專利名稱：：興國(guó)紅鯉與“全紅”體色甌江彩鯉的分子遺傳鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及兩種紅鯉的分子鑒別方法，具體地講，涉及興國(guó)紅鯉(Cyrpinuscarpiovar.singuonensis)禾口"全纟工，，亍本色B^工彩魚(yú)里(Cyrpinuscarpiovar.color)分子遺傳鑒別方法。
背景技術(shù)：
：興國(guó)紅鯉(圖1)分布于江西省興國(guó)縣，是我國(guó)優(yōu)良的魚(yú)類育種材料，參與構(gòu)建了生產(chǎn)上許多具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益的雜交組合，產(chǎn)生了巨大的生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。甌江彩鯉分布于浙江省甌江流域，是一種養(yǎng)殖面積較為廣泛，具有食用和觀賞雙重價(jià)值的多體色類型彩鯉。甌江彩鯉目前已具有7種體色(5種原有的體色類型，2種近幾年開(kāi)發(fā)出來(lái)的新體色類型)。甌江彩鯉除體色豐富外，在形態(tài)上與興國(guó)紅鯉十分相似，均為紡綞形。其中"全紅"體色甌江彩鯉(圖2)的體表全身紅色，從形態(tài)和體色上不能將其與興國(guó)紅鯉區(qū)別開(kāi)來(lái)。表1為興國(guó)紅鯉與"全紅"體色甌江彩鯉外部形態(tài)可量性狀的比例變化。表1興國(guó)紅鯉與"全紅"體色甌江彩鯉外部形態(tài)的可量性狀比例<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>自上世紀(jì)70年代以來(lái)，對(duì)興國(guó)紅鯉開(kāi)展了系統(tǒng)選育工作，它已成為一個(gè)優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，品種登記號(hào)GS01001-1996。自2000年以來(lái)，也對(duì)甌江彩鯉開(kāi)展了選育工作，目前已選育至第5代，即將選育成為一個(gè)水產(chǎn)良種。為保護(hù)兩個(gè)魚(yú)類良種的育種成果與知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為以后養(yǎng)殖生產(chǎn)提供一種有效的品種鑒定方法，發(fā)明人在對(duì)通過(guò)多年的研究，發(fā)現(xiàn)這兩種魚(yú)在線粒體COII基因和tRNA一基因各存在一個(gè)特異性的單核苷酸差異位點(diǎn)(SNP)，可以用于它們的群體鑒定和品種區(qū)分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鑒別興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉的群體區(qū)分和品種鑒別方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種鑒別興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉的分子遺傳鑒別方法，包括下列步驟(1)根據(jù)外部形態(tài)取出待鑒定的紅鯉；(2)提取待鑒定的紅鯉的基因組DNA;(3)以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)COII基因和tRNA一基因設(shè)計(jì)引物以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，純化和克隆，其中擴(kuò)增片段包含C0II基因的第408位和tRNA一基因第16位核苷酸；(4)測(cè)序擴(kuò)增的目的DNA序列，進(jìn)行序列比對(duì)；(5)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，進(jìn)行結(jié)果判定(a)檢測(cè)CO1I基因的第408位點(diǎn)(COII-408)，若該位點(diǎn)為核苷酸G，則為興國(guó)紅鯉；若該位點(diǎn)為核苷酸A，則為"全紅"體色甌江彩鯉；或者(b)檢測(cè)tRNALys基因第16位點(diǎn)(tRNALys-16)來(lái)加以確證，若位點(diǎn)tRNA"M6為核苷酸T，則為興國(guó)紅鯉，若為核苷酸C，則為"全紅"體色甌江彩鯉。所述引物序列為C0II-tRNALys-F(5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA_3，)禾口C0II-tRNALys-R(5，-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA_3，)。還可以采用其它能進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物。COII基因和tRNA一基因的SNP位點(diǎn)如下表2所示表2C0II基因和tRNA"s基因的SNP位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發(fā)明方法是通過(guò)擴(kuò)增紅鯉線粒體DNA的COII基因和tRNA"s基因序列，檢測(cè)這兩個(gè)基因序列的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉，從而為我國(guó)這兩種紅鯉的品種保護(hù)和遺傳管理提供一種技術(shù)手段，具有極強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。圖1是興國(guó)紅鯉的照片。圖2是"全紅"體色甌江彩鯉的照片。具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1通過(guò)本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行驗(yàn)證。(1)取興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉樣本選取興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉各30尾，有足夠數(shù)量，因此獲得的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，準(zhǔn)確可靠。(2)DNA提取取每尾魚(yú)的尾鰭組織約0.2cm2，裝入1.5ml的離心管中，加入400yLSTE緩沖液(30mmol/LTris_HCl，pH8.0，200mmol/LEDTA，50mmol/LNaCl)?；靹蚝蠹尤霛舛葹?0%的SDS90iiL和20mg/mL的蛋白酶K10yL，55"消化810h;加入等體積飽和酚于轉(zhuǎn)輪上緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)lh，10，000r/min離心8min，吸取上清液加入等體積的混合液(酚氯仿異戊醇=25:24:1);緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)30min，以10，000r/min的速度離心8min，取上清液加入等體積的氯仿和異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1)，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)5min，10，000r/min離心5min，取上清液后，加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗滌，干燥，加入300yL的TE液溶解備用。(3)PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物克隆、測(cè)序根據(jù)已有鯉線粒體基因組全序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增COII基因和tRNA一基因的引物，引物序列為COII-tRNALys-F(正向引物)5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA-3'和COII-tRNALys-R(反向引物)5'-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3'。以提取的DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為50yL，內(nèi)含5iiLPCR緩沖液(1Ommol/LTris-HCL，pH9.0，50mmol/LKCL，30mmol/LMgCL2，0.01%的明膠)，2iiLdNTP混合液(每種dNTP0.lmmol/L)，4iiL的弓|物(0.2iimol/L)，2iiL基因組DNA(50ng/ii1)，2iiLTaq酶(2IU)，35yL的蒸餾水。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min，接下來(lái)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C30s，54°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)后，72。C延伸5min。擴(kuò)增的目的序列產(chǎn)物以瓊脂糖電泳檢查，觀察只有一條擴(kuò)增產(chǎn)物片段。純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接插入載體pUC18，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，篩選重組子進(jìn)行內(nèi)切酶酶切和PCR檢驗(yàn)。然后選取重組子于3730型Bigdye-Terminator全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。(4)測(cè)序擴(kuò)增的目的DNA序列，進(jìn)行序列比對(duì)用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行重排和同源比較，與GenBank中的鯉線粒體DNA全序列(序列號(hào)NC_001606)對(duì)照，確定COII基因的啟始位置和啟始密碼子ATG。在COII基因最后一個(gè)氨基酸的密碼子GCC+T不完全終止子后(GCCT)，緊接著的是tRNA一基因的開(kāi)始位點(diǎn)CGC。兩種紅鯉的COII基因和tRNA"s基因序列分別為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。(5)篩選核苷酸變異位點(diǎn)查找上述單核苷酸變異位點(diǎn)，根據(jù)位點(diǎn)差異鑒定這兩種紅鯉。首先檢測(cè)COII基因的第408位點(diǎn)(COII-408)，發(fā)現(xiàn)30尾興國(guó)紅鯉的該位點(diǎn)都為核苷酸G，30尾"全紅"體色甌江彩鯉的該位點(diǎn)都為核苷酸A。進(jìn)一步檢測(cè)tRNALys基因第16位點(diǎn)(tRNALys-16)來(lái)加以確證，發(fā)現(xiàn)30尾興國(guó)紅鯉的該位點(diǎn)為核苷酸T，30尾"全紅"體色甌江彩鯉的該位點(diǎn)都為核苷酸C。通過(guò)以上實(shí)施例表明，本發(fā)明方法對(duì)于鑒別興國(guó)紅鯉和"全紅"體色甌江彩鯉是準(zhǔn)確可行的。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。序列表〈110〉上海海洋大學(xué)〈120〉興國(guó)紅鯉與"全紅"體色甌江彩鯉的分子遺傳鑒別技術(shù)〈130>TXPI091938〈160>2〈210>1〈211>768〈212>DNA〈213>興國(guó)紅鯉〈400〉1ATGGCACACCCMCGCMCTAGGTTTCCMGACGCGGCCATACCCGTTATAGMGMCTT60CTTCACTTCCACGACCACGCATTMTMTTGTGCTCCTMTTAGCACTTTAGTGTTATAT120ATTATTACTGCMTGGTATCMCCAMCTTACTMTAMTATATTCTAGACTCCCMGM180ATCGAMTTGTATGMCCATTCTACCAGCCGTCATTTTAGTACTMTCGCCCTGCCCTCC240CTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAMTTMCGACCCTCACCTGACMTTAMGCMTA300GGACACCMTGATACTGMGTTACGAGTATACAGACTATGMMTCTAGGATTCGACTCC360TATATAGTACCMCCCMGACCTTGCCCCCGGACMTTCCGACTTCTGGAMCAGACCAC420CGMTAGTTGTTCCMTAGAATCCCCAGTCCGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA■CATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTAMMTGGACGCAGTCCCAGGACGACTAMT540CMGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGTGTTTTACGGACMTGCTCTGAMTTTGT600GGAGCTMTCACAGCTTTATACCMTTGTAGTTGMGCAGTACCTCTCGAACACTTCGM660MCTGATCCTCATTMTACTAGMGACGCCTCGCTAGGMGCTAMTATTGGACAMGCG720TTGGCCTTTTMGCCAMGATTGGTGATTCCCGACCACCTCTAGTGM768〈210>2〈211>768〈212>DNA〈213〉"全紅"體色甌江彩鯉〈400>2ATGGCACACCCMCGCMCTAGGTTTCCMCTTCACTTCCACGACCACGCATTMTMTTATTATTACTGCMTGGTATCMCCAMCTTATCGAMTTGTATGMCCATTCTACCAGCCCTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAMTTGGACACCMTGATACTGMGTTACGAGTATTATATAGTACCMCCCMGACCTTGCCCCCCGMTAGTTGTTCCMTAGAATCCCCAGTCCATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTACMGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGGAGCTMTCACAGCTTTATACCMTTGTAMCTGATCCTCATTMTACTAGMGACGCCTTGGCCTTTTMGCCAMGATTGGTGATTCGACGCGGCCATACCCGTTATAGMGMCTT60GTGCTCCTMTTAGCACTTTAGTGTTATAT120ACTMTAMTATATTCTAGACTCCCMGM180GTCATTTTAGTACTMTCGCCCTGCCCTCC240MCGACCCTCACCTGACMTTAMGCMTA300ACAGACTATGMMTCTAGGATTCGACTCC360GGACMTTCCGACTTCTAGAMCAGACCAC420CGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA■MMTGGACGCAGTCCCAGGACGACTAMT540GTGTTTTACGGACMTGCTCTGAMTTTGT600GTTGMGCAGTACCTCTCGAACACTTCGM660TCGCTAGGMGCTAMCATTGGACAMGCG720CCGACCACCTCTAGTGM768權(quán)利要求一種鑒別興國(guó)紅鯉和“全紅”體色甌江彩鯉的分子遺傳鑒別方法，包括下列步驟(1)根據(jù)外部形態(tài)取出待鑒定的紅鯉；(2)提取待鑒定的紅鯉的基因組DNA；(3)以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)COII基因和tRNALys基因設(shè)計(jì)引物以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，純化和克隆，其中擴(kuò)增片段包含COII基因的第408位和tRNALys基因第16位核苷酸；(4)測(cè)序擴(kuò)增的目的DNA序列，進(jìn)行序列比對(duì)；(5)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，進(jìn)行結(jié)果判定(a)檢測(cè)COII基因的第408位點(diǎn)(COII-408)，若該位點(diǎn)為核苷酸G，則為興國(guó)紅鯉；若該位點(diǎn)為核苷酸A，則為“全紅”體色甌江彩鯉；或者(b)檢測(cè)tRNALys基因第16位點(diǎn)(tRNALys-16)來(lái)加以確證，若位點(diǎn)tRNALys-16為核苷酸T，則為興國(guó)紅鯉，若為核苷酸C，則為“全紅”體色甌江彩鯉。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述引物序列為C0II-tRNALys-F(5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA_3，)和C0II-tRNALys-R(5，-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA_3，)。全文摘要本發(fā)明涉及興國(guó)紅鯉(Cyrpinuscarpiovar.singuonensis)與“全紅”體色甌江彩鯉(Cyrpinuscarpiovar.color)的分子遺傳鑒別方法，包括下列步驟(1)根據(jù)外部形態(tài)取出待鑒定的紅鯉；(2)提取待鑒定的紅鯉的基因組DNA；(3)以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)COII基因和tRNALys基因設(shè)計(jì)引物以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，純化和克隆，其中擴(kuò)增片段包含COII基因的第408位和tRNALys基因第16位核苷酸；(4)測(cè)序擴(kuò)增的目的DNA序列，進(jìn)行序列比對(duì)；(5)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，進(jìn)行結(jié)果判定。采用所述的方法可有效、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別，從而為我國(guó)紅鯉的遺傳甑別、資源管理與保護(hù)提供一項(xiàng)技術(shù)手段，具有實(shí)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101787392SQ20091019743公開(kāi)日2010年7月28日申請(qǐng)日期2009年10月20日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者王成輝申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)