 :681-686)。在單獨(dú)的步驟中，使小鼠內(nèi)源κ和λ輕鏈基因座基本上無功能，由此轉(zhuǎn)基因小鼠 中至少大部分B細(xì)胞攜帶含有轉(zhuǎn)基因人VL區(qū)的Ig受體。內(nèi)源小鼠免疫球蛋白基因座的失 活通過在小鼠胚胎干細(xì)胞中同源重組以靶向破壞適當(dāng)?shù)幕蜃鴮?shí)現(xiàn)。所述靶向破壞包括 改變基因組序列，由此產(chǎn)生基本無功能的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白κ和/或λ輕鏈。術(shù)語“基 本上無功能的內(nèi)源小鼠免疫球蛋白”表示所述內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因座為功能性沉默， 由此內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因座、優(yōu)選內(nèi)源κ輕鏈基因座的功能性蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低 為參考小鼠中表達(dá)水平的大約20 %，更優(yōu)選大約10 %、5 %、2 %，及更優(yōu)選大約1 %。在最優(yōu) 選的實(shí)施方案中，內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因座的功能性蛋白質(zhì)表達(dá)水平降至0%。功能性 蛋白質(zhì)表達(dá)水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式確定，包括western印跡及與小鼠重 鏈配對(duì)。所述參考小鼠是其中內(nèi)源κ和/或λ輕鏈基因座未被破壞的小鼠。所述改變包 括為內(nèi)源免疫球蛋白基因的功能性表達(dá)所必需的基因序列的突變和/或缺失?；蛘?，所述 改變包括在內(nèi)源小鼠免疫球蛋白κ和/或λ輕鏈基因座中插入核酸，由此內(nèi)源免疫球蛋 白基因的功能性表達(dá)被降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含導(dǎo)致內(nèi)源免疫球蛋白基因 轉(zhuǎn)錄沉默的沉默元件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，或者額外地，所述核酸包含例如通過導(dǎo)入使 編碼序列移碼的外顯子破壞內(nèi)源免疫球蛋白基因的沉默和/或翻譯的序列，或者包含提前 終止密碼子的序列。在每種情況中均產(chǎn)生嵌合動(dòng)物，其部分衍生自修飾的胚胎干細(xì)胞，且能 通過種系傳遞該遺傳修飾。具有人免疫球蛋白基因座的小鼠株系與具有失活的小鼠基因座 的株系交配，產(chǎn)生可以產(chǎn)生基本上僅包含人輕鏈的抗體的動(dòng)物。通過本領(lǐng)域已知方法制備同源重組構(gòu)建體，并除去任何不希望的序列，例如原核 序列?？梢詰?yīng)用將同源重組構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞中的任何便利的技術(shù)。這些技術(shù)包括原生 質(zhì)球融合、脂染、電穿孔、磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移或者直接顯微注射。在靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化或者 轉(zhuǎn)染之后，利用陽性和/或陰性標(biāo)志物選擇靶細(xì)胞，例如通過新霉素抗性和/或無環(huán)鳥苷 (acyclovir)和/或丙氧鳥苷(gancyclovir)抗性選擇。然后對(duì)示出希望表型的那些細(xì)胞 通過限制分析、電泳、Southern分析、PCR等進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過鑒別在靶基因座示出存 在損害的片段，鑒別其中已經(jīng)發(fā)生同源重組以失活靶基因座拷貝的細(xì)胞。此外，示出當(dāng)接種時(shí)，前述轉(zhuǎn)基因小鼠中的鼠和人VH區(qū)而不是VL區(qū)能經(jīng)歷體細(xì)胞 超突變，產(chǎn)生高親和性抗體。有利地，預(yù)測(cè)由種系VL區(qū)編碼的這些抗體當(dāng)用于人體中時(shí)有助于降低免疫原性，并獲得聚集傾向更低且因此更安全地治療性用于人體中的更穩(wěn)定的抗 體。衍生自前述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者細(xì)胞的mAb均共有相同的人VL區(qū)。已經(jīng)描述了 共有相同VL區(qū)的mAb可以在一個(gè)克隆細(xì)胞中共表達(dá)，產(chǎn)生具有功能性結(jié)合位點(diǎn)的重組抗體 混合物(見W004106375和W005068622)。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異性及高親和性mAb 的平臺(tái)，其構(gòu)成由克隆細(xì)胞產(chǎn)生的mAb混合物的基礎(chǔ)。優(yōu)選衍生自前述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的mAb是針對(duì)細(xì)胞靶位。優(yōu)選的靶是人表 面表達(dá)的或者可溶的蛋白質(zhì)或者碳水化合物分子。進(jìn)一步優(yōu)選的靶是表面表達(dá)的蛋白質(zhì)或 者碳水化合物分子，其在細(xì)菌、病毒及其它病原體特別是在人的表面上表達(dá)。更特別地，優(yōu)選的靶包括細(xì)胞因子和趨化因子，包括但不限于白細(xì)胞介素 1 β (ILl β )、IL2、IL4、IL5、IL7、IL8、IL12、IL13、IL15、IL18、IL21、IL23，及趨化因子如 C)(C趨化因子、CC趨化因子、C趨化因子(或者γ趨化因子)如)(CL1 (淋巴細(xì)胞趨化因 子-α )和)(CL2 (淋巴細(xì)胞趨化因子-β )，以及CX3C趨化因子。優(yōu)選的靶進(jìn)一步包括細(xì) 胞因子和趨化因子的受體分子，包括I型細(xì)胞因子受體如IL-2受體，II型細(xì)胞因子受體 如干擾素受體，免疫球蛋白(Ig)超家族受體，腫瘤壞死因子受體家族包括CD40、CD27和 CD30的受體，絲氨酸/蘇氨酸-蛋白質(zhì)激酶受體如TGFii受體，G-蛋白質(zhì)結(jié)合的受體如 CXCR1-CXCR7，以及酪氨酸激酶受體如成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)家族成員，EGF受體 家族成員包括 erbBl (EGF-R ；HER1)、erbB2 (HER2)、erbB3 (HER3)和 erbB4 (HER4)，胰島素受 體家族成員包括IGF-Rl和IGF-RII，PDGF受體家族成員，肝細(xì)胞生長因子受體家族成員包 括c-Met (HGF-R)，Trk受體家族成員，AXL受體家族成員，LTK受體家族成員，TIE受體家族 成員，ROR受體家族成員，DDR受體家族成員，KLG受體家族成員，RYK受體家族成員，MuSK受 體家族成員，以及血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)家族成員。進(jìn)一步優(yōu)選的靶是在腫瘤中過表達(dá)或者選擇性表達(dá)的靶，例如VEGF、⑶20、⑶38、 CD33、CEA、EpCAM, PSMA, CD54、LewisY, CD52、CD40、CD22、CD51/CD61、CD74、MUC-U CD38、 CD19、CD262(TRAIL-R2)、RANKL、CTLA4 和 CD30 ；參與慢性炎癥的靴，例如 CD25、CDlla、TNF、 CD4、CD80、CD23、CD3、CD14、IFN y、CD40L、CD50、CD122、TGF β 和 TGF α。優(yōu)選的在細(xì)菌、病毒及其它寄生性病原性特別是人表面上表達(dá)的表面表達(dá)的蛋 白質(zhì)或者碳水化合物分子包括如下病原體的表面標(biāo)志物甲型和乙型流感病毒如血凝素 (HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，絲狀病毒如埃博拉病毒，狂犬病病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，腮腺 炎病毒，黃病毒如1-4型登革熱病毒，蜱傳腦炎病毒，西尼羅河病毒，日本腦炎病毒及黃 熱病毒，副粘液病毒包括副粘液病毒如副流感病毒1、3，Rubulavirus如腮腺炎病毒和副 流感病毒2、4，麻疹病毒，及肺病毒如呼吸道合胞病毒，痘苗病毒，天花病毒，冠狀病毒包 括嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒，甲型、乙型和丙型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒，皰疹 病毒包括巨細(xì)胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒，以及水痘-帶狀皰疹病毒，細(xì)小病毒例如 Β19 ；嗜肺性軍團(tuán)病桿菌；單核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；空腸彎曲菌 (Campylobacter jejuni)；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌;Borrelia burgdorferi ； 幽門螺桿菌；Ehrlichia chaffeensis ；艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)；霍 亂弧菌；腸道沙門氏菌血清型Typhimurium ；Bartonella henselae ；化膿性鏈球菌(Group A Strep)；無乳鏈球菌(Group B Strep)；多重藥物抗性S. aureus (例如MRSA)；肺炎衣原體；肉毒桿菌；創(chuàng)傷弧菌；肺炎副變異性衣原體(Parachlamydia pneumonia)；無枝菌 酸棒桿菌(Corynebacterium amycolatum)；月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)； Linezolid-抗性腸球菌(E. faecalis 和 E. faecium)；以及多重藥物抗性 Acinetobacter baumannii 0最優(yōu)選的靶是IL-6及其受體，IL-6Rci，糖蛋白命名的gpl30，RSV，特別是表面 蛋白F、G和SH及非結(jié)構(gòu)蛋白如N和M，及受體酪氨酸激酶，特別是erbBl (EGF-R ；HER1)， erbB2 (HER2)，erbB3 (HER3)，erbB4 (HER4)，IGF-Rl 以及 IGF-RII，c_Met (HGF-R)。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對(duì)上述靶的特異性及高親和性mAb的平臺(tái)，其構(gòu)成由 克隆細(xì)胞產(chǎn)生的mAb混合物的基礎(chǔ)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性和高親和性mAb包 含針對(duì)至少一個(gè)靶上的不同表位的mAb。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性和高親和 性mAb包含針對(duì)不同靶的mb，所述靶如EGF-受體家族的一或多個(gè)成員，包括erbBl (EGF-R ； HER1)、erbB2(HER2)、erbB3(HER3)和 erbB4(HER4)。除非特別指出，則本發(fā)明中使用科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知 的含義。進(jìn)一步地，除非特別指出，則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括其復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括其單數(shù) 形式。通常地，本文描述的與細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)和寡肽或多肽化學(xué)以及 雜交相關(guān)的命名法為本領(lǐng)域熟知和慣用。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行重組DNA、寡核苷酸合成以及組 織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔，脂染)。酶反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)廠商指導(dǎo)或者本領(lǐng)域常用或 者本文所述進(jìn)行。先前的技術(shù)和程序通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法進(jìn)行，如在本說明書 引用和討論的各個(gè)一般和更特別的參考文獻(xiàn)中描述。見例如Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. QOOl))，將其并入本文作參考。本文所述與分析化學(xué)、合成有機(jī) 化學(xué)以及醫(yī)藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)相關(guān)的命名法為本領(lǐng)域熟知及慣用。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 進(jìn)行化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和給藥以及治療患者。附圖簡述

圖1 小鼠特異性VH引物退火位置及通過引物3’末端突出序列導(dǎo)入的必需的限 制位點(diǎn)的位置的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。圖2:PCR擴(kuò)增步驟(擴(kuò)增，中間體及位點(diǎn)導(dǎo)入)。圖中示出了每個(gè)步驟的小鼠VH 擴(kuò)增引物(以及引物混合物)的位置和名稱。圖3 :MV1043載體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這個(gè)載體用于克隆人或者鼠VH片段。 012(IGKVl-39)被標(biāo)示為VL基因。這個(gè)載體的產(chǎn)物組合大腸桿菌細(xì)胞中的輔助噬菌體使得 可以產(chǎn)生在噬菌體顆粒表面上展示作為與g3蛋白質(zhì)的融合產(chǎn)物的Fab片段的噬菌體，且載 體在噬菌體中作為遺傳內(nèi)容物存在(F10RI)。圖4 :J_區(qū)段下游小鼠Ck基因座的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖中標(biāo)示出增強(qiáng)子和CK區(qū)。下 面的箭頭標(biāo)示除去的區(qū)域以使該基因座沉默。圖5 小鼠C-λ基因座的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖中示出所有三個(gè)活性V區(qū)(Igl-Vl、V2和 V3)以及 J-區(qū)段(Igl-Jl、Igl_J2、Igl-J3、Igl-J4 和假區(qū)段 Igl-J3p)和恒定區(qū)(Igl-CU Igl-C2、Igl-C3和Igl-C4)。被缺失以使基因座沉默的區(qū)域通過缺失標(biāo)志示出。這些缺失 包括所有活性V基因(1、2和幻及V2與V3基因之間的區(qū)段。圖6 具有位于前導(dǎo)序列開放讀框(ORF)內(nèi)的內(nèi)含子的IGKVl-39/J-Ck拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
圖7 具有位于前導(dǎo)序列開放讀框(ORF)內(nèi)的內(nèi)含子的IGLV2-14/J_Ck拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖8 :VkP-IGKVl-39/J-Ck(VkP-012)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子源自 IGKV1-39 基因，直 接位于有效轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件的前面。基因間序列(包括增強(qiáng)子)衍生自小鼠及得自 BAC克隆。C-K序列編碼大鼠的κ恒定區(qū)。圖9 :VkP-IGLV2-14/J-Ck(VkP-2a2)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子源自 IGKV1-39 基因，直 接位于有效轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件的前面。基因間序列(包括增強(qiáng)子)衍生自小鼠及得自 BAC克隆。C-K序列編碼大鼠的κ恒定區(qū)。圖 10 :VkP-IGKVl-39/J-Ck-A l(VkP-012-dell)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與圖 9 的 VkP-IGKVl-39/J-Ck除了內(nèi)含子增強(qiáng)子區(qū)域之外是相同的。圖 11 :VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2(VkP-012-del2)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與圖 10 的 VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al除了缺失Ck基因與3’增強(qiáng)子之間的一段基因間序列之外是相同 的。此外，所述3，增強(qiáng)子的大小從809bp降低至125bPo圖12 本申請(qǐng)中使用或者提及的序列的綜述。圖 13 :Rosa^-IgVkl_39KI 等位基因的產(chǎn)生。(A)pCAGGS_IgVKl_39 靶向載體的示 意圖。(B)pCAGGS-IgVKl-39靶向載體的核苷酸序列。(C)靶向策略。圖14 (A)包含插入pCAGGS-IgVKl-39靶向載體的ES克隆的基因組DNA的 Southern印跡分析。將4個(gè)獨(dú)立克隆的基因組DNA用AseI消化，并用指示靶向載體的 5'-邊界的5el探查。所有克隆在5’末端均包含正確插入的靶向載體。(B)包含插入 pCAGGS-IgVKl-39靶向載體的ES克隆的基因組DNA的Southern印跡分析。將4個(gè)獨(dú)立克 隆的基因組DNA用MscI消化，并用指示靶向載體的3'-邊界的3el探查。所有克隆在3’ 末端均包含正確插入的靶向載體。(C)包含插入pCAGGS-IgVKl-39靶向載體的ES克隆的基 因組DNA的Southern印跡分析。將4個(gè)獨(dú)立克隆的基因組DNA用BamHI消化，并用指示靶 向載體的5'-邊界的內(nèi)部Neo探針探查。所有克隆均包含正確單一插入的靶向載體。圖 15 :Rosa^-IgV12-14KI 等位基因的產(chǎn)生。(A)pCAGGS_IgVL2_14 靶向載體的示 意圖。(B)基于重排的種系IGLV2-14/J νλ區(qū)(IGLV2_14/J_Ck)的含有CAGGS表達(dá)插入序 列的pCAGGS-IgVL2-14靶向載體的核苷酸序列。(C)靶向策略。圖16 :IGKV1_39殘基1-107的Epibase 圖。子圖A示出DRBl同種異型的結(jié)合 強(qiáng)度，而C示出DRB3/4/5、DQ和DP同種異型的結(jié)合強(qiáng)度。圖中數(shù)值表示解離常數(shù)(Kd)，在 Ο.ΟΙμΜ-Ο. ΙμΜ范圍內(nèi)繪制對(duì)數(shù)標(biāo)度圖(極強(qiáng)結(jié)合物可能已超出該圖)。對(duì)于中等結(jié)合 肽，僅給出定性數(shù)值，弱和無結(jié)合物未示出。將數(shù)值繪制在靶序列中肽的第一個(gè)殘基上(所 述肽自身延伸另外9個(gè)殘基)。重要的是，僅示出了每種肽的最強(qiáng)的結(jié)合受體具有較低親 和性的交叉反應(yīng)同種異型在這個(gè)圖中不可觀測(cè)。最強(qiáng)的結(jié)合受體通過其血清型名稱表示。 最后，任何種系過濾的肽均以較亮的顏色在表位圖中標(biāo)繪(在這種情況中，發(fā)現(xiàn)沒有非自 身表位)。子圖B示出每個(gè)十肽的HLA結(jié)合混雜性(binding promiscuity) (Y-軸識(shí)別每 個(gè)肽中關(guān)鍵表位的HLA同種異型的數(shù)目，從X-軸上示出的指定殘基開始)。所述混雜性根 據(jù)共47個(gè)是關(guān)鍵結(jié)合物的肽的同種異型的數(shù)目測(cè)量。白色列表示自身肽，黑色列(在此沒 有)表示非自身肽。圖17 JGKV1-39的表位圖，顯示通過15聚體形式血清型在IGKV1-39序列中預(yù)測(cè) 的肽結(jié)合物的存在。每個(gè)15聚體編號(hào)示于該圖的上方。相應(yīng)15聚體的完整序列在表7中示出。黑框表示15聚體中存在一或多個(gè)關(guān)鍵的自身表位，血清型在左側(cè)列出。關(guān)鍵表位是 定義為強(qiáng)或者中等DRBl結(jié)合物及強(qiáng)DRB3/4/5或者DP或者DQ結(jié)合物。圖18 =IgK基因座的組成型敲除(KO)示意圖。㈧靶向策略。(B)pIgK靶向載 體的示意圖。圖19 =IgA基因座的組成型K0。㈧靶向策略的第一個(gè)步驟。(B)靶向策略的第
二個(gè)步驟。圖20 靶向載體的示意圖。(A)pVkP-012(VkP-IGKVl-39/J-Ck)；(B)pVkP-012-dell (VkP-IGKVl-39/J-Ck-A 1)；(C)pVkP-012-del2(VkP-IGKVl-39/J-Ck-Δ 2)。圖21 使用RMCE通過靶向轉(zhuǎn)基因使轉(zhuǎn)基因插入Rosd6基因座的靶向策略。(A)VkP-012(VkP-IGKVl-39/J-Ck)；(B)VkP-012-dell (VkP-IGKVl-39/J-Ck-A 1)；(C)VkP-012-del2(VkP-IGKVl-39/J-Ck-Δ 2)。圖22 :MV1057載體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。用VH片段置換指定的填充片段產(chǎn)生這樣的表達(dá) 載體，其可以轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以產(chǎn)生具有含有012(IGKV1-39)VL基因的輕鏈的IgGl抗體。圖23 在脾的非B細(xì)胞群中沒有轉(zhuǎn)基因的人Vkl輕鏈表達(dá)。圖M 轉(zhuǎn)基因人Vkl輕鏈在脾的所有B細(xì)胞群中表達(dá)。圖25 轉(zhuǎn)基因人Vkl輕鏈在腹膜腔的Bl細(xì)胞中表達(dá)。圖沈轉(zhuǎn)基因人Vkl輕鏈在原-和前-B細(xì)胞中不表達(dá)，但是在骨髓的未成熟和再 循環(huán)B細(xì)胞群中表達(dá)。㈧骨髓細(xì)胞的門控(Gating)。⑶疊加來自一個(gè)WT對(duì)照的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)的直方圖。圖27 轉(zhuǎn)基因人Vkl輕鏈與血液循環(huán)B細(xì)胞中內(nèi)源輕鏈及IgM表達(dá)直接相關(guān)。 實(shí)施例實(shí)施例1 人輕鏈V基因克隆本實(shí)施例描述選擇兩個(gè)人輕鏈V基因背后的原理，所述輕鏈V基因一個(gè)是κ類 型的基因，一個(gè)是λ類型的基因，用它們來證明表達(dá)輕鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠的概念。De Wildt et al. 1999 (de Wildt et al. (1999) J. Mol. Biol. 285(3) :895)分析了外周 IgG 陽性 B 細(xì) 胞中人輕鏈的表達(dá)?；谶@些數(shù)據(jù)，選擇IGKV1-39(012)和IGLV2-14Qa2)作為輕鏈，因 為它們?cè)贐細(xì)胞儲(chǔ)備庫中有很好的表現(xiàn)。輕鏈的J區(qū)段序列基于GenBank ABA^122(針 M IGKVl-39) (Rabquer, B. J. ， Smithson, S. L. ， Shriner, A. K. and ffesterink, Μ. A. J.) 和 GenBankAAF20450(針對(duì) IGLV2-14)(Ignatovich, 0.，Tomlinson, I. Μ.，Popov, Α. V.， Bruggemann, Μ. and Winter, G. J. Mol. Biol. 294 (2), 457-465 (1999))中存在的序列而被選 擇。所有構(gòu)架區(qū)段均轉(zhuǎn)化為種系氨基酸序列以提供在潛在臨床應(yīng)用中可能的最低免 疫原性。實(shí)施例2 獲得與人IGKV1-39基因區(qū)段配對(duì)的小鼠重鏈V基因以形成功能抗體結(jié) 合位點(diǎn)
本實(shí)施例描述能與單個(gè)重排人種系IGKV1-39/J區(qū)域配對(duì)的小鼠重鏈V基因的鑒 別。來自用破傷風(fēng)類毒素免疫接種小鼠的脾VH儲(chǔ)備庫被克隆在具有單一人IGKVI-39-Ck 輕鏈的噬菌體展示Fab載體，并針對(duì)破傷風(fēng)類毒素淘選。分析在一輪淘選后獲得的克隆的 結(jié)合特異性。編碼破傷風(fēng)類毒素特異性Fab片段的小鼠VH基因進(jìn)行序列分析以鑒別獨(dú)特 克隆并分配VH、DH和JH利用。本文描述的許多方案是構(gòu)建噬菌體展示文庫及淘選用于結(jié)合感興趣抗原的噬菌 體的標(biāo)準(zhǔn)方案并且描述于Antibody Phage Display =Methods and Protocols (editor (s) Philippa M. 0' Brien, Robert Aitken)。免疫接種BALB/c小鼠接受一次破傷風(fēng)類毒素免疫接種，6周后用破傷風(fēng)類毒素加強(qiáng)。脾細(xì)胞分離制備脾細(xì)胞懸液。在解剖后，脾用PBS洗滌，并轉(zhuǎn)移至具有20ml PBS的60mm皮 氏皿中。使用20mlPBS和G20針的注射器重復(fù)沖洗脾。在用PBS洗滌沖洗的細(xì)胞后，細(xì)胞 用20ml PBS小心加入懸液中，并置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上5分鐘以分離碎片和細(xì)胞簇。脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn) 移到Ficoll-Paque PLUS填充的試管的上面，并根據(jù)用于淋巴細(xì)胞分離的廠商程序加工 (Amersham Biosciences)。RNA分離和cDNA合成在分離和沉淀淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞重懸于TRIzol LS Reagent(Invitrogen)中用于 根據(jù)所附廠商方案分離總RNA，并用1微克RNA、Superscript III RT組合的dT20根據(jù)廠 商程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Invitrogen)。cDNA 的 PCR 擴(kuò)增在PCR反應(yīng)中使用允許擴(kuò)增大約110種屬于15個(gè)VH家族的不同小鼠V基因的引 物組合(表 1 ；RefSeq NG_005838 ；Thiebe et al. , 1999. European Journal of Immunology 29 :2072-2081)擴(kuò)增cDNA。在第一輪中，使用結(jié)合V基因5，末端和J區(qū)3，末端的引物組 合。在第二輪中，用MJH-Rev2引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增以在3’區(qū)域引入修飾，以使得有 效克隆產(chǎn)物。在最后一輪擴(kuò)增中，所有PCR產(chǎn)物均使用在5’末端引入SfiI限制位點(diǎn)及在 3’末端引入BstEII限制位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增(見圖1和2，及表1)。第一輪PCR的反應(yīng)條件組合所有25個(gè)正向引物(MVH1至MVH25，表1和圖2)及 每個(gè)反應(yīng)1個(gè)反向引物(MJH-Revl，MJH-Reν2,MJH-Reν3或MJH_Rev4 ；見表1和圖2)的4個(gè) 不同反應(yīng)。50微升PCR體積由2微升cDNA (來自RT反應(yīng))、10微升5*Wiusion聚合酶HF緩 沖液、各40nM的25個(gè)正向引物(總濃度為1微摩爾)、1微摩爾反向引物、1微升IOmM dNTP 原液、1.25單位Wrnsion聚合酶及無菌MQ水組成。熱循環(huán)儀程序由降落(touch down)程 序組成1個(gè)循環(huán)的98 °C 30秒，30個(gè)循環(huán)的98 °C 10秒、58°C 10秒且每個(gè)循環(huán)降低0. 2°C、 72°C 20秒，及1個(gè)循環(huán)的72°C 3分鐘。第二輪PCR程序僅針對(duì)含有MJH-Rev2引物的第一 輪PCR的產(chǎn)物建立2個(gè)不同反應(yīng)，組合ExtMVH-I或者ExtMVH_2引物(表1和圖2)及反 向引物ExtMJH-Rev2int (表1和圖2)。50微升PCR體積由50ng PCR產(chǎn)物(來自第一輪 PCR)、10微升5*Wiusion聚合酶HF緩沖液、500nM每種正向引物、1微摩爾反向引物、1微升 IOmM dNTP原液、1. 25單位Wiusion聚合酶和無菌MQ水組成。熱循環(huán)儀程序由降落程序組 成，隨后是常規(guī)擴(kuò)增步驟1個(gè)循環(huán)的98°C30秒，10個(gè)循環(huán)的98°C 10秒、65°C 10秒且每個(gè)循環(huán)降低1. 5°C、72°C 20秒，10個(gè)循環(huán)的98°C 10秒、55°C 10秒、72°C 20秒及1個(gè)循環(huán)的 72 0C 3分鐘。第三輪PCR程序如圖2所述建立。50微升PCR體積由50ng PCR產(chǎn)物(來自 前面的各輪PCR)、10微升5*Wiusi0n聚合酶HF緩沖液、1微摩爾正向引物(表1和圖2)、 1微摩爾反向引物、1微升IOmMdNTP原液、1. 25單位Wiusion聚合酶和無菌MQ水組成。程 序由降落程序組成，隨后是常規(guī)擴(kuò)增步驟1個(gè)循環(huán)的98°C 30秒，10個(gè)循環(huán)的98°C 10秒、 650C 10秒且每個(gè)循環(huán)降低1. 5°C、72°C 20秒，10個(gè)循環(huán)的98°C 10秒、55°C 10秒、72°C 20 秒及1個(gè)循環(huán)的72°C3分鐘。PCR擴(kuò)增后，所有PCR產(chǎn)物用Qiaex II根據(jù)廠商方案凝膠純 化。限制酶消化純化產(chǎn)物在兩個(gè)步驟中用BstEII和SfiI消化。首先，1微克DNA在100微升反應(yīng) 中在爐中在60°C消化6小時(shí)，所述反應(yīng)由10微升10*服8緩沖液3(徹《 England Biolabs)、 1微升100*BSA、12. 5單位BstEII和無菌水組成。產(chǎn)物用來自Qiagen的Qiaquick PCR純 化試劑盒根據(jù)手冊(cè)指導(dǎo)純化，并洗脫在40微升水中。接下來，所有產(chǎn)物在100微升反應(yīng)中進(jìn) 一步用SfiI在爐中在50°C消化12小時(shí)，所述反應(yīng)由10微升10*NEB緩沖液2 (New England Biolabs)、1微升100*BSA、12. 5單位SfiI和無菌水組成。消化片段在20cm 1. 5%瓊脂糖 TBE加溴化乙錠凝膠上在80V凝膠分離，之后用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化。100微克 接納體載體(MV1043，圖3和1 在600微升中在標(biāo)準(zhǔn)條件下(Tango緩沖液)用50單位 Eco91I消化，接下來在0. 9%瓊脂糖凝膠上純化。在規(guī)定條件下在500微升中用400單位 SfiI消化12小時(shí)的第二個(gè)消化步驟后，加入100單位BsrGI，在50°C保持3小時(shí)。連接每個(gè)PCR產(chǎn)物根據(jù)下述方案分別連接70ng消化的PCR產(chǎn)物、300ng消化的接納體 載體、100單位T4連接酶(NEB)、1*連接酶緩沖液于30微升中在12°C保持16小時(shí)。連接 反應(yīng)用苯酚/氯仿/異戊醇提取純化，隨后根據(jù)廠商方案進(jìn)行糖原沉淀，最后溶解于25微 升無菌水中。轉(zhuǎn)化及文庫儲(chǔ)存純化的連接產(chǎn)物每個(gè)連接批次用1200微升TGl電感受態(tài)細(xì)菌 (Stratagene#200123)經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化，并在含有4%葡萄糖的LB羧芐青霉素鋪板。通過將細(xì) 菌刮下置于50ml LB羧芐青霉素中而收獲文庫。在2000g、4°C離心20分鐘后，細(xì)菌沉淀小 心重懸于在冰水上的2ml冰冷2*TY/30%甘油中，在干冰/乙醇上冷凍，之后儲(chǔ)存在_80°C。文庫擴(kuò)增根據(jù)Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11) :e59) 所述程序使用VCSM13 (Stratagene)作為輔助噬菌體株生長及收獲。在包被的免疫試管上選擇噬菌體破傷風(fēng)類毒素以2 μ g/ml濃度溶解于PBS中并在4°C包被MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474)過夜。棄去包被溶液后，試管用在PBS中的2%脫脂乳(ELK)(封閉緩 沖液)在室溫(RT)封閉1小時(shí)。平行地，0. 5ml噬菌體文庫與Iml封閉緩沖液混合，在室溫 保溫20分鐘。封閉噬菌體后，將噬菌體溶液加入破傷風(fēng)類毒素包被試管中并在緩慢旋轉(zhuǎn)臺(tái) 上于室溫保溫2小時(shí)以使之結(jié)合。接下來，試管用Iml 50mM甘油-HCl pH 2. 2在旋轉(zhuǎn)輪上 于室溫保溫10分鐘進(jìn)行噬菌體洗脫，直接隨后用0.5ml IM Tris-HCl pH7. 5中和收獲的洗脫液。收獲噬菌體克隆將5ml 0. D. 0. 4的XLl-Blue MRF(Mratagene)培養(yǎng)物加入到收獲的噬菌體溶液 中，不經(jīng)振蕩在37°C保溫30分鐘以使得噬菌體感染。細(xì)菌鋪板在羧芐青霉素/四環(huán)素4% 葡萄糖2*TY平板上，在37 °C生長過夜。噬菌體產(chǎn)生噬菌體如 Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11) e59)所述進(jìn)行生長及加工，使用VCSM13作為輔助噬菌體株。噬菌體ELISAELISA平板每孔用100微升濃度為2微克/ml于PBS中的破傷風(fēng)類毒素在4°C包被 過夜。用100微升濃度為2微克/ml于PBS中的甲狀腺球蛋白包被的平板用作陰性對(duì)照。 倒空各孔，在紙巾上輕敲而干燥，用PBS-4%脫脂乳(ELK)填滿，在室溫保溫1小時(shí)以封閉 孔。棄去封閉溶液后，加入與50 μ 1封閉溶液預(yù)混合的噬菌體微量制備物，在室溫保溫1小 時(shí)。接下來用PBS-0.05%Tween-20的5次洗滌步驟除去未結(jié)合噬菌體。通過將孔與100 微升抗-M13-HRP抗體綴合物(在封閉緩沖液中稀釋1/5000)在室溫保溫1小時(shí)而檢測(cè)結(jié) 合的噬菌體。通過重復(fù)上述洗滌步驟除去游離抗體，隨后進(jìn)行TMB底物保溫直至顯色可見。 通過每孔加入100微升2M H2SO4而終止反應(yīng)，在ELISA分析儀上在450nm發(fā)射波長進(jìn)行分 析(表幻。更高數(shù)字表示更強(qiáng)信號(hào)及因此更高的噬菌體-Fab復(fù)合物的特異性結(jié)合的發(fā)生 率。測(cè)序?qū)o出至少3倍高于背景信號(hào)的克隆(表2)進(jìn)行繁殖，用于DNA微量制備程序 (見Qiagen minift 印手冊(cè)程序)并進(jìn)行核苷酸序列分析。根據(jù)BigDye 1. 1試劑盒手冊(cè) (Applied Biosystems)使用識(shí)別人IgGl重鏈的CHl區(qū)域的5’序列(存在于Fab展示載體 MV1043中，圖3和12)的反向引物(CHl_Revl，表1)進(jìn)行測(cè)序。28個(gè)破傷風(fēng)類毒素結(jié)合克 隆的小鼠VH序列見表3。結(jié)果示出選擇的小鼠VH基因?qū)儆诓煌蚣易?，來自這些基因家 族的不同個(gè)體成員能與重排的人IGKV1-39/J VH區(qū)域配對(duì)以形成功能性破傷風(fēng)類毒素特異 的抗體結(jié)合位點(diǎn)。從這些序列分析，可以得出結(jié)論小鼠VH區(qū)域使用多樣性的DH和JH基因 區(qū)段。實(shí)施例3 小鼠κ輕鏈基因座的沉默本實(shí)施例描述小鼠內(nèi)源κ輕鏈基因座的沉默。所述內(nèi)源κ基因座通過在ES細(xì) 胞中同源重組修飾，隨后將遺傳修飾的ES細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚胎以獲得遺傳適應(yīng)的后代。含有組裝的核苷酸序列的載體用于在ES細(xì)胞中的同源重組，所述核苷酸由融合 于3’ CK增強(qiáng)子的3’末端的序列的包含J區(qū)至J5基因區(qū)段下游338bp的部分組成。組裝 的序列用于缺失從JK區(qū)的3’至3’ CK增強(qiáng)子的3’的基因組片段。這個(gè)程序的結(jié)果是，CK 恒定基因、3’增強(qiáng)子及一些基因間區(qū)域被除去(見圖4和18)。靶向載體的構(gòu)建一種載體用于在ES細(xì)胞系中的靶向同源重組，所述載體接受融合于所述缺失區(qū) 段的在3’和5’末端的4.5-81Λ側(cè)翼臂。兩個(gè)臂均得經(jīng)PCR手段獲得以保證最大同源性。 靶向策略使得產(chǎn)生組成型KO等位基因。涵蓋Igk內(nèi)含子增強(qiáng)子、Igk恒定區(qū)及Igk 3’增強(qiáng)子的小鼠基因組序列被PuroR盒置換，所述PuroR盒側(cè)翼為F3位點(diǎn)并且插入Jk元件下 游。選擇標(biāo)記的Flp介導(dǎo)的除去導(dǎo)致組成型KO等位基因。Igk MiEk-Igk C-Igk 3' E基 因組區(qū)域(大約101Λ)由F3-PUro盒(大約31Λ)置換可能降低同源重組的效率。因此，同 源臂由此延長并且在轉(zhuǎn)染后分析更多的ES細(xì)胞集落以鑒別同源重組克隆。攜帶缺失的κ片段的ES細(xì)胞的產(chǎn)生遺傳修飾的ES細(xì)胞的產(chǎn)生基本上如所述進(jìn)行(Seibler et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15 ；31 (4) :el2)。也參見實(shí)施例14的詳細(xì)描述。經(jīng)四倍體胚胎互補(bǔ)作用產(chǎn)生ES小鼠使用遺傳修飾的ES細(xì)胞經(jīng)四倍體胚胎互補(bǔ)作用產(chǎn)生小鼠基本上如所述進(jìn)行 (Eggan et al. ,PNAS 98,6209-6214 ；Seibler J，et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15; 31(4) :el2 ；Hogan et al. , (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp.邪3-沘9·))。實(shí)施例4 小鼠λ輕鏈基因座的沉默本實(shí)施例描述小鼠內(nèi)源λ輕鏈基因座的沉默。所述內(nèi)源λ基因座通過在ES細(xì) 胞中同源重組修飾，隨后將遺傳修飾的ES細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚胎以獲得遺傳適應(yīng)的后代。在一起含有所有功能性λ V區(qū)域的小鼠λ基因座的兩個(gè)區(qū)域用于進(jìn)行缺失。被靶向用于基于同源重組的缺失的第一個(gè)區(qū)域是位于IGLV2基于區(qū)段的起始位 點(diǎn)上游408bp并結(jié)束于IGLV3基因區(qū)段下游215bp的一個(gè)區(qū)域，包括這些IGLV基因區(qū)段之 間的基因間序列段。進(jìn)行缺失的第二個(gè)區(qū)域是從IGLVl基因區(qū)段的上游392bp至下游171bp 的片段。這兩個(gè)缺失步驟的結(jié)果是，所有功能性V-λ基因區(qū)段均被缺失，導(dǎo)致所述基因座 功能失活(圖5和圖19)。靶向載體的構(gòu)建接受融合于所述缺失區(qū)段的在3’和5’末端的3-9. 6kb側(cè)翼臂的載體用于在ES 細(xì)胞系中的靶向同源重組。兩個(gè)臂均得經(jīng)PCR手段獲得以保證最大同源性。在第一個(gè)步驟 中，涵蓋IglV2-V3區(qū)的小鼠基因組序列被側(cè)翼為F3位點(diǎn)的PuroR盒置換，其在選擇標(biāo)記的 Flp介導(dǎo)的除去后產(chǎn)生組成型KO等位基因(見圖19A)。在第二個(gè)步驟中，涵蓋Igl Vl區(qū) 的小鼠基因組序列被已攜帶Igl V2-V3區(qū)缺失的ES細(xì)胞克隆中的Neo盒置換(見圖19B)。 選擇標(biāo)記(NeoR)側(cè)翼為FRT位點(diǎn)。在Flp介導(dǎo)的選擇標(biāo)記除去后獲得組成型KO等位基因。攜帶缺失的λ片段的ES細(xì)胞的產(chǎn)生遺傳修飾的ES細(xì)胞的產(chǎn)生基本上如所述進(jìn)行(Seibler J, Zevnik B,Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek Τ, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kiihn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15 ；31 (4) el2)。也參見實(shí)施例14的詳細(xì)描述。為了表明兩個(gè)靶向事件發(fā)生在同一染色體上，選擇一 些雙靶向克隆用于用PCMV C31deltaCpG進(jìn)行體外缺失?？寺≡诳股貕毫ο略谟薪z分裂失 活的飼養(yǎng)層上擴(kuò)增，所述飼養(yǎng)層由在DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基中的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞組成， 所述培養(yǎng)基含有20% FCS(PAN)和1200u/mL白血病抑制因子(Millipore ESG 1107)。來 自每個(gè)克隆的IxlO7個(gè)細(xì)胞用20μ g環(huán)狀pCMVC31deltaCpG在240V和500 μ F電穿孔，并 每個(gè)鋪板在4個(gè)IOcm培養(yǎng)皿上。電穿孔2-3天后收獲細(xì)胞并經(jīng)PCR分析。所用引物是
2005_5 CCCTTTCCAATCTTTATGGG2005_7 :AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC2005_9 GTCATGTCGGCGACCCTACGCCPCR 反應(yīng)在包含 5μ 1 PCR 緩沖液 IOx (Invitrogen)、2 μ 1 MgCl2 (50mM), 1 μ 1 dNTP(10mM)、ly 1 第一弓I 物(5μΜ)、1μ 1 第二弓I 物(5μΜ)、0·4μ 1 Taq(5U/ul, Invitrogen)、37. 6μ 1 H2O和2 μ 1 DNA的混合物中進(jìn)行。所用程序是95°C 5'；隨后；35個(gè) 循環(huán)的 95°C30〃 ；60°C 30" ；72°C 1'；隨后 72°C10'。經(jīng)四倍體胚胎互補(bǔ)作用產(chǎn)生ES小鼠使用遺傳修飾的ES細(xì)胞經(jīng)四倍體胚胎互補(bǔ)作用產(chǎn)生小鼠基本上如所述進(jìn)行 (Eggan et al. ,PNAS 98,6209-6214 ；Seibler J,Zevnik B,Kuter-Luks B,Andreas S,Kern H, Hennek Τ, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor Μ, Jaenisch R, Rajewsky K,Kuhn R,Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15 ；31 (4) :el2 ；Hogan et al.，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp.253-289)。實(shí)施例5 :基于重排的人種系IGKVl-39/J-Ck基因的CAGGS表達(dá)插入序列 (IGKVl-39/J-Ck)的構(gòu)建本實(shí)施例描述摻入重排的人種系IGKV1-39/J區(qū)域的CAGGS表達(dá)盒的構(gòu)建。這個(gè) 插入表達(dá)盒包含克隆位點(diǎn)、Kozak序列、含有內(nèi)含子的前導(dǎo)序列、重排的IGKV1-39區(qū)域的開 放讀框、來自等位基因a的大鼠CK恒定區(qū)及翻譯終止序列(IGKVl-39/J-Ck ；圖6)。所述初 級(jí)構(gòu)建體由天然發(fā)生序列組成并且已被分析及通過除去不希望的順式作用元件而優(yōu)化，所 述元件例如內(nèi)部TATA盒、聚腺苷酸化信號(hào)、chi位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、富AT或富GC序列 段、ARE-、INS-及CRS序列元件、重復(fù)序列、RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、(隱蔽的)剪接供體和接納體位 點(diǎn)和剪接分支點(diǎn)(GeneArt GmbH)。另外，在開放讀框區(qū)域中的密碼子使用被優(yōu)化以用于在 小鼠中表達(dá)。內(nèi)含子序列未改變，因此代表與人IGKV1-39前導(dǎo)內(nèi)含子的編碼部分相同的序 列。在表達(dá)盒的5’末端，導(dǎo)入一個(gè)NotI位點(diǎn)，在3’位點(diǎn)導(dǎo)入一個(gè)NheI位點(diǎn)。兩個(gè)位 點(diǎn)均用于克隆到CAGGS表達(dá)模塊中。在根據(jù)GeneArt使用的方法進(jìn)行基因組裝后，插入序 列用NotI-NheI消化并克隆進(jìn)表達(dá)模塊中，所述表達(dá)模塊含有CAGGS啟動(dòng)子、側(cè)翼為LoxP 位點(diǎn)的終止子序列(‘floxed')、聚腺苷酸化信號(hào)序列以及在5’和3’末端的促進(jìn)同源重 組進(jìn)小鼠ES細(xì)胞系的Rosd6基因座中的序列。啟動(dòng)子和/或cDNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè) 序證實(shí)和/或從輸送質(zhì)粒直接克隆進(jìn)攜帶指示的特征的RMCE交換載體中。最終靶向載體 pCAGGS-IgVKl-39的示意圖和證實(shí)的序列在圖13A和1 中示出。靶向策略示于圖13C。實(shí)施例6 基于重排的人種系IGLV2-14/JV λ區(qū)域的CAGGS表達(dá)插入序列 (IGLV2-14/J-Ck)本實(shí)施例描述摻入重排的人種系IGLV2_14/JVX區(qū)域的表達(dá)盒的序列和插入。這 個(gè)插入序列包含克隆位點(diǎn)、Kozak序列、含有內(nèi)含子的前導(dǎo)序列、重排的IGLV2-14/J區(qū)域的 開放讀框、來自等位基因a的大鼠CK恒定區(qū)及翻譯終止序列(IGLV2-14/J-Ck ；圖7)。所述 初級(jí)構(gòu)建體由天然發(fā)生序列組成并且已被分析及通過除去不希望的順式作用元件而優(yōu)化， 所述元件例如內(nèi)部TATA盒、聚腺苷酸化信號(hào)、chi位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、富AT或富GC序 列段、ARE-、INS-及CRS序列元件、重復(fù)序列、RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、(隱蔽的)剪接供體和接納體
23位點(diǎn)和剪接分支點(diǎn)(GeneArt GmbH)。另外，在開放讀框區(qū)域中的密碼子使用被優(yōu)化以用于 在小鼠中表達(dá)。內(nèi)含子序列未改變，因此代表與人IGKV1-39前導(dǎo)內(nèi)含子相同的序列。在表達(dá)盒的5’末端，導(dǎo)入一個(gè)NotI位點(diǎn)，在3’位點(diǎn)導(dǎo)入一個(gè)NheI位點(diǎn)。兩個(gè)位 點(diǎn)均用于克隆到CAGGS表達(dá)模塊中，如TaconicArtemis所述。在根據(jù)GeneArt使用的方 法進(jìn)行基因組裝后，插入序列用NotI-NheI消化并克隆進(jìn)表達(dá)模塊中，所述表達(dá)模塊含有 CAGGS啟動(dòng)子、側(cè)翼為LoxP位點(diǎn)的終止子序列(‘floxed')、聚腺苷酸化信號(hào)序列以及在 5’和3’末端的促進(jìn)同源重組進(jìn)小鼠ES細(xì)胞系的Rosd6基因座中的序列。為構(gòu)建最終的 R0SA26RMCE靶向載體，啟動(dòng)子和/或cDNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證實(shí)和/或從 輸送質(zhì)粒直接克隆進(jìn)攜帶指示的特征的RMCE交換載體中。最終靶向載體pCAGGS-IgVL2-14 的示意圖和證實(shí)的序列在圖15A和15B中示出。靶向策略示于圖15C。實(shí)施例7 :IGKVl-39/J-Ck 在 HEK293 細(xì)胞系中的表達(dá)(pSELECT-IGKVl-39/J-Ck)本實(shí)施例描述了一種方法，以驗(yàn)證實(shí)施例5中描述的IGKVl-39/J-Ck構(gòu)建體使 得IGKV1-39/J-Ck L鏈在HEK293細(xì)胞中表達(dá)和缺失。IGKV1-39/J插入序列(圖6)在 5’末端通過將NotI位點(diǎn)改變?yōu)镸il位點(diǎn)而修飾。這一改變是將產(chǎn)物克隆進(jìn)表達(dá)盒質(zhì)粒 pSELECT-hygro (InvivoGen)所需的。CAGGS 表達(dá)插入序列 IGKVl-39/J-Ck 和 pSELECT-hygro 用MlI和NheI消化，連接并用于使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)XLl-Blue細(xì)胞。挑取菌落，用 Qiagen Midi-pr印柱根據(jù)廠商程序純化DNA。命名為0817676_pSELECT_08M^6的所得輕 鏈(LC)表達(dá)載體用于使用Fugenee (Roche)根據(jù)廠商方案轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。使用抗大鼠 Ck 抗體(Beckton Dickinson#550336 和 553871)的 ELISA 和 western 印跡和現(xiàn)有技術(shù)中使 用的方案篩選上清中IGKVl-39/J-Ck輕鏈的存在。抗破傷風(fēng)類毒素(TT) IgG MG1494的VH用限制位點(diǎn)SfiI和BstEII克隆進(jìn)IgG表 達(dá)載體MV1056中。所得克隆經(jīng)序列驗(yàn)證。HEK293T細(xì)胞用表4所示的5種不同載體組合轉(zhuǎn) 染(載體0817678_pSELECT_081M27的詳情參見實(shí)施例8)。收獲上清并確定IgG濃度(見 表4)。如所預(yù)期的，僅含有輕鏈的上清A和B不能檢測(cè)到IgG(檢測(cè)抗體識(shí)別IgG的Fc部 分)。上清C和D中的IgG濃度與陽性對(duì)照上清E的相當(dāng)，表示輕鏈構(gòu)建體的正確表達(dá)。經(jīng)ELISA分析與TT的結(jié)合以檢查產(chǎn)生的抗體的功能性，使用血紅蛋白作為陰性對(duì) 照抗原。如所預(yù)期的，僅含輕鏈的上清A和B未能檢測(cè)到TT特異性結(jié)合。上清C和D的TT 特異性結(jié)合至少與陽性對(duì)照上清E —樣好，證實(shí)輕鏈構(gòu)建體的正確表達(dá)和與重鏈的功能組 裝。抗體不僅用抗人IgG 二抗檢測(cè)到，而且用抗大鼠Ck輕鏈二抗檢測(cè)到。結(jié)果證實(shí)抗大 鼠 Ck 抗體(BD Pharmingen#553871, clone MRK-1)識(shí)別由 pSELECT 載體表達(dá)的輕鏈。上清經(jīng)非還原SDS-PAGE和Wfestern印跡(未示出)分析。使用抗人IgG重鏈抗 體的檢測(cè)未顯示針對(duì)僅含輕鏈的上清A和B的條帶，如所預(yù)期的那樣。上清C和D的結(jié)果 與陽性對(duì)照上清E相當(dāng)，如針對(duì)完整IgG預(yù)期的，具有接近170kD的條帶。上清C、D和E也 觀測(cè)到額外的較低分子量條帶，它們可能代表降解產(chǎn)物，得自(部分)還原的IgG片段和/ 或由于檢測(cè)抗體的非特異性結(jié)合所致無關(guān)蛋白質(zhì)條帶。使用抗大鼠C κ輕鏈抗體的檢測(cè)顯示上清A和B中接近^kD標(biāo)記物的條帶，如預(yù) 期僅輕鏈。這個(gè)條帶在A中相對(duì)于B中強(qiáng)度大得多，表明游離IGKV1-39輕鏈可能比游離 IGLV2-14輕鏈更好表達(dá)和/或更穩(wěn)定。如預(yù)期對(duì)照上清E為檢測(cè)到條帶，因?yàn)楸磉_(dá)的IgG 含有人Ck輕鏈。對(duì)于上清C和D，觀測(cè)到接近170kD的預(yù)期條帶；較低分子量條帶也被觀測(cè)到，但是程度比上述使用抗人IgG抗體低。結(jié)論是，輕鏈表達(dá)構(gòu)建體與抗破傷風(fēng)類毒素(TT) IgG MG1494的重鏈組合的轉(zhuǎn)染導(dǎo) 致與對(duì)于pSELECTK和λ輕鏈構(gòu)建體的陽性對(duì)照構(gòu)建體相當(dāng)?shù)腎gG產(chǎn)生。兩者IgG產(chǎn)生 在TT ELISA中均產(chǎn)生比對(duì)照IgG好或者與其相當(dāng)?shù)腅LISA信號(hào)。SDS-PAGE和Western印 跡分析證實(shí)完整IgG的存在。測(cè)試的抗大鼠C κ抗體在ELISA和Wfestern印跡中均有效工 作。來自用僅輕鏈構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)上清不導(dǎo)致可檢測(cè)的IgG產(chǎn)生，也不導(dǎo)致可檢 測(cè)的TT特異性結(jié)合，而在Western印跡上檢測(cè)到游離輕鏈。實(shí)施例8 :IGLV2-14/J-Ck 在 HEK293 細(xì)胞系中的表達(dá)(pSELECT-IGLV2_14/J-Ck)本實(shí)施例描述了一種方法，以驗(yàn)證實(shí)施例6中描述的IGLV2-14/J構(gòu)建體使得 IGLV2-14/J-Ck L鏈在HEK293細(xì)胞中表達(dá)和缺失。IGLV2_14/J_Ck插入序列(圖7)在 5’末端通過將NotI位點(diǎn)改變?yōu)镸il位點(diǎn)而修飾。這一改變是將產(chǎn)物克隆進(jìn)表達(dá)盒質(zhì)粒 pSELECT-hygro (InvivoGen)所需的。CAGGS 表達(dá)插入序列 IGLV2_14/J_Ck 和 pSELECT-hygro 用MlI和NheI消化，連接并用于使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)XLl-Blue細(xì)胞。挑取菌落，用 Qiagen Midi-pr印柱根據(jù)廠商程序純化DNA。命名為0817678_pSELECT_081M27的所得輕 鏈(LC)表達(dá)載體用于使用Fugenee (Roche)根據(jù)廠商方案轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。經(jīng)使用抗大 鼠 Ck 抗體(Beckton Dickinson#550336 和 553871)的 ELISA 和 western 印跡和現(xiàn)有技術(shù) 中使用的方案篩選上清中IGLV2-14/J-Ck輕鏈的存在。細(xì)節(jié)及結(jié)果見實(shí)施例7實(shí)施例9 構(gòu)建含有IGKV1-39/J插入序列及多個(gè)衍生自小鼠CK基因座的增強(qiáng)子 元件的VK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)構(gòu)建體(VkP-IGKVl-39/J-Ck ；VkP-012)本實(shí)施例描述一種表達(dá)盒的構(gòu)建，其含有相關(guān)元件以使得重排的人IGKV1-39 VK 區(qū)域的B細(xì)胞和發(fā)育/分化階段特異性表達(dá)，所述重排的人IGKV1-39 VK區(qū)域基于IGKV1-39 VK啟動(dòng)子區(qū)、含有內(nèi)含子的前導(dǎo)序列、種系V基因、CDR3、IGKJ區(qū)段、位于Jk和CK之間的 小鼠基因間區(qū)域、大鼠Ck等位基因a開放讀框和從小鼠CK基因的3'末端開始并結(jié)束于 3' CK增強(qiáng)子的正好3'的小鼠基因間片段。如實(shí)施例5所述的前導(dǎo)序列、IGKV1-39重排基因及大鼠CK等位基因a基因的優(yōu) 化開放讀框用于構(gòu)建所述表達(dá)盒。VK啟動(dòng)子區(qū)通過基因合成程序(GeneArt，GmbH)獲得并 且?guī)缀跖c基因的_500bp和ATG (起始位點(diǎn))之間的人IGKV1-39序列相同。與天然序列的 唯一差異是在ATG(起始)位點(diǎn)導(dǎo)入GCCACCATGG Kozak序列以促進(jìn)翻譯。來自小鼠BAC克 隆的基因組片段(TaconicArtemis)用作導(dǎo)入各個(gè)元件的基礎(chǔ)。這個(gè)片段與起自直接位于 JK5區(qū)域3'的內(nèi)含子供體位點(diǎn)及結(jié)束于3' CK增強(qiáng)子的正好3'的小鼠VK基因座的序列 相同，并且覆蓋大約12. 51Λ。最終構(gòu)建體從5'至3'末端含有下述元件人基因組IGKV1-39啟動(dòng)子(500bp)、 Kozak序列、人IGKV1-39前導(dǎo)序列部分1 (優(yōu)化的)、人IGKV1-39前導(dǎo)序列內(nèi)含子、人 IGKV1-39前導(dǎo)序列部分2(優(yōu)化的)、人IGKV1-39種系基因(優(yōu)化的)、人J區(qū)域(優(yōu)化 的)、包括內(nèi)含子增強(qiáng)子元件的小鼠基因間區(qū)域、大鼠(Rattus norvegicus) κ恒定區(qū)(優(yōu) 化的)及包括3' κ增強(qiáng)子的小鼠基因間區(qū)域。這個(gè)表達(dá)盒的元件示于圖8并且命名為 VkP-IGKVl-39/J-Ck (VkP-012)。pVkP-012載體及靶向策略的概括圖見圖20A和21A。載體 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)隕S細(xì)胞(見實(shí)施例14)。實(shí)施例10 含有IGLV2-14/J克隆及多個(gè)CK基因座衍生的增強(qiáng)子元件的VK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)構(gòu)建體(VkP-IGLVL2-14/J-Ck ；VkP_2a2)的構(gòu)建本實(shí)施例描述與實(shí)施例9所述相同的構(gòu)建體，不同之處是IGKV1-39基因和J區(qū)由 包括獨(dú)特V-J區(qū)的優(yōu)化的人IGLV2-14種系基因置換(VkP-IGLV2-14/J-Ck ；VkP-2a2 ；圖9)。實(shí)施例11 構(gòu)建含有缺少CK內(nèi)含子增強(qiáng)子元件的IGKV1-39克隆的VK啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)表達(dá)構(gòu)建體(VkP-IGKVl-39/J-Ck-A 1 ；VkP-012-dell)實(shí)施例9所述構(gòu)建體通過標(biāo)準(zhǔn)PCR修飾及DNA克隆方法學(xué)(GeneArt，GmBH)除去 位于人J區(qū)和大鼠CK區(qū)之間的基因間區(qū)域中的CK內(nèi)含子增強(qiáng)子元件而修飾。所得表達(dá)盒 示于圖 10 并且命名為 VkP-IGKVl-39/J-Ck-A 1 (VkP-012-dell)。pVkP-012-dell載體及靶向策略的概括圖見圖20B和21B。載體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?ES細(xì)胞(見實(shí)施例14)。實(shí)施例12 構(gòu)建含有缺少CK內(nèi)含子增強(qiáng)子元件的IGKV1-39克隆及截短的3' CK 增強(qiáng)子元件的VK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)構(gòu)建體(VkP-IGKVl-39/J-Ck-A 2 ；VkP-012_del2)實(shí)施例11所述構(gòu)建體通過截短3' CK增強(qiáng)子元件及缺失大鼠Ck基因3'的基因 間區(qū)域的部分以除去潛在抑制元件而修飾。這通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法除去EcoRV位點(diǎn)(位于大 鼠Ck基因的3')和3'增強(qiáng)子中存在的NcoI位點(diǎn)之間的基因間序列(5993bp)并進(jìn)一步 除去3'增強(qiáng)子BstXI位點(diǎn)和3'增強(qiáng)子的3'的BstXI位點(diǎn)之間的序列(474bp)而實(shí)現(xiàn)。 所得表達(dá)盒示于圖11并且命名為VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2(VkP-012-del2)。PVkP-012-del2載體及靶向策略的概括圖見圖20C和21C。載體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?ES細(xì)胞(見實(shí)施例14)。實(shí)施例13 =Vk構(gòu)建體在細(xì)胞系中的表達(dá)測(cè)試實(shí)施例9-12所述構(gòu)建體在骨髓瘤細(xì)胞系MPCll (ATCC CCL167)、B細(xì)胞淋巴瘤 WEHI23KATCC CRL-1702)、T 細(xì)胞淋巴瘤 EL4 (ATCCTIB-39)和 ΗΕΚ293 (ATCC CRL1573)中產(chǎn) 生輕鏈蛋白的能力。構(gòu)建體中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件使得在B細(xì)胞系中表達(dá)，但是在衍生 自其它組織的細(xì)胞系中不表達(dá)。在用純化的線性化DNA和Fugenee (Roche)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后， 培養(yǎng)細(xì)胞用于瞬時(shí)表達(dá)。收獲細(xì)胞和上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析，隨后用特異性抗大鼠C-K 抗體western印跡。用抗大鼠CK抗體(Beckton Dickinson#550336)在ELISA中分析上清 中分泌的L鏈。實(shí)施例14 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系實(shí)施例3、4、5、6、9、10、11和12所述的所有構(gòu)建體用于通過同源重組方式產(chǎn)生各 個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系。經(jīng)同源重組產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域已知的(例 如 Eggan et al. ，PNAS 98,6209-6214 ；Seibler J, Zevnik B, Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek Τ, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor Μ, Jaenisch R, Rajewsky K, Kiihn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15 ；31 (4) :el2 ；Hogan et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor NY.), pp.253-289.)。對(duì)于實(shí)施例5-6和實(shí)施例9-12中描述的所有構(gòu)建體，RMCE ES細(xì)胞系(衍生自小 鼠株系129S6B6F1-Gt (ROSA) 26SortmlOArte)在有絲分裂失活的飼養(yǎng)層上生長，所述飼養(yǎng) 層由在DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基中的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)組成，所述培養(yǎng)基含有15% FBS (PAN 1302-P220821)。白血病抑制因子(Chemicon ESG 1107)以 900U/mL 的濃度加入到 所述培養(yǎng)基中。為了操作，將2xl05ES細(xì)胞在2ml培養(yǎng)基中鋪板在3. 5cm培養(yǎng)皿上。在即將轉(zhuǎn)染前，將2ml新鮮培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中。將3ul Fugene6 Reagent (Roche ；Catalog No. 1 814 443) % IOOul ^C^iyf(OptiMEM I with Glutamax I ；Invitrogen ；Catalog
No. 51985-035)混合并保溫5分鐘。將100ulFugene/0ptiMEM溶液加入到2ug環(huán)狀載體 和2ug CAGGS-Flp中并保溫20分鐘。這個(gè)轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到細(xì)胞并混合。第二天將新 鮮培養(yǎng)基加入到細(xì)胞。從第2天開始，每天將培養(yǎng)基用含有250ug/mL G418 (Geneticin ； Invitrogen ；Catalog No. 10131-019)的培養(yǎng)基置換。轉(zhuǎn)染后7天，分離單個(gè)克隆，擴(kuò)增，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)Southern印跡進(jìn)行分子學(xué)分析。對(duì)于每種構(gòu)建體，對(duì)單個(gè)克隆的基因組DNA限制酶消化，隨后與5'探針、3'探針 和內(nèi)部探針雜交，這樣進(jìn)行的多個(gè)克隆的分析產(chǎn)生在Rosa26基因座的正確位置包含正確 的單個(gè)插入的克隆。一個(gè)例子在圖14中提供。實(shí)施例15 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠株系如實(shí)施例14所述產(chǎn)生及證實(shí)其修飾的所有ES細(xì)胞系用于通過四倍體重組產(chǎn)生穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)基因小鼠。所述方法為本領(lǐng)域已知。通常地，在給予激素之后，使排卵過度的Balb/c 雌鼠與Balb/c雄鼠交配。在dpc 3. 5從子宮中分離胚泡。對(duì)于顯微注射，將胚泡置于一滴 在礦物油下的具有15% FCS的DMEM中。使用內(nèi)徑為12-15 μ m的平頭電極壓電驅(qū)動(dòng)的顯微 注射移液管將10-15個(gè)靶向的C57BL/6N. tac ES細(xì)胞注射進(jìn)每個(gè)胚泡中。在恢復(fù)后，將注 射的胚泡轉(zhuǎn)移至性交后2. 5天假孕的NMRI雌鼠的每個(gè)子宮角。在嵌合體(GO)中通過提供 ES細(xì)胞的Balb/c宿主的毛色(黑色/白色)測(cè)量嵌合現(xiàn)象。使高度嵌合的小鼠與C57BL/6 株系雌鼠繁殖。根據(jù)方案要求，C57BL/6交配配偶是非突變體(W)或者存在重組酶基因的 突變體(Flp-缺失或者Cre-缺失或者CreER可誘導(dǎo)的缺失或者Flp-缺失/CreER組合)。 通過黑色C57BL/6株系后代(Gl)的存在鑒別種系傳遞。例如，將ESC克隆IgVKl-39 2683 8 (見實(shí)施例5和14)在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中注射進(jìn) 共62個(gè)胚泡中。獲得3窩共6只幼仔。所有幼仔均是嵌合型的。獲得3只雜合后代幼仔， 用于進(jìn)一步雜交。將ESC克隆κ 2692A-C10 (見實(shí)施例3和14)在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中注射進(jìn)共54個(gè)胚 泡中。獲得3窩共11只幼仔，其中10只是嵌合型的。獲得8只雜合后代幼仔，用于進(jìn)一步 雜交。將ESC克隆κ 2692 B-Cl (見實(shí)施例3和14)在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中注射進(jìn)共51個(gè)胚
泡中。獲得2窩共6只幼仔，其中4只是嵌合型的。獲得3只雜合后代幼仔，用于進(jìn)一步雜 、-父。實(shí)施例16 繁殖這個(gè)實(shí)施例描述了獲得含有如實(shí)施例14所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的小鼠以及其中內(nèi)源 λ和κ基因座已經(jīng)沉默的敲除小鼠的繁殖方法。V-λ位于染色體16及⑶19位于染色體 7上使得可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)繁殖程序。Vk基因座與Rosa26基因座以大約24cM的距離共同位于 染色體6上的小鼠的繁殖在篩選期間需要特別留心，因?yàn)閮H一部分后代示出以兩個(gè)修飾處 于一個(gè)染色體上的方式雜交。所有四個(gè)基因座組合在一個(gè)小鼠株系中，其對(duì)于CD19_Cre (未描述)和修飾的 Rosa26轉(zhuǎn)基因是純合或者雜合的，對(duì)于其它基因座是純合的。通過合適的及由商業(yè)繁殖公 司(例如TaconicArtemis)提議的標(biāo)準(zhǔn)繁殖和篩選技術(shù)進(jìn)行繁殖。
實(shí)施例17:免疫小鼠使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行初始免疫和強(qiáng)化免疫。為了證實(shí)人重排的Vk 012(IGKVl-39)_大鼠Ck輕鏈(見實(shí)施例5、14_16)在來自 CD19-HuVK 1小鼠的B細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，以及為了評(píng)估在免疫后其對(duì)于VH儲(chǔ)備庫大小、 VH家族使用(family usage)的多樣性以及V (D) J重組的影響，用破傷風(fēng)類毒素疫苗(TT疫 苗)免疫⑶19-HuVk 1轉(zhuǎn)基因小鼠，將⑶19-HuVk 1小鼠的隨機(jī)挑選的克隆的VH序列多樣 性與TT免疫的野生型小鼠和⑶19-Cre HuVkl陰性同窩出生幼仔進(jìn)行對(duì)比。獲得關(guān)于在免 疫的小鼠中人V κ 012轉(zhuǎn)基因的SHM頻率的數(shù)據(jù)。通過噬菌體展示技術(shù)從⑶19-HuVK 1小 鼠中回收至少40個(gè)TT特異性的克隆不相關(guān)的含有人V κ 012的mAb的一個(gè)多樣集合。為此，使用標(biāo)準(zhǔn)免疫程序?qū)⑷怀墒斓蘑?9-HuV κ 1小鼠用TT疫苗免疫。在免疫 后，使用 TT 特異性 ELISA 測(cè)量血清效價(jià)(TT =Statens Serum Institute, Art. no. 2674)，在 用大鼠C κ -特異性單克隆抗體染色后通過FACS方法對(duì)脾懸浮液進(jìn)行細(xì)胞分選，以分離轉(zhuǎn) 基因 B 細(xì)胞(克隆 RG7/9. 1 ；BD Pharmingen#553901, Lot#06548)。從大鼠 Ck -陽性 B 細(xì) 胞中提取RNA，并將所得cDNA材料用于文庫構(gòu)建和SHM分析。將標(biāo)準(zhǔn)的單克隆小鼠抗大鼠Ck抗體(克隆RG7/9. 1 ；BD Pharmingen#553901, Lot#06548)用于轉(zhuǎn)基因表達(dá) B 細(xì)胞的 FACS 分析中(Meyer et al.，1996，Int. Immunol.，8 1561)?？寺G7/9. 1抗體與單型(常見的)κ鏈決定簇反應(yīng)。這種抗大鼠Ck抗體(克 隆 RG7/9. 1 (BD Pharmingen#553901, Lot#06548)用 R-藻紅蛋白(PE)標(biāo)記，使用 LYNX 快 速綴合試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行標(biāo)記，用以進(jìn)行FACS分析和分選。首先通過流式細(xì)胞計(jì)量 術(shù)檢測(cè)標(biāo)記的抗體與在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞中產(chǎn)生的含有功能性輕鏈蛋白質(zhì)的大鼠 Ck的結(jié)合；未綴合的抗體作為陽性對(duì)照。通過ELISA和Western-印跡示出結(jié)合大鼠Ck 的兩個(gè)其它抗體(見實(shí)施例7)也通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)。使用一組設(shè)計(jì)為擴(kuò)增C57BL/6VH基因的優(yōu)化簡并PCR引物進(jìn)行Fab-噬菌體展示 文庫構(gòu)建；最小的文庫大小為IO6個(gè)克隆，最小的插入頻率為80%。使用的載體MV1043(圖 3和12)含有與人Ck區(qū)融合的人VK012。在文庫產(chǎn)生過程中，大鼠C κ因此被置換為人 相應(yīng)物。在選擇之前，對(duì)96個(gè)隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行VH測(cè)序，與得自使用相同方法從用TT 免疫的BALB/c小鼠中事先產(chǎn)生的未選擇的文庫的多樣性對(duì)比證實(shí)VH儲(chǔ)備庫多樣性。得自 以相同方式免疫的C57B1/6野生型小鼠的文庫可以在共用相同疫苗和相同遺傳背景的兩 個(gè)預(yù)先選擇的文庫之間進(jìn)行多樣性對(duì)比。對(duì)在免疫試管中包被的TT進(jìn)行一些獨(dú)立的選擇?？砂淖兞渴鞘褂蒙锼仵?化的抗原在溶液中選擇或者在捕獲的TT上選擇?；谠诘谝淮芜x擇中獲得的ELISA陽性 克隆的數(shù)目和多樣性，決定另外的選擇次數(shù)。當(dāng)陽性數(shù)相對(duì)于陰性對(duì)照克隆超過3倍(> 3x)時(shí)，認(rèn)為克隆是陽性的。通過ELISA針對(duì)一組陰性對(duì)照抗原分析陽性克隆，以證實(shí)抗原 特異性。目的是基于獨(dú)特的CDR3序列和VhDJh重排，鑒別至少40個(gè)獨(dú)特的VH區(qū)。使用特異于人前導(dǎo)序列的PCR正向引物和特異于大鼠CK序列的PCR反向引 物，對(duì)來自大鼠Ck -陽性分選的B細(xì)胞的cDNA材料在非富集小鼠CK序列的區(qū)域中進(jìn) 行擴(kuò)增，如在最近的研究中報(bào)道(Brady et al. ,2006, JIM，315:61)。首先對(duì)用0817676_ pSELECT_0815426 = pSELECT 載體與 IGKV1-39DNA 表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的 HEK-293T 細(xì)胞的 cDNA 檢測(cè)引物組合及退火溫度(見實(shí)施例7)。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆在pJET-1載體中，在XLl-blue轉(zhuǎn)化后，對(duì)96個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序以 通過與Vk012(IGKV1-39)種系序列直接對(duì)比評(píng)估VL SHM頻率。如在我們的研究中針對(duì)人 TT 特異性抗體的描述(de Kruif et al.，2009，J. Mol. Biol.，387 :548)，R/S 比率方法可以 區(qū)分在VL序列上發(fā)生的隨機(jī)突變與抗原驅(qū)動(dòng)的突變。實(shí)施例18 轉(zhuǎn)基因小鼠株系中B細(xì)胞群的免疫熒光分析這個(gè)實(shí)施例描述了抗體和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)在初級(jí)(骨髓)和二級(jí)(脾、腹膜) 淋巴器官和血液中分析B細(xì)胞群的應(yīng)用。所用方法和試劑在Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168 :2695和Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172 1371 中描述。為了分析 骨髓中早期8細(xì)胞發(fā)育，將細(xì)胞表面用特異于8220丄019丄025、化11、化0、小鼠(^、小鼠C λ 和大鼠Ck的抗體(Becton Dickinson)組合染色，以檢測(cè)在其表面表達(dá)轉(zhuǎn)基因的原-B細(xì)胞 (pro-B)、前B細(xì)胞、大型前B細(xì)胞、早期和晚期幼稚B細(xì)胞以及再循環(huán)B細(xì)胞群。包括DAPI 染色(Invitrogen)以從分析中排除死亡的細(xì)胞，以及包括FC封閉(Becton Dickinson)以 抑制抗體與骨髓細(xì)胞上Fc受體相互作用。為了分析外周淋巴器官和血液中B細(xì)胞群上表 面轉(zhuǎn)基因表達(dá)，將細(xì)胞用特異于B220、⑶5、⑶19、⑶21、⑶23、IgM, IgD、小鼠Ck、小鼠CX 和大鼠Ck的抗體(Becton Dickinson)的組合染色。包括DAPI染色以從分析中排除死亡 的細(xì)胞，以及包括FC封閉以抑制抗體與骨髓細(xì)胞上Fc受體的相互作用。此外，包括特異于 CD3、CD4、CDllb、CDllc和NKl. 1的抗體(Becton Dickinson)的組合，以確定在B細(xì)胞組份 之外的細(xì)胞類型中是否發(fā)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)。分析對(duì)于IGKV1-39/大鼠C κ轉(zhuǎn)基因是雜合的及在C57BL6背景對(duì)于CD19_Cre轉(zhuǎn) 基因是雜合的三只小鼠(HuVkl/CD19-Cre)。作為FACS分析的對(duì)照，包括對(duì)于人IGKV1-39/ 大鼠Ck轉(zhuǎn)基因是野生型及在C57BL6背景(⑶19_Cre)背景對(duì)于⑶19_Cre轉(zhuǎn)基因是雜合 型的三只同窩出生小鼠以及兩只C57BL6/Ntac小鼠(野生型)。使所有動(dòng)物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場 所中適應(yīng)環(huán)境1周之后進(jìn)行分析，所有小鼠均是雄性6周齡。使用先前所述常規(guī)技術(shù)從小 鼠的股骨、脾、腹膜腔和血液中分離淋巴細(xì)胞(Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168 2695 和 Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172 1371)。如表 10 所示預(yù)先組合抗體，及 在96孔平板中進(jìn)行染色。在用大鼠抗鼠抗體染色之前與PE-綴合的抗大鼠C κ (上述)保 溫以避免非特異性結(jié)合。在完成細(xì)胞染色之后，在Becton Dickinson LSR II FACS器械上 分析標(biāo)記的細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件(v6. 4. 7)分析。轉(zhuǎn)基因小鼠的體重、外觀和活動(dòng)性與野生型小鼠相似。在組織收獲期間觀測(cè)到無 顯而易見的解剖學(xué)改變。骨髓(BM)和脾中B細(xì)胞數(shù)目(表11)或者周圍器官中B細(xì)胞、 T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的數(shù)目在轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠之間觀測(cè)到無差異。此外，當(dāng)對(duì)比轉(zhuǎn) 基因小鼠與野生型小鼠時(shí)，不同淋巴細(xì)胞發(fā)育途徑中所述細(xì)胞的出現(xiàn)頻率或者比例沒有改 變。因此，在雙轉(zhuǎn)基因(HuVkl/tD19-Cre)和轉(zhuǎn)基因(⑶19_Cre)小鼠中，淋巴細(xì)胞和最重要 的B細(xì)胞發(fā)育與野生型小鼠無明顯差別。在外周淋巴器官中，轉(zhuǎn)基因特異性抗體(抗大鼠Ck-PE)染色僅在B細(xì)胞群中觀 測(cè)到。T細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和NK細(xì)胞群對(duì)于在脾中轉(zhuǎn)基因的表面表達(dá)均是陰性的(圖23)。相 反，在pan B細(xì)胞標(biāo)志物B220和CD19染色的細(xì)胞中，所有細(xì)胞在FACS圖中均出現(xiàn)向右漂 移，表示轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞表面表達(dá)(圖24)。在腹膜的CD5+B1細(xì)胞中測(cè)量到相似的轉(zhuǎn)基因特
29異性染色，該細(xì)胞是B細(xì)胞的發(fā)育獨(dú)特群(圖25)。B細(xì)胞從多系前體分化為成熟B細(xì)胞在骨髓中發(fā)生。在對(duì)來自骨髓的淋巴細(xì)胞的 分析中，胞外和轉(zhuǎn)基因表達(dá)在最早的B細(xì)胞祖細(xì)胞原B和前B細(xì)胞中與正常輕鏈表達(dá)模式 一致地不可檢測(cè)(圖26)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)首先在幼稚B細(xì)胞中變得可檢測(cè)，幼稚B細(xì)胞是在預(yù) 先選擇重鏈的情況中種系鼠輕鏈經(jīng)歷重排及在細(xì)胞表面表達(dá)的發(fā)育階段(圖26)。在成熟 的再循環(huán)的B細(xì)胞上也檢測(cè)到與脾轉(zhuǎn)基因輕鏈表達(dá)中的染色一致(圖26)。因此，CD19-Cre 驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與正常輕鏈表達(dá)模式一致。內(nèi)源輕鏈特異性抗體的染色比轉(zhuǎn)基因特異性 輕鏈抗體的染色更強(qiáng)。這可以表示內(nèi)源輕鏈的較高水平表達(dá)、內(nèi)源輕鏈特異性抗體更敏感 的染色或者這二者。重要的是，如在血液循環(huán)B細(xì)胞的染色中所觀測(cè)到轉(zhuǎn)基因輕鏈的表面 表達(dá)強(qiáng)度與內(nèi)源輕鏈和IgM表面表達(dá)均相關(guān)(圖27)。因此，總體上這個(gè)分析證實(shí)人IGKV1-39/C κ轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限于B細(xì)胞組份，其表 達(dá)的時(shí)序調(diào)節(jié)與內(nèi)源κ和λ輕鏈相似，導(dǎo)致所有B細(xì)胞群正常發(fā)育。轉(zhuǎn)基因的顯然較低水 平的表達(dá)可以通過啟動(dòng)子與內(nèi)源輕鏈基因上存在的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子相比的強(qiáng)度而解釋，或 者通過為內(nèi)源輕鏈提供與重排的重鏈配對(duì)的競爭優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的延遲而解釋。這個(gè)結(jié) 果與觀測(cè)到隨著B細(xì)胞成熟，轉(zhuǎn)基因染色的相對(duì)強(qiáng)度與內(nèi)源輕鏈相比增加的結(jié)果相一致。 此外，B細(xì)胞數(shù)目是正常的以及每個(gè)表面Ig+B細(xì)胞共表達(dá)內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因輕鏈的觀測(cè)結(jié)果支 持這樣的推斷，即IGKV1-39可變區(qū)能與不同的鼠重鏈可變區(qū)的正常儲(chǔ)備庫配對(duì)。我們從這 個(gè)分析中推斷在Rosa基因座中插入由CD19-Cre激活的CAGGS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的IGKV1-39/大 鼠Ck轉(zhuǎn)基因促進(jìn)該轉(zhuǎn)基因的適時(shí)且B細(xì)胞特異性的表達(dá)，所述轉(zhuǎn)基因能與鼠重鏈的正常 儲(chǔ)備庫配對(duì)。實(shí)施例19 JGKV1-39的Epibase T細(xì)胞表位譜掃描IGKV1-39的蛋白質(zhì)序列(圖12，人種系IGKV1-39/J蛋白)中推定的HLA II型限制表位(也稱作Th-表位)的存在。為此，將Algonomics’ Epibase 平臺(tái)用于 IGKV1-39。簡而言之，該平臺(tái)分析衍生自靶序列的所有可能的10聚體肽的HLA結(jié)合特異 性(Desmet et al. Nature 1992,356 539-542 ；Desmet et al. FASEB J. 1997，11 :164_172 ； Desmet et al. Proteins2002,48 31-43 ；Desmet et al. Proteins 2005,58:53-69)。在同 種異型水平對(duì)20個(gè)DRB1、7個(gè)DRB3/4/5、13個(gè)DQ和7個(gè)DP(即共47個(gè)HLA II型受體) (見表5)進(jìn)行作圖。Epibase 計(jì)算47個(gè)HLA II型受體的每一個(gè)受體的肽結(jié)合AGbind的 自由能的數(shù)量估算值。然后對(duì)這些數(shù)據(jù)如下進(jìn)一步處理 通過Δ Gbind = RT In (Kd)將自由能轉(zhuǎn)變?yōu)镵d-值。 將肽分為強(qiáng)(S)、中等(Μ)、弱和非(N)結(jié)合物(binder)。使用如下截?cái)嘀?(cutoffs)S 強(qiáng)結(jié)合物:Kd < 0. 1 μ M]\1:中等結(jié)合物0.1口] 彡1((1<0.8口]\1N 弱和非結(jié)合物:0· 8 μ M彡Kd 分別處理相應(yīng)于自身肽的肽。自身肽的列表取自293個(gè)抗體種系序列。它們被 稱作“種系過濾的”肽。S-肽和M-肽作圖到在所謂的表位譜中的靶序列上；S-親和性定量繪圖；M-值 定性示出。作為結(jié)果的綜述，表6列出了在分析的蛋白質(zhì)中對(duì)于相應(yīng)于DRB1、DQ、DP和DRB3/4/5基因的HLA II型受體組的強(qiáng)和中等結(jié)合物的數(shù)目。對(duì)于強(qiáng)和中等親和性結(jié)合物 分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)合同一組多個(gè)同種異型的肽計(jì)數(shù)為1。括號(hào)內(nèi)的數(shù)值是指種系過濾的肽。 在表7中，以適于實(shí)驗(yàn)工作的形式示出序列。所述序列分解為有12個(gè)殘基重疊的連續(xù)15 聚體。對(duì)于每個(gè)15聚體，列出了混雜性(共47個(gè)含有關(guān)鍵結(jié)合物的15聚體中的同種異型 數(shù)目)以及提示的血清型。Epibase 圖及表位作圖在圖16和17中示出。推斷IGKV1-39不含有強(qiáng)非自身DRBl結(jié)合物。典型地，針對(duì)DRBl較其它HLA基因 顯然發(fā)現(xiàn)更多的結(jié)合物。這與屬于DRBl的同種異型是更強(qiáng)力的肽結(jié)合物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)一致。 預(yù)期DRBl同種異型的中等強(qiáng)度的表位有助于群應(yīng)答，且不能被忽視。再一次，在IGKV1-39 中發(fā)現(xiàn)沒有非自身DRBl結(jié)合物。在針對(duì)抗原產(chǎn)生的體液應(yīng)答中，觀測(cè)到的Th細(xì)胞活化/增殖通常用DRBl特異性 來解釋。然而，不能忽視DRB3/4/5、DQ和DP基因的可能作用。假定這些基因的表達(dá)水平 與DRBl相比較低，則要注意DRB3/4/5、DQ和DP的強(qiáng)表位的類別?！瓣P(guān)鍵表位”是對(duì)于任何 DRBl、DRB3/4/5、DQ或者DP同種異型是強(qiáng)結(jié)合物或者對(duì)于DRBl是中等結(jié)合物的那些表位。 IGKV1-39不含有DRB3/4/5、DQ或者DP的強(qiáng)或者中等非自身結(jié)合物。許多肽也存在于種系序列中(表6中括號(hào)內(nèi)的數(shù)值)。這種肽可非常良好地結(jié) 合HLA，但是假定其是自身的且因此是非免疫原性的。在IGKV1-39中發(fā)現(xiàn)總計(jì)6個(gè)強(qiáng)的和 16個(gè)中等的種系過濾的DRBl結(jié)合物。構(gòu)架區(qū)1至構(gòu)架區(qū)3與種系V-區(qū)段VKI 2_1_(1) 012 (VBase)，a. k. a. IGKV1_39*01 (IMGT)精確匹配。構(gòu)架區(qū) 4 與種系 J-區(qū)段 JKl (V-base) a. k. a. IGKJl^OI(IMGT)精確匹配。這些區(qū)段不含有任何非自身表位，這并不意外。實(shí)施例20 JGKV1-39的生產(chǎn)特性特別需要產(chǎn)生熱力學(xué)穩(wěn)定的治療性抗體及提供良好表達(dá)產(chǎn)量的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。這 些特性在保證所述藥物在生產(chǎn)期間及藥物注射進(jìn)患者體內(nèi)之后的穩(wěn)定性中是重要的。此 外，良好的表達(dá)對(duì)藥物生產(chǎn)成本及因此的定價(jià)、患者使用權(quán)和盈利產(chǎn)生直接影響。實(shí)際上目 前臨床上使用的所有治療性抗體均由人IgGl和κ恒定區(qū)組成，但是使用賦予特異性的不 同重鏈和輕鏈可變區(qū)。人可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域可以分為具有高于80%序列差異的家族。 當(dāng)在種系構(gòu)型中組合這些家族的重排的實(shí)例并對(duì)比穩(wěn)定性和產(chǎn)量時(shí)，清晰可見這些基因家 族在生物物理學(xué)性質(zhì)方面是不同的。特別地，VH3、VhI和VH5對(duì)于重鏈具有有利的穩(wěn)定性， Vkl和Vk3對(duì)于輕鏈具有最佳穩(wěn)定性和產(chǎn)量。此外，當(dāng)突變作為體細(xì)胞超突變過程的一部 分而導(dǎo)入時(shí)，其可以干擾VH/\配對(duì)。為了評(píng)估具有不同突變率的不同輕鏈基因?qū)τ诠潭ǖ?Vh鏈的生產(chǎn)特性的作用，使用來自6個(gè)自然健康供體的輕鏈(κ和λ)組合來自免疫的供 體的一組44個(gè)TT結(jié)合重鏈構(gòu)建Fab噬菌體展示文庫。在一次選擇后，分離TT結(jié)合的Fab 克隆。一些這樣的克隆共有與組合不同輕鏈的TT克隆PG1433相同的Vh基因。將Fab輕鏈 片段再克隆進(jìn)κ表達(dá)載體中，并與編碼PG1433的重鏈的DNA組合轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞中，通過 ELISA測(cè)量特異性IgG的產(chǎn)生。如表8所證實(shí)，選擇的含有PG1433 Vh組合不同輕鏈的克隆 的蛋白質(zhì)表達(dá)低于PG1433 Vh組合IGKV1-39的蛋白質(zhì)表達(dá)5-10倍。注意在其編碼區(qū)內(nèi)含 有氨基酸突變的所有輕鏈可能破壞Vh配對(duì)及降低生產(chǎn)穩(wěn)定性。因此，除了降低不希望的免 疫原性之外，預(yù)期使用沒有突變的輕鏈IGKV1-39可以改良各種賦予特異性的乂11基因的生 產(chǎn)穩(wěn)定性及產(chǎn)量。事實(shí)上通過轉(zhuǎn)染均與IGKV1-39配對(duì)的不同的乂11基因產(chǎn)生的穩(wěn)定克隆能 大量傳代，且仍保留如表9所示的強(qiáng)生產(chǎn)特性。
實(shí)施例21 表達(dá)完全人VH和VL區(qū)的小鼠的產(chǎn)生使本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠與已經(jīng)含有人VH基因座的小鼠雜交。舉例的包含人VH基 Sj^W π^ ^JnIli Taylor et al. (1992). Nucleic Acids Res 20 6287-95 ；Lonberg et al. (1994). Nature 368 856-9 ；Green et al. (1994). Nat Genet 7 13-21 ；Dechiara et al. (2009). Methods Mol Biol 530:311-24.)中揭示。在雜交和選擇對(duì)于IGKV1-39轉(zhuǎn)基因和人VH基因座至少是雜合的小鼠之后，用靶 免疫選擇的小鼠。如上所述收獲VH基因。這種方法的優(yōu)勢(shì)是VH基因已經(jīng)是完全的人基因 且因此不需要人源化。實(shí)施例22 用以治療慢性炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶向人IL6的抗體的分 離、鑒定、寡克隆格式化(Oligoclonics formatting)和產(chǎn)生將取自用人重組IL6免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾VH儲(chǔ)備庫與單一人IGKVI-39-CK輕 鏈(等于小鼠轉(zhuǎn)基因)克隆進(jìn)噬菌體展示Fab載體中，并針對(duì)免疫原人IL6進(jìn)行分選。分 析在2-4次分選后獲得的克隆的結(jié)合特異性。對(duì)編碼IL6特異性Fab片段的VH基因進(jìn)行 序列分析，以鑒別獨(dú)特的克隆，并分配(assign) VH、DH和JH用途。將Fab片段再格式化為 IgGl分子及瞬時(shí)表達(dá)。然后基于結(jié)合測(cè)定中的非競爭性對(duì)獨(dú)特的克隆分組，進(jìn)行親和性和 功能性分析。隨后最強(qiáng)力的抗-IL6 IgGl mAb表達(dá)為包含寡克隆(Oligoclonics)形式的 不同VU區(qū)的2、3、4或者5個(gè)重鏈與1個(gè)基于IGKV1-39-C的κ輕鏈的組合，在體外檢測(cè)與 IL-6的復(fù)合物形成。也在體內(nèi)測(cè)試了寡克隆(Oligoclonics)將人IL-6從小鼠中清除的情 況。選擇具有最強(qiáng)力清除活性的寡克隆(Oligoclonic)，根據(jù)常規(guī)方法人源化鼠VH基因。 將人源化IgGl轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，產(chǎn)生穩(wěn)定克隆。選擇最佳的亞克隆以產(chǎn)生原始細(xì) 胞庫(master cell bank)以及臨床試驗(yàn)材料。本文描述的一些方案是構(gòu)建噬菌體展示文庫及分選結(jié)合感興趣的抗原的噬菌體 的標(biāo)準(zhǔn)方案，例如在Antibody Phage Display =Methods and Protocols. 2002. Editor (s) Philippa M. 0' Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, New Jersey, USA 中描述。免疫轉(zhuǎn)基因小鼠每兩周接受三次人IL6免疫接種，使用佐劑Sigma titerMax根據(jù)廠商 指導(dǎo)進(jìn)行。 RNA分離與cDNA合成在最后一次免疫之后3天，從小鼠中取出脾和淋巴結(jié)，通過70微米過濾進(jìn)含有PBS PH 7. 4的管中，產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。在洗滌及沉淀淋巴細(xì)胞之后，將細(xì)胞懸浮于TRIzol LS Reagent(Invitrogen)中，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離總 RNA，并使用 Iyg RNA,Superscript III RT 組合dT20根據(jù)廠商(Invitrogen)指導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如實(shí)施例2所述進(jìn)行Fab噬菌體展示文庫的產(chǎn)生。在包被的免疫試管(immunotube)上選擇噬菌體將人重組IL6溶解于PBS中，濃度為5μ g/ml，并在4°C包被MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474)過夜。在棄去包被溶液之后，將該管用在PBS中2%脫脂乳(ELK)(封閉 緩沖液)在室溫(RT)封閉1小時(shí)。相應(yīng)地，將0. 5ml噬菌體文庫與Iml封閉緩沖液混合， 在室溫保溫20分鐘。在噬菌體封閉后，向IL6包被的管中加入噬菌體溶液，在室溫緩慢旋 轉(zhuǎn)平臺(tái)上保溫2小時(shí)以使得結(jié)合。接下來，將該管用PBS/0. 05% Tween-20洗滌10次，隨后在旋轉(zhuǎn)輪上與Iml 50mM甘氨酸-HCl pH 2. 2在室溫保溫10分鐘進(jìn)行噬菌體洗脫，隨后用 0. 5ml IM Tris-HCl pH 7. 5中和收獲的洗脫液。收獲噬菌體克隆將0. D. 0. 4的5ml XLl-Blue MRF (Stratagene)培養(yǎng)物加入收獲的噬菌體溶液中， 在37°C不搖動(dòng)保溫30分鐘，以使得噬菌體感染。將細(xì)菌鋪板于羧芐青霉素/四環(huán)素4%葡 萄糖2*TY平板上，在37 °C生長過夜。產(chǎn)生噬菌體如Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11) :e59)所 述生長和處理噬菌體，使用VCSM13作為輔助噬菌體。噬菌體ELISAELISA平板用每孔100 μ 1濃度為在PBS中2. 5 μ g/ml人重組IL6在4°C包被過夜。 用濃度為在PBS中2μ g/ml的100μ 1甲狀腺球蛋白包被的平板用作陰性對(duì)照。倒空孔，在 紙巾上輕擊干燥，充填PBS-4%脫脂乳(ELK)，并在室溫保溫1小時(shí)以封閉所述孔。在棄去 封閉溶液之后，加入與50 μ 1封閉溶液預(yù)先混合的噬菌體微量制備物(minipr印s)，在室溫 保溫1小時(shí)。隨后通過用PBS-0.05%Tween-20洗滌5次除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬 菌體通過將孔與100 μ 1抗-M13-HRP抗體綴合物(在封閉緩沖液中稀釋1/5000)在室溫保 溫1小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。游離的抗體通過重復(fù)上述洗滌步驟除去，隨后與TMB底物保溫直至可 觀測(cè)到生色。通過加入100 μ 1的2Μ/孔H2SO4終止反應(yīng)，在450nm發(fā)射波長在ELISA分析 儀上分析。測(cè)序增殖提供高于背景信號(hào)至少3倍的信號(hào)的克隆，用于DNA微量制備程序(見 Qiagen miniPr印手冊(cè))，并進(jìn)行核苷酸序列分析。根據(jù)Big Dye 1. 1試劑盒附帶的手冊(cè) (Applied Biosystems)指導(dǎo)，使用識(shí)別人IgGl重鏈CHl區(qū)的5’序列(在Fab展示載體 MV1043中呈現(xiàn)，圖3和12)的反向引物(CHl_Revl，表1)進(jìn)行測(cè)序。分析鼠VH區(qū)的序列的 DH和JH基因區(qū)段的多樣性。嵌合型IgGl的構(gòu)建及表達(dá)載體MV1057 (圖12和22)通過將轉(zhuǎn)基因(IGKV1-39) L鏈片段克隆進(jìn)載體 pcDNA3000Neo (Cruce 11, Leiden, The Netherlands)的衍生物中而產(chǎn)生，所述載體衍生物含 有人IgGl-和κ恒定區(qū)。將VH去克隆進(jìn)MV1057中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)核實(shí)所有構(gòu)建體的核苷 酸序列。使所得構(gòu)建體在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，獲得含有嵌合型IgGl的上清并純化， 使用如先前所述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Throsby，Μ. 2006. J Virol 80 :6982_92)。IgGl結(jié)合及競爭分析使用如上所述IL6包被的平板及抗人IgG過氧化物酶綴合物在ELISA中對(duì)IgGl抗 體進(jìn)行滴定。進(jìn)行基于表位識(shí)別的針對(duì)一組抗體的競爭性ELISA，即將Fab噬菌體與IgGl 或者與商購的IL6的抗體(例如Abeam cat. no. ab9324)在IL6包被的平板中一起保溫，隨 后使用抗-M13過氧化物酶綴合物檢測(cè)結(jié)合的Fab噬菌體。IgGl親和性測(cè)量使用Octet (ForteBio)定量動(dòng)力學(xué)方案確定所述抗體與IL6的親和性?？贵w被捕 獲在抗人IgG Fc捕獲生物傳感器上，并暴露于游離IL6，使用專有軟件計(jì)算每個(gè)抗體的Kd進(jìn)行分析。IL6抗體的功能活性為了檢測(cè)選擇的抗體抑制IL6與IL6受體(IL6R)之間結(jié)合的能力，使用基于 ELISA的測(cè)定。將不同濃度的抗體與固定濃度(lOng/ml)的生物素?；腎L6混合，如Naoko et al. 2007，Can. Res. 67 :817_875所述。將所述IL6-抗體免疫復(fù)合物加入固定的IL6R 中。使用辣根過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素檢測(cè)生物素酰化的IL6與IL6R的結(jié)合。通過 ELISA信號(hào)降低測(cè)量抑制情況。作為IL6與IL6R之間結(jié)合抑制的陽性對(duì)照，使用抗-IL6R 抗體(Abeam cat. no. ab34351 ；克隆 B-R6)或者抗 IL6 抗體(Abeam cat. no. ab9324)。在增殖測(cè)定中使用IL6依賴性細(xì)胞系7TD1測(cè)量選擇的抗-IL6抗體的體外封閉活 性。簡而言之，將細(xì)胞與不同濃度的人IL6在具有或者沒有抗IL6抗體條件下保溫。可利 用的IL6量確定增殖的程度。因此，如果加入的抗體封閉IL6結(jié)合，則增殖讀出值與非結(jié)合 抗體對(duì)照組相比降低。通過使用BrdU試劑盒(Roche cat. no. 11444611001)根據(jù)廠商指導(dǎo) 在DNA中摻入5-溴-2 ‘-脫氧-尿苷(BrdU)進(jìn)行測(cè)量。抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)的產(chǎn)生從每個(gè)表位組選擇最強(qiáng)力的抗-IL6抗體。將表達(dá)這些抗體的表達(dá)構(gòu)建體在3 個(gè)非競爭性組中以不同比率轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞中(1 1 1 ;3 1 1 ;1 3 1 ； 1 1 3 ；3 3 1 ；1 3 3 ；3 1 3 ；10 1 1 ；1 10 1 ；1 1 10 ； 10 10 1；1 10 10 ；10 1 10 ；3 10 1 ；10 3 1 ；1 10 3 ；3 1 10 ；
10 1 3;1 3 10)。收獲含有抗體的上清并純化以及如上述鑒定?？?IL6寡克隆(Oligoclonics)的復(fù)合物形成及體內(nèi)清除為了測(cè)量抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)形成免疫復(fù)合物的能力及分析這些復(fù) 合物，使用根據(jù)Min-Soo Kim et al. (2007) JMB 374 1374-1388揭示的大小排阻層析法 (SEC)鑒定與TNFa的不同抗體形成的免疫復(fù)合物。將不同摩爾比率的抗_IL6寡克隆 (Oligoclonics)與人IL6混合，在4°C或者25°C保溫20小時(shí)。將此混合物在裝備大小排阻 柱的HPLC系統(tǒng)上分析；使用分子量標(biāo)準(zhǔn)使不同的洗脫時(shí)間與分子量相關(guān)聯(lián)。使抗體與IL6形成復(fù)合物的能力與其在體內(nèi)從循環(huán)中快速清除細(xì)胞因子的能力 相關(guān)聯(lián)。這通過測(cè)量放射性標(biāo)記的IL6從小鼠中的清除而證實(shí)。簡而言之，獲得雌性6-8 周齡的Balb/c小鼠，在實(shí)驗(yàn)前18小時(shí)通過側(cè)面尾靜脈經(jīng)靜脈內(nèi)(IV)注射不同劑量的純化 的抗-IL6寡克隆(Oligoclonics)。在第0天，在相同條件下為小鼠IV注射50 μ 1放射性 標(biāo)記的IL-6 (lxlOE7cpm/mL)。在一些時(shí)間間隔收集血樣(大約50 μ 1),并在4°C貯存。將 樣品在4000Xg離心5分鐘，確定血清的放射性。所有藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)均使用每種處理三只動(dòng) 物同時(shí)進(jìn)行?？?IL6寡克隆(Oligoclonics)穩(wěn)定克隆的產(chǎn)生及臨床前開發(fā)基于如上文確定的體外和體內(nèi)效力選擇先導(dǎo)抗-IL6。鼠VH基因根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法 人源化，并且與完全人GKV1-39輕鏈在上述表達(dá)載體中組合。人源化方法的實(shí)例包括基于 范例的那些方法，如表面再建(Padlan, Ε. A.，et al.，(1991). Mol. Immunol.，28，489)、超 人源化(Tan, P.，D. Α.，et al.，(2002) J. Immunol.，169，1119)及人 string content 優(yōu)化 (Lazar, G. Α.，et al.，(2007). Mol. Immunol.，44，1986)。將這三個(gè)構(gòu)建體以預(yù)定的最佳比 率(如上述)在G418選擇壓力下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染進(jìn)PER. C6細(xì)胞中。選擇穩(wěn)定的高產(chǎn)量
34抗-IL6寡克隆克隆(Oligoclonic clone)，產(chǎn)生合格的工作原始細(xì)胞庫。表 1引物列表
DO-引物序列0012CHI—RevTGCCAGGGGGAAGACCGATG0656MVH-IGCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC0657MVH-2GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC0658MVH-3GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGG0659MVH-4GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGAC0660MVH-5GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGAC0661MVH-6GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGG0662MVH-7GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAGTCTGG0663MVH-8GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRC0664MVH-9GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTGG0665MVH-10GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACAATCTGGACC0666MVH-IlGCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGG0667MVH-12GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTG0668MVH-13GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTG0669MVH-14GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGG0670MVH-15GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGG0671MVH-16GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGG0672MVH-17GCCGGCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTCTGGTG0673MVH-18GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTCGAGTCTGGA0674MVH-19GCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTCTGG
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其至少在其B細(xì)胞譜系中包含編碼至少免疫球蛋白輕鏈或者 重鏈的核酸，其中所述重鏈或者輕鏈編碼序列具有使其對(duì)于DNA重排和/或體細(xì)胞超突變 有抗性的手段。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其是嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選小鼠。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈/重鏈編碼序列整合在 所述非人哺乳動(dòng)物的基因組中。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述整合位于對(duì)沉默具有抗性的基因座中。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述整合位于Rosa-基因座中。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼核酸具有使得所述 核酸的表達(dá)基本限于B細(xì)胞譜系的細(xì)胞的手段。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼核酸具有使得所述輕鏈編碼 核酸的表達(dá)在B細(xì)胞發(fā)育的一定階段占主導(dǎo)地位的手段。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述手段包含選自⑶19、⑶20、μHC, VpreBU Vpr eB2, Vpr eB3, λ 5、Iga、Ig β、κ LC、λ LC 禾口 BSAP (Pax5)的啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求7或8的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述手段包含cre-lox系統(tǒng)等。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼序列編碼能與所 述非人哺乳動(dòng)物編碼的至少兩個(gè)不同重鏈配對(duì)的輕鏈。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中編碼內(nèi)源輕鏈的至少一個(gè)內(nèi)源 基因座是功能性沉默的。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中內(nèi)源κ輕鏈?zhǔn)枪δ苄猿聊摹?br> 13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼序列的序列是人 νκ序列。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼序列是種系樣序列。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼序列是種系序列。
16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述種系序列基于012。
17.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，其中所述輕鏈編碼核酸從5’-3’方向包含 ν κ啟動(dòng)子，人前導(dǎo)序列，人V基因，任選存在的MoE κ i增強(qiáng)子，大鼠恒定區(qū)(κ )，及任選存 在的(截短的)MoE κ 3’增強(qiáng)子。
18.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其具有在細(xì)胞發(fā)育成成熟B細(xì)胞的一定階段期間在細(xì)胞中表達(dá) 希望的蛋白質(zhì)樣分子的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含防止在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中之后希望的蛋白質(zhì)樣分子表達(dá)沉默的手段，及在宿主細(xì)胞希望的發(fā)育階段定時(shí)表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子的手段。
19.具有權(quán)利要求18的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述定時(shí)表達(dá)的手段是其活性 基本限于發(fā)育一定階段的啟動(dòng)子。
20.具有權(quán)利要求18或19的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述一定階段起自所述細(xì) 胞在發(fā)育為成熟B細(xì)胞的一定階段即將發(fā)生輕鏈分子表達(dá)之前或者與發(fā)生輕鏈分子表達(dá) 相同的階段。
21.具有權(quán)利要求19或20的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述啟動(dòng)子選自CD19啟動(dòng)子、Ig-α啟動(dòng)子、Ig-β啟動(dòng)子、μ he啟動(dòng)子、vk啟動(dòng)子，或者其類似物和/或同源物。
22.具有權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) ere-樣蛋白質(zhì)的表達(dá)。
23.具有權(quán)利要求22的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中編碼希望的蛋白質(zhì)樣分子的序 列通過所述ere-樣蛋白質(zhì)的作用而被激活。
24.具有一組作為表達(dá)盒的核酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中一個(gè)核酸包含權(quán)利要求22的 表達(dá)盒，第二個(gè)核酸包含編碼希望的蛋白質(zhì)樣分子的序列，所述序列在組成型啟動(dòng)子的控 制下，所述啟動(dòng)子可以通過ere-樣蛋白質(zhì)的作用而被激活。
25.具有權(quán)利要求23或M的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述激活是通過除去“終 止”而實(shí)現(xiàn)。
26.具有權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述希望的蛋白質(zhì) 樣分子是免疫球蛋白的多肽鏈。
27.具有權(quán)利要求沈的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述多肽是輕鏈。
28.具有權(quán)利要求27的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中編碼所述多肽鏈的序列基本上 不能重排。
29.具有權(quán)利要求27或洲的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述輕鏈?zhǔn)欠N系樣輕鏈。
30.具有權(quán)利要求四的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述種系樣輕鏈?zhǔn)?12。
31.具有權(quán)利要求觀-30任一項(xiàng)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述重排是由于不 存在至少部分導(dǎo)致體細(xì)胞超突變的元件如MoEK i增強(qiáng)子而阻止的。
32.具有權(quán)利要求18-31任一項(xiàng)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述防止沉默的手 段是插入宿主細(xì)胞基因組中對(duì)沉默具有抗性的的基因座中的手段。
33.具有權(quán)利要求32的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述插入手段是同源重組進(jìn)所 述對(duì)沉默具有抗性的位點(diǎn)中的手段。
34.具有權(quán)利要求32或33的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述基因座是rosa-基因座。
35.具有權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其在5’-3’方向包含VK 啟動(dòng)子，人前導(dǎo)序列，人V基因，任選存在的MoE κ i增強(qiáng)子，大鼠恒定區(qū)(κ )及任選存在的 (截短的)MoE κ 3’增強(qiáng)子。
36.產(chǎn)生希望的抗體的方法，包括使權(quán)利要求1-35任一項(xiàng)的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗 原，由此誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，以及分離特異于所述抗原的抗體。
37.產(chǎn)生希望的抗體的方法，包括使權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗 原，由此誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，以及分離產(chǎn)生此類抗體的細(xì)胞，培養(yǎng)所述細(xì)胞及任選地使所述細(xì)胞 永生化，并收獲所述抗體。
38.產(chǎn)生希望的抗體的方法，包括使權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的非人哺乳動(dòng)物暴露于抗 原，由此誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，以及分離編碼至少部分這種抗體的核酸，將所述核酸或者其拷貝或 者衍生物插入表達(dá)盒中，及在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述抗體。
39.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代，所述后代至少在其B細(xì)胞譜系中 包含重鏈或者輕鏈編碼序列以及使所述序列對(duì)DNA重排和/或體細(xì)胞超突變具有抗性的手 段。
40.權(quán)利要求18-35任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的后代，所述后代包含表達(dá)盒，所述表達(dá) 盒在細(xì)胞發(fā)育為成熟B細(xì)胞的一定發(fā)育階段期間在細(xì)胞中表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分子。
41.分離自權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含重鏈或者輕 鏈編碼序列以及使所述序列對(duì)DNA重排和/或體細(xì)胞超突變具有抗性的手段。
42.分離自權(quán)利要求18-35任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含表達(dá)盒，所 述表達(dá)盒在細(xì)胞發(fā)育為成熟B細(xì)胞的一定發(fā)育階段期間在細(xì)胞中表達(dá)希望的蛋白質(zhì)樣分 子。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包含編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸，其中所述免疫球蛋白輕鏈?zhǔn)侨说?、人樣的或者人源化的。所述核酸具有使其呈現(xiàn)出對(duì)于DNA重排和/或體細(xì)胞超突變具有抗性的手段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含在細(xì)胞發(fā)育成為成熟B細(xì)胞的一定發(fā)育階段期間在細(xì)胞中表達(dá)希望的分子的表達(dá)盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供了從所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中產(chǎn)生免疫球蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102123582SQ200980131844
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者C·A·德克呂夫, E·豪特扎格爾, M·思羅斯比, R·A·克拉默, R·D·平托, T·洛戈滕伯格 申請(qǐng)人:莫魯斯有限公司