專(zhuān)利名稱(chēng)：平行檢測(cè)多種上呼吸道病毒的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種平行檢測(cè)多種呼吸道病毒的基因芯片，尤其涉及利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測(cè)并分辨多種呼吸道病毒，屬于基因芯片和診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
急性呼吸道感染是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病，多發(fā)病，其主要原因是由各種呼吸道病毒引起的，常見(jiàn)的是甲型流感病毒(包括H1，H3，H5亞型)，乙型流感病毒，副流感病毒(包括甲型，乙型，丙型，丁型)，呼吸道融合病毒(包括甲型，乙型)，鼻病毒，腸道病毒，OC43型冠狀病毒，非典型肺炎綜合癥冠狀病毒，229E型冠狀病毒，人類(lèi)偏肺病毒，肺炎支原體，肺炎衣原體，嗜肺軍團(tuán)桿菌，腺病毒等。其臨床表現(xiàn)類(lèi)似，如鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，輕度咽炎，全身發(fā)熱等癥狀。
目前，檢測(cè)以上呼吸道感染主要病毒，國(guó)內(nèi)外多采用病毒分離，間接免疫熒光法，酶聯(lián)免疫吸附法，多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，PCR及核酸雜交等多種檢測(cè)手段。由于可能的病原體種類(lèi)很多，而病毒的分離培養(yǎng)不僅周期長(zhǎng)而且成本較高，技術(shù)上也比較困難。用免疫學(xué)檢測(cè)方法也很難快速確定病原體。而現(xiàn)在流行方法的共同局限性是一次只能檢測(cè)一種單一的病毒，而檢測(cè)方法的靈敏性不夠高。
近年來(lái)，分子生物學(xué)方法，特別是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的檢測(cè)方法在病毒檢測(cè)領(lǐng)域得到迅猛的發(fā)展，成為病毒檢測(cè)的一項(xiàng)革命性技術(shù)。PCR技術(shù)檢測(cè)方法不僅速度快，靈敏度高，而且可以同時(shí)擴(kuò)增多種病毒?；蛐酒菓?yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒谝晃⑿〉幕砻婕闪舜罅康姆肿幼R(shí)別探針，能夠在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因。而結(jié)合PCR技術(shù)和基因芯片，可以準(zhǔn)確快速的鑒別呼吸道感染病原體。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測(cè)并分辨多種呼吸道病毒。其優(yōu)勢(shì)在于，使用同一反應(yīng)與芯片，可以平行一次檢測(cè)20種常見(jiàn)的呼吸道病毒，其操作簡(jiǎn)單，快捷，特異性強(qiáng)，靈敏度高。
本發(fā)明的主要目的在于，提供一種具有相近Tm值，涵蓋檢測(cè)型別多，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因檢測(cè)與分型，達(dá)到省時(shí)省力和檢測(cè)精確的目的。
本發(fā)明具有與呼吸道常見(jiàn)病毒DNA/RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針，其中探針序列選自SEQ ID Nos1-21。為加強(qiáng)探針與基質(zhì)的結(jié)合度，每條探針都經(jīng)過(guò)5’末端胺基與多聚polyT修飾。本發(fā)明針對(duì)20種感染源設(shè)計(jì)了21種探針，各探針有著合理的堿基成分，Tm值相對(duì)比較均一，即21種型別探針和對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交時(shí)最適宜的溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度下的同步性，不會(huì)因?yàn)闇囟鹊膯?wèn)題而影響雜交的結(jié)果，使檢查的準(zhǔn)確性大大增加。
本發(fā)明在RNA和DNA提取后，對(duì)于RNA病毒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后使用有生物素標(biāo)記的簡(jiǎn)并引物，對(duì)樣本的DNA/cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。用于擴(kuò)增樣本序列的引物，正向有生物素標(biāo)記，其序列針對(duì)不同常見(jiàn)病毒，分別為SEQ ID Nos22-63。選用的引物對(duì)各自的擴(kuò)增型別都有很高的靈敏度，增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
所選用的探針(SEQ ID Nos1-21)與引物(SEQ ID Nos22-63)含有簡(jiǎn)并序列，其縮略如下M，A/C；R，A/G；W，A/T；S，C/G；Y， C/T；K，G/T；V， A/C/G；H，A/C/T；D，A/G/T；N，A/C/G/T。



圖1基因芯片上一種基因矩陣的排列情況，顯示基因矩陣中探針與質(zhì)控點(diǎn)的分布。(1，基因芯片；2，探針區(qū)域；3，定位點(diǎn)；4，陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)；5，陰性指控點(diǎn)；其他為特異性探針) 圖2基因芯片雜交流程示意圖
具體實(shí)施例方式 結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明 實(shí)施例一膜條基質(zhì)的基因芯片檢測(cè)20種呼吸道常見(jiàn)病毒 在此例中，使用邊長(zhǎng)為6.0毫米方形尼龍膜為基質(zhì)的基因芯片。探針排列為6x5矩陣，包括21種特異性探針、1種陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)探針、1種陰性指控點(diǎn)探針與3個(gè)定位點(diǎn)探針。如圖1，矩陣點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔為600微米。
所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟 (1)探針的制備合成與目標(biāo)DNA/RNA互補(bǔ)的5’末端經(jīng)過(guò)胺基化；選取特異性的針對(duì)20種呼吸道病毒。
(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上，通過(guò)探針末端的胺基與活化膜上的羧基形成共價(jià)結(jié)合，牢固地將探針固定在膜上。固定之后，將未結(jié)合的膜表面封閉。
基因芯片雜交檢測(cè)流程如圖2所示。此例結(jié)合多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，將目標(biāo)DNA以倍數(shù)擴(kuò)增。引物以生物素標(biāo)記，擴(kuò)增后，帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)堿變性，中和后可被相對(duì)應(yīng)的固定于基因芯片上的特異性探針?biāo)东@。雜交完成后，通過(guò)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素及其特異性底物TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)的顯色反應(yīng)得出結(jié)果。對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行分析，在短時(shí)間內(nèi)給出基因型別資料。
平行檢測(cè)多種上呼吸道病毒的基因芯片.ST25SEQUENCE LISTING
<110>港龍生物科技有限公司
<120>平行檢測(cè)多種上呼吸道病毒的基因芯片
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ccrgccarha chcccatrtt dcchgt2權(quán)利要求
1.一種具有與目標(biāo)DNA/RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針以矩陣形式排列的基因芯片結(jié)合多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的平行檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的基因芯片可以是以尼龍膜為基質(zhì)，或以硅片為基質(zhì)，或以玻璃片為基質(zhì)，或以塑膠片為基質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的平行檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的基因芯片以尼龍膜為基質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的平行檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對(duì)基因分析和分型的特異性探針陣列。
5.如權(quán)利要求1所述的平行檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對(duì)20種呼吸道常見(jiàn)病毒進(jìn)行基因分析和分型的特異性探針陣列，其探針序列選自SEQ ID Nos1-21。
6.如權(quán)利要求1所述的平行檢測(cè)基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對(duì)21種呼吸道常見(jiàn)病毒進(jìn)行基因分析和分型的特異性正反引物，其探針序列選自SEQ ID Nos22-63。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種平行檢測(cè)多種呼吸道病毒的基因芯片，尤其涉及利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)合多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測(cè)并分辨20多種呼吸道常見(jiàn)病毒。基因芯片可以是以尼龍膜，硅片，玻璃片或塑膠片為基質(zhì)，含有針對(duì)基因分型的特異性探針陣列(1，基因芯片；2，探針區(qū)域；3，定位點(diǎn)；4，陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)；5，陰性指控點(diǎn)；其他為特異性探針)；本發(fā)明充分結(jié)合了基因芯片一次能同時(shí)檢測(cè)一份樣品中多個(gè)基因的優(yōu)點(diǎn)和多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異性強(qiáng)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，具有平行檢測(cè)型別涵蓋面廣。其操作簡(jiǎn)單，快捷，特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101613767SQ20091016497
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者楊夢(mèng)甦, 曾志雄, 季晟琳 申請(qǐng)人:港龍生物科技有限公司