專利名稱：一種蚓激酶制備工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蚓激酶制備工藝方法。
背景技術(shù)：
血栓性疾病的高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率嚴(yán)重威脅人類的生存，溶栓性藥物是治療該病的首選用藥。目前臨床上使用的溶栓性藥物中普遍存在易引起出血的副作用；有的價(jià)格昂貴，一般百姓難以承受；有的穩(wěn)定性較差，保存條件要求較高，給用藥者帶來很多不便；有的品種給藥方式單一，只有口服、或只有靜脈或肌肉注射，使用藥范圍受到很大限制。 蚯蚓在中藥中統(tǒng)稱為地龍，可分為雙胸蚓、赤子愛勝蚓、鋸齒遠(yuǎn)蚓及參環(huán)毛蚓等不同種屬，在我國早已被列入藥源，其中作為活血化瘀應(yīng)用已有幾千年的歷史。研究表明，新鮮的蚯蚓體內(nèi)含有多種蛋白酶類，其中一組具有強(qiáng)烈溶解纖維蛋白及血栓作用的絲氨酸蛋白酶由日本Mihara等于八十年代首次發(fā)現(xiàn)，命名為蚓激酶，由此引起了國內(nèi)外諸多學(xué)者的關(guān)注，開始了對蚓激酶從分離純化和理化性質(zhì)到藥效學(xué)研究與臨床應(yīng)用等方面的廣泛研究。大量的研究證實(shí)蚓激酶廣泛存在于不同種屬蚯蚓體內(nèi)，是一組富含酸性氨基酸，分子量20000-40000道爾頓，具有激酶和纖溶酶雙重功能的絲氨酸蛋白酶它既可類似纖溶酶直接降解纖維蛋白及纖維蛋白原，又類似尿激酶、鏈激酶等激活纖溶酶原形成纖溶酶，起到纖溶酶原激活劑的作用。蚓激酶的最大特點(diǎn)是穩(wěn)定性好，纖溶活性強(qiáng)，藥理作用明顯，副作用小，可做成各種劑型的藥品，且來源廣泛。近20多年來，不少的研究人員都在力求將蚓激酶的研究推向?qū)嶋H應(yīng)用，先后有各種各樣的分離純化技術(shù)問世。 如專利ZL 03134768. 1公開了通過采用單克隆抗體技術(shù)實(shí)現(xiàn)蚓激酶活性組分的再純化，從而得到高純度蚓激酶。專利ZL02153848. 4公開了通過粗分離先后過陰離子交換層析柱等精細(xì)純化工藝能得到七個(gè)組分可滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備。專利ZL03146692. 3公開了采用包括陰離子交換層析、超濾、凝膠過濾脫鹽等分離方法獲得達(dá)電泳級蛋白酶。上述種種蚓激酶分離純化方法都用到了柱層析技術(shù)，由于是粗提物直接上層析柱，所以柱子的負(fù)載量很大，相對于等量的填料，蚓激酶的收率很低；且蚓激酶的制備成本很高，產(chǎn)生需處理的廢液多；上述一些工藝的蚓激酶的生產(chǎn)能力也相對較低。 直到目前為止，一些成熟的制備高純度蚓激酶的實(shí)驗(yàn)技術(shù)真正轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)還有一定難度。所以，研究開發(fā)一種蚓激酶生產(chǎn)工藝方法并實(shí)現(xiàn)其工業(yè)生產(chǎn)化成為科研工作者的當(dāng)務(wù)之急。 為此，我們經(jīng)過反復(fù)探索，開發(fā)研制了一種能實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)化蚓激酶生產(chǎn)工藝方法。 這種蚓激酶生產(chǎn)工藝方法的優(yōu)點(diǎn)在于蚓激酶的收率較高、制備成本較低，產(chǎn)生需處理的廢液少、生產(chǎn)能力大。 經(jīng)相關(guān)專利和現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，均未見本發(fā)明的蚓激酶生產(chǎn)工藝方法的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的蚓激酶生產(chǎn)工藝存在的缺點(diǎn)蚓激酶的收率低、制備成本高，產(chǎn)生
需處理的廢液多、生產(chǎn)能力低，本發(fā)明提供了一種能實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)化蚓激酶生產(chǎn)工藝方法。
該種工藝方法是在將蚯蚓勻漿時(shí)加入乙醇作為助劑并通過物理沉降、超濾去除雜蛋白，然
后再上柱子層析純化，這樣減少柱子的負(fù)載量，從而提高了蚓激酶的收率、降低了其制備成
本，減少了產(chǎn)生需處理的廢液、大大提高了生產(chǎn)能力。 本發(fā)明的目的在于提供一種蚓激酶生產(chǎn)工藝方法。
本發(fā)明的任務(wù)是通過以下方案實(shí)施的。
—種蚓激酶生產(chǎn)工藝方法包括以下步驟( — )鮮蚓清洗 在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10 18小時(shí)，讓蚯蚓排出污物，用手或工具刮掉，稱重。用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫中備用。
(二)磨漿 用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V)1 : 3 5的比例加入低濃度乙醇的pH5. 0 5. 3的檸檬酸鈉制成勻漿。
(三)除渣 用臥式螺旋沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液，粗渣集中處理。進(jìn)料量控制在100 300升/小時(shí)。料液中避免沙子進(jìn)入，用完后用清水清洗。
(四)鹽析 上清液中按30%飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)。
(五)離心 用立式高速離心機(jī)經(jīng)14000轉(zhuǎn)/分的高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液。進(jìn)料量60 120升/小時(shí)。轉(zhuǎn)鼓中的細(xì)渣用工具刮下，集中處理，轉(zhuǎn)鼓用清水清洗干凈。
(六)超濾 取上清液用50， 000dt膜超濾，得超濾液。
(七)柱層析分離 1上樣將離心的漿液用泵送到下料桶，混合上樣，調(diào)節(jié)柱底部出樣口閥，使流量在40升/小時(shí)。每柱裝量體積以60升計(jì)，上樣量約為80 IOO升(折合鮮蚓約為20 25kg)。上樣時(shí)保證每柱進(jìn)料均勻，每柱液面高度保持不變。流出液p朋.O，呈酸性，檢測無活力。 2洗滌上樣完畢，用洗滌液洗滌，流量為50升/小時(shí)，洗量為80升/柱，洗至流出液呈淡黃色，pH7. 0 8. 0，略呈堿性。 3洗脫用洗脫液洗脫，流量約為40升/小時(shí)，洗脫液變混濁，顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比洗脫液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集。洗脫倍數(shù)大約為1 : 2V/V。洗脫至料液變清，顏色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到洗脫液電導(dǎo)率為止。 4后處理收集完畢，層析柱用去離子水洗滌，流量60升/小時(shí)或稍大，每柱用水
120升。然后用洗滌液平衡，備用。
(八)超濾 1清洗加入去離子水適量，開泵清洗，至流出液呈中性。 2超濾將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0. 1Mpa，濃縮至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH = 7. 0)最后濃縮至1/(16 20)。 3清洗先用去離子水洗二遍，洗液回收套用。再用1 2N氯化鈉清洗15分鐘，并用1 2N氯化鈉浸泡，待用(短時(shí)間)。若長時(shí)間不用，要用0. 1N NaOH沖洗、浸泡。
(九)過濾、除菌 1澄清過濾用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清。 2除菌將除菌設(shè)備、附件、出料管道、接料瓶經(jīng)高溫高壓消毒。在30萬級用0. 22um
微孔濾膜進(jìn)行滅菌過濾。
(十)噴干 打開排風(fēng)機(jī)，打開電加熱器，使進(jìn)口溫度達(dá)到140 145t:，預(yù)熱半小時(shí)，加料液，調(diào)節(jié)閥門，使出口溫度控制在80 86t:。定時(shí)敲塔，收集酶粉。料液完畢后，先關(guān)電加熱器，降溫至40°C ，關(guān)掉風(fēng)機(jī)取下收集瓶。 所述生產(chǎn)工藝方法中，低濃度乙醇的濃度范圍為5% 30%，優(yōu)先選取10% 20%。 所述生產(chǎn)工藝方法中，柱層析的層析柱，可以為疏水層析柱、離子層析柱，優(yōu)先選取疏水層析柱。 所述生產(chǎn)工藝方法中，洗滌液的pH值為7. 0 8. 5，優(yōu)先選取7. 0 8. O，可以為
硫酸銨_磷酸鹽緩沖液、硫酸銨_三羥甲基氨基甲烷緩沖液或巴比妥_氯化鈉緩沖液，優(yōu)先選取硫酸銨_磷酸鹽緩沖液。 所述生產(chǎn)工藝方法中，洗脫液pH值為為7. 0 8. 5，優(yōu)先選取7. 0 8. O，可以為
硫酸銨_三羥甲基氨基甲烷緩沖液、巴比妥_氯化鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液，優(yōu)先選取磷酸鹽緩沖液。 本發(fā)明提供的工藝方法是在將蚯蚓勻漿時(shí)加入乙醇作為助劑通過物理沉降、超濾去除雜蛋白，然后再上柱子層析純化，這樣減少柱子的負(fù)載量，從而提高了蚓激酶的收率、降低了其制備成本，減少了產(chǎn)生需處理的廢液、大大提高了生產(chǎn)能力。 本發(fā)明提供的蚓激酶生產(chǎn)工藝方法，其蚓激酶的生產(chǎn)工藝質(zhì)量可控性和穩(wěn)定性好。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
( — )鮮蚓清洗 在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10 18小時(shí)，讓蚯蚓排出污物，用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫中備用。
( 二 )磨漿 用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V) 1 : 4的比例加入10%乙醇的pH5. 3的擰檬酸鈉制成勻槳。
(三)除渣 用沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液。[OO53](四)鹽析 上清液中按30%飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)。
(五)離心 用立式高速離心機(jī)經(jīng)高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液。
(六)超濾 取上清液用50， OOOdt膜超濾，得超濾液。(七)柱層析分離(層析柱填料疏水層析，填料為Phenyl S印harose 6FF)
將超濾液用泵送到下料桶，混合上樣，上樣完畢，用pH為7. 5的硫酸銨_磷酸鹽緩沖液，洗至流出液呈淡黃色，略呈堿性，再用pH為7. 5磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液變混濁，顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集，洗脫至料液變清，顏色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率(不小于9000ii s/cm)為止。
(八)超濾 將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0. 1Mpa，濃縮至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH = 7. 0)最后濃縮至1/17。 (九)過濾、除菌 用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清，在30萬級用0. 22um微孔濾膜
進(jìn)行滅菌過濾。(十)噴干 在干燥塔中，使出口溫度控制在82t:干燥料液，收集酶粉。
實(shí)施例2
( — )鮮蚓清洗 在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10 18小時(shí)，讓蚯蚓排出污物，用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫中備用。
( 二 )磨漿 用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V) 1 : 3的比例加入15X乙醇的pH5. 0的
擰檬酸鈉制成勻槳。
(三)除渣 用沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)鹽析 上清液中按30%飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)。 (五)離心 用立式高速離心機(jī)經(jīng)高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液。
(六)超濾 取上清液用50， OOOdt膜超濾，得超濾液。
6
(七)柱層析分離(層析柱填料疏水層析，填料為Phenyl S印harose 6FF)
將超濾液用泵送到下料桶，混合上樣，上樣完畢，用pH為7. 8的硫酸銨_磷酸鹽緩 沖液，洗至流出液呈淡黃色，略呈堿性，再用pH為7. 8的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液變混濁， 顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集，洗脫至料液變清，顏 色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率(不小于9000 s/cm)為止。
(八)超濾 將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0. lMpa，濃縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH = 7. 0)最后濃縮 至1/18。(九)過濾、除菌 用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清，在30萬級用0. 22um微孔濾膜
進(jìn)行滅菌過濾。(十)噴干 在干燥塔中，使出口溫度控制在85t:干燥料液，收集酶粉。
實(shí)施例3
( — )鮮蚓清洗 在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10 18小時(shí)， 讓蚯蚓排出污物，用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫 中備用。 (二)磨漿 用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V) 1 : 4的比例加入20%乙醇的pH5. 2的
擰檬酸鈉制成勻槳。
(三)除渣 用沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)鹽析 料液中按30%飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)。
(五)離心 用立式高速離心機(jī)經(jīng)高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液。
(六)超濾 取上清液用50， 000dt膜超濾，得超濾液。(七)柱層析分離(層析柱填料疏水層析，填料為Phenyl S印harose 6FF)
將超濾液用泵送到下料桶，混合上樣，上樣完畢，用pH為8. 0的硫酸銨_磷酸鹽緩 沖液，洗至流出液呈淡黃色，略呈堿性，再用pH為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液變混濁， 顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集，洗脫至料液變清，顏 色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率(不小于9000 ii s/cm)為止。
(八)超濾 將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0. 1Mpa，濃縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH = 7. 0)最后濃縮 至1/16。
7[O105] (九)過濾、除菌 用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清，在30萬級用0. 22um微孔濾膜
進(jìn)行滅菌過濾。
(十)噴干 在干燥塔中，使出口溫度控制在8(TC干燥料液，收集酶粉。
實(shí)施例4
( — )鮮蚓清洗 在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10 18小時(shí)， 讓蚯蚓排出污物，用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫 中備用。 (二)磨漿 用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V) 1 : 5的比例加入20%乙醇的pH5. 0的
擰檬酸鈉制成勻槳。(三)除渣 用沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)鹽禾斤 料液中按30%飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)。
(五)離心 用立式高速離心機(jī)經(jīng)高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液。
(六)超濾 取上清液用50， 000dt膜超濾，得超濾液。(七)柱層析分離(層析柱填料疏水層析，填料為Phenyl S印harose 6FF)
將超濾液用泵送到下料桶，混合上樣，上樣完畢，用pH為7. 4的硫酸銨_磷酸鹽緩 沖液，洗至流出液呈淡黃色，略呈堿性，再用pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液變混濁， 顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集，洗脫至料液變清，顏 色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到磷酸鹽緩沖液電導(dǎo)率(不小于9000 ii s/cm)為止。
(八)超濾 將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21X12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0. 1Mpa，濃縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH = 7. 0)最后濃縮 至1/20。(九)過濾、除菌 用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清，在30萬級用0. 22um微孔濾膜
進(jìn)行滅菌過濾。
(十)噴干 在干燥塔中，使出口溫度控制在86t:干燥料液，收集酶粉。
8
權(quán)利要求
一種蚓激酶生產(chǎn)工藝方法，其特征在于，包括以下步驟(一)鮮蚓清洗在筐中或地面上將蚯蚓上部泥土層層除去，把蚯蚓鋪成薄層，光照10～18小時(shí)，讓蚯蚓排出污物，用自來水在槽中沖洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶裝盛，貯存于冷庫中備用；(二)磨漿用膠體磨將蚯蚓磨成漿液，蚯蚓與按(V/V)1∶3～5的比例加入低濃度乙醇的pH5.0～5.3的檸檬酸鈉制成勻漿；(三)除渣用沉降離心機(jī)將料液中的粗渣去除，制得上清液；(四)鹽析上清液中按30％飽和濃度加入硫酸銨，攪拌完全溶解后靜置1小時(shí)；(五)離心用立式高速離心機(jī)經(jīng)高速離心將料液中細(xì)渣去除，制得清液；(六)超濾取上清液用50,000dt膜超濾，得超濾液；(七)柱層析分離將超濾液用泵送到下料桶，混合上樣，上樣完畢，用洗滌液，洗至流出液呈淡黃色，pH7.0～8.0，略呈堿性，再用洗脫液洗脫，洗脫液變混濁，顏色由黃變紅，流出液電導(dǎo)率比洗脫液電導(dǎo)率略高時(shí)開始收集，洗脫至料液變清，顏色呈淡橙色，電導(dǎo)率達(dá)到洗脫液電導(dǎo)率(不小于9000μs/cm)為止；(八)超濾將收集液倒入貯罐內(nèi)，開泵，調(diào)轉(zhuǎn)速21×12rpm，調(diào)節(jié)壓力不大于0.1Mpa，濃縮至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去離子水脫鹽，至濃縮液呈中性(pH＝7.0)最后濃縮至1/(16～20)；(九)過濾、除菌用澄清型、除菌型液凈濾板過濾3遍，至濾液澄清，在30萬級用0.22um微孔濾膜進(jìn)行滅菌過濾；(十)噴干在干燥塔中，使出口溫度控制在80～86℃干燥料液，收集酶粉。
2. 按照權(quán)利要求l所述生產(chǎn)工藝方法，其特征在于，低濃度乙醇的濃度范圍為5% 30%，優(yōu)先選取10% 20%。
3. 按照權(quán)利要求l所述生產(chǎn)工藝方法，其特征在于柱層析的層析柱，可以為疏水層析 柱、離子層析柱，優(yōu)先選取疏水層析柱。
4. 按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)工藝方法，其特征在于洗滌液的pH值為7. 0 8. 5，優(yōu)先 選取7. 0 8. O，可以為硫酸銨-磷酸鹽緩沖液、硫酸銨-三羥甲基氨基甲烷緩沖液或巴比 妥_氯化鈉緩沖液，優(yōu)先選取硫酸銨_磷酸鹽緩沖液。
5. 按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)工藝方法，其特征在于洗脫液pH值為為7. 0 8. 5，優(yōu)先 選取7. 0 8. O，可以為硫酸銨-三羥甲基氨基甲烷緩沖液、巴比妥_氯化鈉緩沖液或磷酸 鹽緩沖液，優(yōu)先選取磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚓激酶制備工藝方法，其包括磨漿、除渣、鹽析、離心、超濾、柱層析分離、超濾、除菌、噴干等步驟。本發(fā)明提供的蚓激酶制備工藝方法是在將蚯蚓勻漿時(shí)加入乙醇作為助劑通過物理沉降、超濾去除雜蛋白，然后再上柱子層析純化，這樣減少柱子的負(fù)載量，從而提高了蚓激酶的收率、降低了其制備成本，減少了產(chǎn)生需處理的廢液、大大提高了生產(chǎn)能力。本發(fā)明提供的蚓激酶生產(chǎn)工藝方法，具有生產(chǎn)工藝質(zhì)量可控性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
文檔編號C12N9/64GK101760454SQ20091023148
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者張慧英, 李海珍, 董金陵, 路兵 申請人:青島國大藥業(yè)有限公司