專利名稱：3＇-ｏ-熒光修飾的核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有可用化學(xué)方法除去的熒光3 ‘ -0-阻斷基團(tuán)的三磷酸 核苷(3 ‘ -Ο-FL-dNTP)以及使用該物質(zhì)進(jìn)行的DNA測(cè)序方法(邊合成邊測(cè)序 (sequencing-by-synthesis)) 0背景技術(shù)
根據(jù)最近完成的人類基因組工程(HGP)的成功結(jié)果，可獲得人類基因組的信息。 雖然該信息包含人類基因組的共同序列，但其并未在該基因組中呈現(xiàn)出個(gè)體差異。為了獲 得完整的個(gè)體基因組信息，必須對(duì)個(gè)人基因組進(jìn)行分析。由于單倍體人類基因組占有大約 30億個(gè)DNA堿基對(duì)，如果將迄今已被廣泛用于DNA測(cè)序的、基于毛細(xì)管電泳的Sanger方法 用于個(gè)人基因組的測(cè)序，那么為了獲得個(gè)體基因組的信息將會(huì)需要與完成HGP類似的成本 和時(shí)間(G. M Church 等人，Nature Reviews，2004，5，335-344)。自 2004 年以來，美國(guó)國(guó)家 人類基因組研究中心(NationalHuman Genome Research hstitute，NHGRI，USA)支持了能 夠使每一個(gè)體的全基因組測(cè)序成本顯著降低的技術(shù)的發(fā)展，特別是短期成本達(dá)到100，000 美元以及長(zhǎng)期成本達(dá)到1，000美元的技術(shù)。于是，能夠以大約50，000美元的成本進(jìn)行個(gè)體 全基因組測(cè)序的測(cè)序平臺(tái)目前已經(jīng)商品化。這類設(shè)備基于兩個(gè)主要的技術(shù)焦磷酸測(cè)序以 及邊合成邊測(cè)序(SBS)。由454 Life Sciences，Roche公司提供的GS TLX鈦系列設(shè)備是 以焦磷酸測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)。其可在10小時(shí)內(nèi)分析4-6億個(gè)堿基并可立即對(duì)長(zhǎng)鏈(大約200 個(gè)核苷酸)進(jìn)行比較分析。而由Solexa公司提供的基因組分析器則是以SBS技術(shù)為基礎(chǔ)。
本發(fā)明所直接涉及到的邊合成邊測(cè)序(SBQ使用的是熒光標(biāo)記的核苷酸。特別是 根據(jù)所述的技術(shù)，用聚合酶將每個(gè)核苷酸引入到DNA引物中，然后測(cè)定來自核苷酸的熒光 信號(hào)以鑒別該核苷酸的堿基并可同時(shí)分析其互補(bǔ)堿基(參見圖2)。
用于SBS的三磷酸核苷(dNTP)基本上為雙修飾的可逆終止子(DRT)，這些雙修飾 的可逆終止子是在三磷酸核苷的3' -OH部分具有可逆的阻斷基團(tuán)(3 ‘ -0-阻斷基團(tuán))以 及在堿基上具有熒光團(tuán)(FL)的修飾的三磷酸核苷(參見圖1左圖)。此時(shí)，4種堿基(A、 T、G和C)使用發(fā)出不同波長(zhǎng)的光的不同熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。將目標(biāo)DNA作為用于利用此類 修飾的三磷酸核苷進(jìn)行聚合反應(yīng)的模板。然后，一旦用DNA聚合酶將核苷酸引入到引物鏈 當(dāng)中，由于所引入核苷酸的3' -0-阻斷基團(tuán)的作用，其他三磷酸核苷就不能引入到這個(gè)鏈 當(dāng)中。然后，對(duì)連接到所引入核苷酸堿基上的熒光團(tuán)的熒光進(jìn)行測(cè)定，來鑒別所引入核苷酸 的堿基，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該模板鏈的互補(bǔ)核苷酸序列的分析。當(dāng)除去所述的熒光團(tuán)和3' -0-阻 斷基團(tuán)時(shí)，則重新獲得了游離的3' -OH官能團(tuán)，從而使隨后的核苷酸可以引入。所引入核 苷酸的堿基可以用如上所述的相同方法進(jìn)行鑒別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)模板鏈的測(cè)序。這一逐步測(cè) 序的過程被稱作“邊合成邊測(cè)序(SBS) ”。
用于商品SBS的雙修飾的可逆終止子(DRT)具有通過炔鍵連接到堿基上的熒光基 團(tuán)。在這種情況下，即使將3' -0-阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)在DRT插入和測(cè)序后除去，將熒光 基團(tuán)連接到堿基上的連接鍵部分仍然殘留在上面。該殘留部分被稱作分子疤(molecularscar) 0隨著測(cè)序的進(jìn)行，新聚合的鏈包含有更多分子疤。由于此類分子疤的累積降低了隨 后聚合酶的活性和保真度，導(dǎo)致所測(cè)序的堿基的數(shù)目受到限制。由于該問題的存在，相比于 基于焦磷酸測(cè)序的方法，SBS已知具有相對(duì)較短的讀取長(zhǎng)度，大約25-35個(gè)堿基。因此，當(dāng) 對(duì)打斷成為若干用于SBS的短片段的長(zhǎng)鏈多聚核苷酸進(jìn)行分析時(shí)，這一限制會(huì)增加分析多 核苷酸片段的錯(cuò)誤機(jī)率。
要成功地進(jìn)行SBS有兩個(gè)重要因素。首先，需要能夠以幾乎完全的效率引入DRT的 聚合酶。其次，3' -0-阻斷基團(tuán)和連接到堿基上的熒光團(tuán)必須在水溶液中以幾乎完全的效 率除去而不破壞DNA。天然的DNA聚合酶已經(jīng)進(jìn)化了很長(zhǎng)時(shí)間，因而選擇性地接受具有游離 3' -OH的三磷酸核苷。因此，它們不接受在3' -OH上具有阻斷基團(tuán)的底物。在早期的研 究中，Sarfati等人在1994年報(bào)道了用多種聚合酶(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶和DNA聚 合酶I的Klenow片段)將具有3' -0-鄰氨基苯甲酸酯(ester anthranylic)阻斷基團(tuán)的 三磷酸核苷引入到DNA鏈中，然后通過利用酯酶切斷酯鍵來繼續(xù)聚合反應(yīng)，從而重新獲得 游離的 3' -OH 官能團(tuán)(Sarfati 等人，Gene，1994，148 :1-6)。同年，Μ. L. Metzker 等人報(bào)道 了他們可以觀察到在聚合酶(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、 測(cè)序酶、Bst DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、Vent (exo_) DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶 以及Pfu(eX0-)DNA聚合酶)的作用下，包含連接有不同阻斷基團(tuán)的3' -OH基團(tuán)的三磷酸 核苷的插入，因此，可通過某些聚合酶插入具有3' -0-甲基和3' -0-(2-硝基芐基)的三 磷酸核苷，從而暫時(shí)終止聚合反應(yīng)(M. L. Metzker等人，Nucleic Acids Research, 1994,22 4259-4267)。然而，就進(jìn)行連續(xù)聚合的效率和保真度而言，上述現(xiàn)有技術(shù)并不適用于SBS。
聚合酶不能接受具有大體積的3' -0-阻斷基團(tuán)的三磷酸核苷作為反應(yīng)底物的原 因可通過在天然聚合酶的活性部位中僅為3' -OH基團(tuán)提供狹窄的空間進(jìn)行解釋(Burgess 等人，A Chemistry European Journal，1999，5 :951-960)。為了用具有 3' -0-阻斷基 團(tuán)的三磷酸核苷廣泛地進(jìn)行SBS，需要適當(dāng)修飾的聚合酶，該聚合酶在其活性部位中在 3' -OH基團(tuán)周圍具有較大的空間。最近，哥倫比亞大學(xué)Ju教授的小組用3' -0-烯丙基 化的三磷酸核苷和3' -0-疊氮甲基化的三磷酸核苷進(jìn)行了 SBS (Seo等人，PNAS,2005, 102 :5926-5931 ;Guo 等人，PNAS，2008，105 :9145-9150)。為了插入此類具有 3' -0-阻斷 基團(tuán)的核苷酸，上述小組使用了收集自東太平洋火山口的菌株中獲得的修飾DNA聚合酶 (Southworth等人，PNAS，1996，93 =5281-5285)。該修飾的DNA聚合酶目前在市面上有售，其 商標(biāo)名禾爾為"Therminator II，，，由 New England Biolabs Inc.提供。HelicosBiosciences Corp.的Kwiatkowski等人設(shè)計(jì)了 3 ‘ -0-烴基二硫甲基三磷酸核苷用于SBS (Kwiatkowski 等人，2007，US20077279563)，而 Caliper LifeSciences, Inc.的 Parce 等人使用了包含磷 酸酯基團(tuán)或氨基甲酸酯基團(tuán)的阻斷基團(tuán)(Parce等人，2006，US20067105300)。
如果SBS能夠不用雙修飾的可逆終止子而是利用單修飾的可逆終止子(MRT)，其 中在3' -OH基團(tuán)上的該可逆阻斷基團(tuán)起到雙重作用，既作為熒光信號(hào)的報(bào)道子又作為可 逆終止子，那么將不再需要核苷堿基(nucleobase)上的熒光標(biāo)記。在從3' -OH部分除去 熒光阻斷基團(tuán)后，MRT能夠隨即轉(zhuǎn)變回自然狀態(tài)而沒有殘留的分子疤(參見圖1右圖)。然 而，這一使用MRT和常規(guī)的聚合酶進(jìn)行測(cè)序的原理尚未實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的發(fā)明者證實(shí)能夠按如下過程成功地進(jìn)行SBS，從而完成了本發(fā)明(1) 設(shè)計(jì)具有既起到阻斷基團(tuán)作用又能夠發(fā)出熒光信號(hào)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的MRT，該化學(xué)結(jié)構(gòu)位于其3' -OH基團(tuán)而非堿基，以及(2)用常規(guī)的聚合酶插入所述的MRT —通過識(shí)別3' -0-熒光 阻斷基團(tuán)的熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序一除去所述的熒光阻斷基團(tuán)一再次插入所述的MRT(參見圖 2)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種單修飾的可逆終止子(MRT)以及使用該物質(zhì)進(jìn)行 測(cè)序的方法(邊合成邊測(cè)序)，所述的可逆終止子為在其3' -OH基團(tuán)處具有可用化學(xué)方法 除去的、能夠發(fā)出熒光信號(hào)的可逆阻斷基團(tuán)的三磷酸核苷。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種修飾的三磷酸核苷(dNTP)，所述的三磷酸 核苷在該修飾的三磷酸核苷的3' -OH基團(tuán)處具有可通過物理作用或化學(xué)反應(yīng)除去的可逆 熒光基團(tuán)，所述的三磷酸核苷具有核糖或脫氧核糖作為糖的骨架結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了一種使用所述的核苷酸單體或其多聚體進(jìn)行測(cè)序的方法。
此外，本發(fā)明提供了一種用于邊合成邊測(cè)序(SBS)的測(cè)序試劑盒，該試劑盒包含 所述的核苷酸單體或其多聚體。


參考附圖可以更好地理解對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的應(yīng)用，其中
圖1為一組圖，示意了雙修飾的可逆終止子(DRT)，該可逆終止子是用于常規(guī)的邊 合成邊測(cè)序(SBQ技術(shù)的三磷酸核苷，在該三磷酸核苷的3' -OH基團(tuán)上帶有可逆阻斷基 團(tuán)、且在核苷堿基上帶有熒光基團(tuán)(熒光團(tuán))；圖1還示意了單修飾的可逆終止子(MRT)，該 可逆終止子是用于本發(fā)明所述的SBS的三磷酸核苷，在該三磷酸核苷的3' -OH基團(tuán)上帶有 同時(shí)起到熒光信號(hào)報(bào)道子和可逆終止子雙重作用的可逆阻斷基團(tuán)。
圖2為顯示邊合成邊測(cè)序(SBQ的過程的圖，包括下列步驟用聚合酶將單修飾的 可逆終止子(MRT)插入；通過測(cè)定來自熒光3' -0-阻斷基團(tuán)的熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序；以及插 入第二個(gè)MRT。
圖3為一組圖(a)為引物在與聚合酶和MRT反應(yīng)以前的MALDI-T0F質(zhì)譜；(b) 為通過聚合酶使MRT延伸的引物的MALDI-T0F質(zhì)譜；(c)為含有延伸的MRT的引物在從 3'端除去熒光阻斷基團(tuán)后的MALDI-T0F質(zhì)譜；以及(d)為含有再次延伸的MRT的引物的 MALDI-T0F質(zhì)譜，所述的再次延伸是在除去熒光阻斷基團(tuán)后通過聚合酶進(jìn)行的(藍(lán)色圓圈 3'端的熒光阻斷基團(tuán))。
圖4為顯示通過聚合酶在引物中進(jìn)行MRT延伸之前(實(shí)線)以及之后(虛線)的 熒光強(qiáng)度測(cè)量結(jié)果的曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述。
本發(fā)明提供了一種新的化合物或其鹽，其具有下列式1的結(jié)構(gòu)
[式1]
權(quán)利要求
1.一種核苷酸單體，所述的核苷酸單體在三磷酸核苷的3' -OH部分具有可通過物理 方法或化學(xué)方法除去的可逆熒光基團(tuán)，所述的三磷酸核苷含有核糖或脫氧核糖作為糖的骨 架結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸單體，其中所述的可逆熒光基團(tuán)為熒光團(tuán)本身，或是由 所述的熒光團(tuán)與將所述熒光團(tuán)連接到所述3' -OH部分的連接子組成。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸單體，其中所述的熒光團(tuán)選自于由下列物質(zhì)所組成的 組香豆素、AlexaFluor, Bodipy、熒光素、四甲基羅丹明、Cy5、Cy3、得克薩斯紅以及這些物 質(zhì)的衍生物。
4.如權(quán)利要求2所述的核苷酸單體，其中所述的連接子選自于由下列物質(zhì)所組成的 組烷基、烯丙基、疊氮甲基、二硫基、2-硝基芐基或4-硝基芐基及其混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的核苷酸單體，其中所述的單體包括由式2表示的化合物式2中，R1為三磷酸酯基團(tuán)，R2為核苷堿基，R3為熒光團(tuán)，以及R4為氫或羥基。
6.一種測(cè)序方法，所述的測(cè)序方法包括下列步驟(1)合成如權(quán)利要求1所述的核苷酸單體；(2)以目標(biāo)核苷酸鏈作為模板，使用步驟(1)所述的核苷酸單體以及DNA聚合酶或RNA 聚合酶將引物延伸一個(gè)核苷酸；(3)通過測(cè)定熒光信號(hào)，對(duì)延伸后的核苷酸鏈中的堿基進(jìn)行鑒別，所述的熒光信號(hào)來自 于可逆的熒光阻斷基團(tuán)，所述的熒光阻斷基團(tuán)連接到由步驟O)的聚合反應(yīng)所產(chǎn)生的延伸 后的核苷酸鏈的3' -OH基團(tuán)上；(4)除去來自于步驟(3)中延伸后的核苷酸鏈的可逆的熒光阻斷基團(tuán)，然后復(fù)原為游 離的3' -OH基團(tuán)，從而繼續(xù)進(jìn)行聚合反應(yīng)；以及(5)重復(fù)步驟( 至步驟G)，從而對(duì)目標(biāo)模板進(jìn)行測(cè)序。
7.如權(quán)利要求6所述的測(cè)序方法，其中步驟(2)中所述的模板核酸鏈選自于由基因組 DNA、質(zhì)粒和寡聚核苷酸所組成的組。
8.如權(quán)利要求6所述的測(cè)序方法，其中步驟(2)所述的聚合酶選自于由嗜熱聚合酶、嗜 溫聚合酶及其突變體所組成的組。[式2]
9.如權(quán)利要求6所述的測(cè)序方法，其中步驟(3)中所述的熒光信號(hào)通過下列方法進(jìn)行 測(cè)定測(cè)量固定有所述模板的雙鏈DNA和引物的固相的熒光或測(cè)量含有所述雙鏈DNA的溶 液的熒光。
10.如權(quán)利要求6所述的測(cè)序方法，其中步驟(4)中所述的可逆熒光基團(tuán)優(yōu)選通過使用 化學(xué)試劑或酶或照射的方法除去。
11.一種用于邊合成邊測(cè)序(SBQ的試劑盒，所述的試劑盒含有如權(quán)利要求1所述的核 苷酸單體或其多聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用在其3′-OH端帶有熒光阻斷基團(tuán)的三磷酸核苷作為可逆終止子進(jìn)行DNA測(cè)序的方法。進(jìn)一步地講，本發(fā)明涉及使用單修飾的可逆終止子(MRT)進(jìn)行邊合成邊測(cè)序的方法，這種新的核苷酸單體在其3′-OH端具有可用化學(xué)方法或酶方法除去的可逆的熒光阻斷基團(tuán)。本發(fā)明的測(cè)序方法通過用該核苷酸單體終止核苷酸鏈的延伸，然后測(cè)定由3′-OH端所發(fā)出的熒光信號(hào)從而促進(jìn)了所插入堿基的測(cè)序。此時(shí)，在對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析后，連接到3′-OH端的阻斷基團(tuán)被可有效地除去，這表明可以成功復(fù)原游離的3′-OH官能團(tuán)，以使隨后的單體插入成為可能，從而可以進(jìn)行連續(xù)的測(cè)序。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102030792SQ200910205998
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者安大魯, 安熙喆, 申東潤(rùn) 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院