專利名稱：：具有改變的免疫原性的枯草桿菌酶和枯草桿菌酶變體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有改變了的免疫原性的枯草桿菌酶(subtilase)和枯草桿菌酶變體及其用途，還涉及產(chǎn)生所說枯草桿菌酶和枯草桿菌酶變體的方法。
背景技術：
：包括酶在內(nèi)的越來越多蛋白質(zhì)正在通過工業(yè)化方式生產(chǎn)并用于各種工業(yè)、家務管理和醫(yī)藥中。作為蛋白質(zhì)，它們很可能刺激人和動物體內(nèi)的免疫反應，如變態(tài)反應。已進行了各種嘗試以改變蛋白質(zhì)的免疫原性。通常這種改變只局限于蛋白質(zhì)中負責誘導免疫反應的部分，即，表位。表位由多個氨基酸組成，這些氨基酸在一級序列中可以是連續(xù)的，但更常見的是在蛋白質(zhì)的三維結構中相互間處于鄰近的位置。已發(fā)現(xiàn)在表位中的小變化就可能影響它與抗體的結合。這可能導致該表位的重要性降低，可能將其從高親合力表位轉變成低親合力表位，或甚至可能導致表位的丟失，即，該表位不足以結合抗體從而？1起免疫反應。改變蛋白質(zhì)免疫原性的另一種方法是通過如往蛋白質(zhì)中添力口PEG等化合物"掩蓋表位"。文獻WO00/26230和WO01/83559公布了選擇與親本蛋白質(zhì)相比免疫原性降低的蛋白質(zhì)變體的兩種不同方法。文獻WO99/389787〉布了通過修飾IgE結合位點來4奮飾變應原使其變應原性降低的方法。和構建、鑒別和生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的方法?？莶輻U菌酶普遍應用于洗滌劑工業(yè)中，是潛在地可能引起變態(tài)反應等免疫反應的一組酶。因此持繼需要具有改變的免疫原性(尤其是具有降低的變應原性)且同時仍保留了其應用時所必需的酶促活性的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體。文獻WO00/22103/>布了免疫反應減少的多肽，而文獻WO01/835597>布了免疫原性已^皮修飾的蛋白質(zhì)變體。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面涉及枯草桿菌酶變體，其中第57位和以下三個位置中的至少一個被修飾170、181和247。本發(fā)明的第二方面涉及SEQIDNO.1的枯草桿菌酶,，其中第3位的Xaa殘基是S或T,第4位是V或I，第27位是K或R，第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第74位是N或D，第85位是S或N，第97位是S或D，第99位是S、G或R，第101位是S或A，第102位是V、N、Y或I，第121位是N或S,第157位是G、D或S,第188位是A或P，第193位是V或M,第199位是V或I，第211位是L或D,第216位是M或S，第226位是A或V，第230位是Q或H,第239位是Q或R,第242位是N或D,第246位是N或K，第268位是T或A,而且其中第164、175和241位的Xaa殘基是以下組合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。本發(fā)明的第三方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的DNA序列。本發(fā)明的第四方面涉及含有所說DNA序列的載體。本發(fā)明的第五方面涉及含有所說載體的宿主細胞。本發(fā)明的第六方面涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的組合物。定義術語"枯草桿菌酶"在本發(fā)明的上下文中應理解為如下文獻所述的絲氨酸蛋白酶亞類Siezen等，ProteinEngng.4(1991)719-737和Siezen等，ProteinScience6(1997)501-523。術語"親本"在本發(fā)明的上下文中理解為修飾后產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的蛋白質(zhì)。親本蛋白質(zhì)可以是天然存在的(野生型)多肽或可以是通過任何適當方法制備的其變體。例如，親本蛋白質(zhì)可以是已通過以下修飾改變的天然存在蛋白質(zhì)的變體天然存在的多肽中一個或多個氨基酸殘基的替代、化學修飾、缺失或截短，或將一個或多個氨基酸殘基添加或插入天然多肽的氨基S吏序列中。因此術語"親本枯草桿菌酶"指為了產(chǎn)生枯草桿菌酶變體而可以進行修飾的枯草桿菌酶。術語"變體"在本發(fā)明的上下文中應理解為與親本蛋白質(zhì)相比在一個或多個氨基酸殘基位置已被修飾的蛋白質(zhì)。術語"修飾"或"已修飾"在本發(fā)明的上下文中應理解為包括對蛋白質(zhì)的化學修飾以及對編碼蛋白質(zhì)的DNA的遺傳操作。修飾可以是在目的氨基酸內(nèi)或目的氨基酸位置進行氨基酸側鏈的置換、氨基酸的替代、缺失和/或插入。因此術語"(已)修飾的蛋白質(zhì)"，如"(已)修飾的枯草桿菌酶"應理解為與親本蛋白質(zhì)相比含有修飾的蛋白質(zhì)。術語"位置"在本發(fā)明的上下文中應理解為是蛋白質(zhì)中從N-末端氨基酸開始的編號。本發(fā)明中所用的位置編號指來自淀粉液化芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶Novo(BPN，)的位置。不過，其它枯草桿菌酶也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用GAP軟件通過與來自淀粉液化芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶Novo(BPN，)進行序列比對，可以確定其它枯草桿菌酶的相應位置。GAP提供于GCG軟件包中(用于Wisconsin軟件包的軟件手冊(ProgramManualforWisconsinPackage),第8版,1994年8月,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison，Wisconsin,USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，JournalofMolecularBiology,48，443-45)。除非特別說明，本發(fā)明中所提及的位置以BPN，編號給出，且可通過序列比對(alignment)轉換。術語"蛋白質(zhì)，，在本發(fā)明的上下文中意指包括寡肽、多肽以及蛋白質(zhì)等等。術語"缺失"或"已缺失"，涉及某位置或某氨基酸時，在本發(fā)明的上下文中指在此特定位置處的氨基酸已被刪除或缺失。術語"插入"或"已插入"，涉及某位置或某氨基酸時，在本發(fā)明的上下文中指于此特定位置的氨基酸之后已插入一個或多個氨基酸，如l-5個氨基酸，或存在一個或多個氨基酸，如1-5個氨基酸。術語"替代"或"已替代"，涉及某位置或氨基酸時，在本發(fā)明的上下文中指在此特定位置的氨基酸已被另一氨基酸代替或出現(xiàn)了與指定蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)序列)中某一氨基酸不同的氨基酸?？s寫詞SEOIDNO.l，術語SEQIDNO.l，在本發(fā)明上下文中用作根據(jù)SEQIDNO.l的序列的縮寫，其中的Xaa殘基在第3位是S或T,在第4位是V或I，在第27位是K或R,在第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，在第74位是N或D，在第85位是S或N,在第97位是S或D,在第99位是S、G或R，在第101位是S或A，在第102位是V、N、Y或I，在第121位是N或S，在第157位是G、D或S，在第188位是A或P，在第193位是V或M，在第199位是V或I，在第211位是L或D，在第216位是M或S,在第226位是A或V，在第230位是Q或H,在第239位是Q或R,在第242位是N或D,在第246位是N或K,在第268位是T或A,且其中第164、175和241位的Xaa殘基是以下組合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。氨基酸使用了眾所周知的三字母和單字母氨基酸縮寫(參閱，如CreightonTE(1993)，蛋白質(zhì)；結構和分子特性(Proteins;StructuresandMolecularProperties)，第2版，W.H.:FreemanandCompany,圖l.l,第3頁)?？s寫"X"或"Xaa"用于指任何氨基酸。本發(fā)明上下文中的縮寫"aa"用于指"氨基酸"。變體為了描述氨基酸的缺失、插入和/或替代，本發(fā)明中使用了以下命名法原始氨基酸、位點、缺失/插入/替代的氨基酸由此用谷氨酸替代第195位的甘氨酸被標示為Glyl95Glu或G195E在同一位置處甘氨酸的缺失是Glyl95承或G195*而另外插入一個氨基酸殘基，如賴氨酸，則是Glyl95GlyLys或G195GK在指出了與編號所用序列相比而言的缺失時，在這一位置的插入表示為*36Asp或*36D指在第36位插入了天冬氨酸。多個突變用加號分開，即Argl70Tyr+Glyl95Glu或R170Y+G195E表示在第170和195位的突變，即酪氨酸和谷氨酸分別替代了精氨酸和甘氨酸。本發(fā)明涉及.1.枯草桿菌酶變體，其中第57位被修飾，且在第170、181和247位中至少一個位置處也有^f務飾。2.項1的變體，其中第57位的修飾是缺失或是替代成以下殘基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I。83.前述項中任一的變體，其中第170位的修飾是缺失或是替代成以下殘基之一C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H。4.前述項中任一的變體，其中第181位的修飾是缺失或是替代成以下殘基之一A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W。5.前述項中任一的變體，其中第247位的修飾是缺失或是替代成以下殘基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。6.項2或3的變體，所說的變體是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H。7.項2或4的變體，所說的變體是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W。8.項2或5的變體，所說的變體是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。9.項2、3或5的變體，所說的變體是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。10.項2、4或5的變體，所i兌的變體是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。11.項l-5任一項的變體，其中變體是如下之一X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q。12.前述項中任一的變體，其中在枯草桿菌蛋白酶中進行所述修飾。13.前述項中任一的變體，其中在I-S1型枯草桿菌酶中進行所述修飾。14.項13的變體，其中枯草桿菌酶選自枯草桿菌蛋白酶BPN，、枯草桿菌蛋白酶amylosaccharitus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸系膜肽酶、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg和枯草桿菌蛋白酶DY。15.項1-12任一項的變體，其中在I-S2型枯草桿菌酶中進行所述的修飾。16.項15的變體，其中枯草桿菌酶選自枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶PB92、BLAP和K16。17.編碼前述項中任一的枯草桿菌酶變體的DNA序列。18.包含項17的DNA序列的載體。19.包含項18的載體的宿主細胞。20.包含依照項1-16任一項的枯草桿菌酶變體的組合物。21.依照項20的組合物，其是清潔組合物。22.依照項20的組合物，其是個人護理組合物。23.SEQIDNO.l的枯草桿菌酶，其中Xaa殘基在第3位是S或T,在第4位是V或I，在第27位是K或R，在第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，在第74位是N或D，在第85位是S或N，在第97位是S或D，在第99位是S、G或R，在第101位是S或A，在第102位是V、N、Y或I,在第121位是N或S，在第157位是G、D或S,在第188位是A或P,在第193位是V或M，在第199位是V或I，在第211位是L或D，在第216位是M或S，在第226位是A或V，在第230位是Q或H,在第239位是Q或R,在第242位是N或D，在第246位是N或K，在第268位是T或A，而且其中第164、175和241位的Xaa殘基是以下組合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。24.項23的枯草桿菌酶，其中第55位的Xaa殘基是以下殘基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I。25.項23和24任一項的枯草桿菌酶，其中第164位的Xaa殘基是以下殘基之一G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。26.項23-25任一項的枯草桿菌酶，其中第175位的Xaa殘基是以下殘基之一G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失。27.項23-26任一項的枯草桿菌酶，其中第241位的Xaa殘基是以下殘基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。28.項23-27任一項的枯草桿菌酶，其中第55位的Xaa殘基是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一，第164位的Xaa殘基是殘基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，且第241位的Xaa殘基是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。29.項23-28任一項的枯草桿菌酶，其中第55位的Xaa殘基是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一，第175位的Xaa殘基是殘基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，且第241位的Xaa殘基是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。30.項23-29任一項的枯草桿菌酶，其中第55位的Xaa殘基是P且第164位的Xaa殘基是L。31.項23-29任一項的枯草桿菌酶，其中第55位的Xaa殘基是P,第164位的Xaa殘基是L，且第241位的Xaa殘基是Q。32.項23-31任一項的枯草桿菌酶，其中枯草桿菌酶是枯草桿菌蛋白酶。33.項32的枯草桿菌酶，其中枯草桿菌蛋白酶是I-S1型的。34.項32的枯草桿菌酶，其中枯草桿菌蛋白酶是I-S2型的。ii35.編碼項23-34任一的枯草桿菌酶的DNA序列。36.包含項35的DNA序列的載體。37.包含項36的載體的宿主細胞。38.包含依照項23-34任一項的枯草桿菌酶的組合物。39.依照項38的組合物，其是清潔組合物。40.依照項38的組合物，其是個人護理ia合物。發(fā)明詳述本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶本發(fā)明涉及枯草桿菌酶變體，其中第57位以及第170、181和247這三個位置中的至少一個被修飾，本發(fā)明還涉及SEQIDNO.l，的枯草桿菌酶。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)所說的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶分別具有與親本枯草桿菌酶和Savinase相比改變了的免疫原性。本發(fā)明枯草桿菌酶變體第57、170、181和/或247位氨基酸的修飾可通過對編碼親本枯草桿菌酶的DNA的遺傳處理或通過例如對氨基酸側鏈的化學修飾進行。具體而言，所說的位置可以通過對編碼親本枯草桿菌酶的DNA進行遺傳處理，如通過缺失、插入或替代進行修飾。插入通常可以包括插入1-5個氨基酸，如l、2、3、4或5個氨基酸。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明枯草桿菌酶變體中的第57、170、181和/或247位可通過替代進行》務飾。具體而言，第57、170、181和/或247位氨基酸的替代可以包括替代成不同大小、親水性和/或極性的氨基酸，如小氨基酸相對于大氨基酸、親水性氨基酸相對于疏水性氨基酸、極性氨基酸相對于非極性氨基酸以及堿性氨基酸相對于酸性氨基酸，因為這些類型的替代常常改變免疫原性。所述替代還可包括替代成適于化學修飾的氨基酸，如替代成賴氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)。更具體而言，第57位氨基酸(aa)殘基可被替代成以下殘基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I;第170位氨基酸殘基可以被修飾成以下殘基之一C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H;第181位氨基酸殘基可以被修飾成以下殘基之一A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W;以及/或第247位的氨基酸殘基可以被修飾成以下殘基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。例如本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。尤其是，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以是以下之一X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q,X57P+X170L，更尤其是X57P+X170L+X247Q。在一個具體實施方案中本發(fā)明枯草桿菌酶變體可進一步包含在以下位置之一的替代、插入或缺失1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274。具體而言，這些修飾可以是以下的一種或多種X1G、X3T、X4I、X27L、X27R、X36*、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274A。在另一實施方案中本發(fā)明枯草桿菌酶變體可進一步在環(huán)區(qū)包括插入，即，在第33—43、95—103、125—132、153—173、181—195、202—204或218-219位的一個或多個區(qū)域中插入。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.l，的枯草桿菌酶。在本發(fā)明的一個實施方案中它可以是SEQIDNO.l，的枯草桿菌酶，其中第55、164、175和/或241位的Xaa被缺失或含有插入，如1-5個氨基酸的插入，如l、2、3、4或5個氨基酸的插入。在第55、164、175和/或241位的Xaa還可以是適于化學修飾的氨基酸，如賴氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)。在另一實施方案中第55位Xaa可以是殘基G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W之一，以及/或第164位Xaa可以是殘基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，以及/或第175位Xaa可以是殘基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，以及/或第241位Xaa可以是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。第55位Xaa尤其可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一。例如，第55位Xaa可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第164位Xaa可以是殘基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，或者是第55位Xaa可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第175位Xaa可以是殘基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，或者第55位Xaa可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第241位Xaa可以是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。更尤其是，第55位Xaa可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第164位Xaa可以是殘基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一且第241位Xaa可以是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一，或者是第55位Xaa可以是殘基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第175位Xaa可以是殘基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一且第241位Xaa可以是殘基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。本發(fā)明的枯草桿菌酶還可以是SEQIDNO.1，的枯草桿菌酶，其中第3、4、27、74、85、97、99、101、102、121、157、188、193、199、211、216、226、230、239、242、246和268位的Xaa組合可以是以下組合之一i)在第3位是S,在第4位是V,在第27位是K，在第74位是N,在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S,在第101位是S,在第102位是V,在第121位是N,在第157位是G,在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L,在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q,在第239位是Q,在第242位是N，在第246位是N,在第268位是T;或ii)在第3位是S,在第4位是V,在第27位是K，在第74位是N，在第85位是N，在第97位是S,在第99位是G,在第101位是S,在第102位是N,在第121位是N,在第157位是G,在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L,在第216位是M,在第226位是A,在第230位是Q,在第239位是Q,在第242位是N，在第246位是N,在第268位是T;或iii)在第3位是S,在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是N，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S,在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G,在第188位是A，在第193位是V,在第199位是V，在第211位是L，在第216位是S，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N,在第246位是N，在第268位是T;或iv)在第3位是S,在第4位是V，在第27位是R,在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S,在第101位是S，在第102位是Y，在第121位是S,在第157位是G,在第188位是A，在第193位是V,在第199位是V,在第211位是L,在第216位是M,在第226位是A，在第230位是Q,在第239位是Q，在第242位是N,在第246位是N，在第268位是A;或v)在第3位是S，在第4位是V,在第27位是K，在第74位是D,在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S,在第101位是A,在第102位是I，在第121位是N,在第157位是G，在第188位是A,在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M,在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q,在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T;或vi)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K,在第74位是N,在第85位是S,在第97位是S,在第99位是G,在第101位是A，在第102位是I，在第121位是N,在第157位是D,在第188位是A，在第193位是V,在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是V，在第230位是H,在第239位是R，在第242位是D，在第246位是K，在第268位是T;或vii)在第3位是S，在第4位是V,在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S,在第97位是D,在第99位是R，在第101位是A,在第102位是I，在第121位是N,在第157位是S，在第188位是A，在第193位是V,在第199位是V，在第211位是L，在第216位是S,在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q,在第242位是N,在第246位是N，在第268位是T;或viii)在第3位是T，在第4位是I，在第27位是K,在第74位是N，在第85位是S,在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V,在第121位是N，在第157位是G,在第188位是P，在第193位是M,在第199位是I，在第211位是D，在第216位是M,在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q,在第242位是N,在第246位是N,在第268位是T;或ix)在第3位是T,在第4位是I，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S,在第97位是S,在第99位是S，在第101位是S,在第102位是V，在第121位是N,在第157位是G，在第188位是A，在第193位是M，在第199位是I,在第211位是D，在第216位是M,在第226位是A,在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N,在第246位是N，在第268位是T;或x)在第3位是T，在第4位是I，在第27位是K,在第74位是N,在第85位是S，在第97位是S,在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V,在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A,在第193位是V,在第199位是I，在第211位是L,在第216位是M,在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N,在第246位是N，在第268位是T。本發(fā)明的枯草桿菌酶還可以在以下一個或多個位置中包含替代、插入或缺失1、35、95、96、98、118、158、161、163、164、189、212和229。這些修飾的例子包括X1G、X27L、135ID、X74D、X118D、A158AS、X161A、X164S、X189E、X212S和X229L。在本發(fā)明一個實施方案中本發(fā)明的枯草桿菌酶還可包括在環(huán)區(qū)的插入，即，在第33-42、93—101、123—130、151-167、175—189、196—198或212-213位的一個或多個區(qū)域中的插入?？莶輻U菌酶如上所述，依照文獻Siezen等，ProteinEngng.4(1991)719-737和Siezen等，ProteinScience6(1997)501-523，枯草桿菌酶組成了絲氨酸蛋白酶的一個亞類。通過以前被稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的170多種絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的同源性分析定義了枯草桿菌酶?？莶輻U菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、Thermitase家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族?？莶輻U菌蛋白酶家族可進一步劃分成3個亞組，即，I-Sl("真正的"枯草桿菌蛋白酶)、I-S2(高堿性蛋白酶)和細胞內(nèi)枯草桿菌蛋白酶。不過，酶的定義或分類是可以變化或改變的，在本發(fā)明的上下文中，以上將枯草桿菌酶分為亞部或亞組的劃分應按文獻所述進行理解Siezen等,ProteinEngng.4(1991)719-737和Siezen等，ProteinScience6(1997)501-523。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體是通過修飾親本枯草桿菌酶而獲得的。親本枯草桿菌酶和/或本發(fā)明的枯草桿菌酶可以是分離自天然來源的枯草桿菌酶，即，野生型枯草桿菌酶，或者可以是分離自天然來源且隨后在保留枯草桿菌酶特征的同時已進行了修飾的枯草桿菌酶?？梢允怯H本枯草桿菌酶的這些枯草桿菌酶變體的例子包括以下文獻中所公布的那些EP130.756、EP214.435、WO87/04461、WO87/05050、EP251.446、EP260.105、WO88/08028、WO88/08033、WO89/06279、WO91/00345、EP525610和WO94/02618。在另一實施方案中，親本枯草桿菌酶可以是通過DNA改組技術，如文獻J.E.Ness等，NatureBiotechnology17，893-896(1999)中所述的技術制備的枯草桿菌酶。此外，還可通過人為產(chǎn)生多樣性的標準技術，如對不同枯草桿菌酶基因進行DNA改組(WO95/22625;StemmerWPC,Nature370:389-91(1994))，構建親本枯草桿菌酶。例如，可以通過DNA改組，例如將編碼Savinase⑧的基因與從自然界中鑒別到的一個或多個部分枯草桿菌酶序列進行DNA改組來構建親本枯草桿菌酶。親本枯草桿菌酶和/或本發(fā)明的枯草桿菌酶尤其可以是枯草桿菌蛋白酶，更尤其是屬于I-S1或I-S2組的枯草桿菌蛋白酶。I-Sl型枯草桿菌酶的例子包括枯草桿菌蛋白酶BPN，、'枯草桿菌蛋白酶amylosaccharitus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸系膜肽酶(mesentericopeptidase)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)和枯草桿菌蛋白酶DY。I-S2型枯草桿菌酶的例子包括枯草桿菌蛋白酶309(Savinase)、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶PB92、BLAP和K16。在另一實施方案中，親本枯草桿菌酶和/或本發(fā)明的枯草桿菌酶可以是屬于Thermitase家族的枯草桿菌酶，如Thermitase。親本枯草桿菌酶和/或本發(fā)明的枯草桿菌酶還可以屬于蛋白酶K家族，如蛋白酶K等?？捎米饔H本枯草桿菌酶的其它枯草桿菌酶例子包括PD498(W093/24623)、aqualysin、蛋白酶TW7、蛋白酶TW3、高堿性蛋白酶，如文獻EP503346、EP610808和WO95/27049所述的那些。在另一實施方案中，親本枯草桿菌酶可以是在保留枯草桿菌酶特征的同時隨后已經(jīng)過修飾的枯草桿菌酶。例如，親本枯草桿菌酶可以包含在環(huán)區(qū)(loop區(qū))的插入,即在第33—43、95—103、125—132、153-173、181-195、202-204或218-219位的一個或多個區(qū)域中的插入。親本枯草桿菌酶還可以是已進一步^務飾的Savinase。這些進一步》務飾的例子包括在以下一個或多個位置的替代、插入或缺失1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274。這些修飾的例子包括X1G、X3T、X4I、X27L、S27R、*36D、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X訓、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274A。親本枯草桿菌酶和/或本發(fā)明的枯草桿菌酶尤其可以是Savinase樣枯草桿菌蛋白酶，即，與Savinase至少具有40。/。的同一性，如至少50°/。的同一性或至少60%的同一性，更尤其是至少70%的同一性或至少80%的同一性，甚至更尤其是與Savinase至少具有90。/。的同一性或至少95%的同一性，其中的同一性是親本枯草桿菌酶/本發(fā)明的枯草桿菌酶的核酸序列分別與Savinase的核酸序列相比較的同一性。各種枯草桿菌蛋白酶與Savinase的序列對比顯示，各種枯草桿菌蛋白酶的核酸序列之間的同一性在100%-40°/。的范圍內(nèi)。不同蛋白酶對之間的序列同一性如下與Savinase的序列同一寸生Alcalase60.9%BLAPR98,1%蛋白酶C98.5%蛋白酶D98.9%蛋白酶E96.7%蛋白酶A97.8%Properase98.9%Relase98.1%PD49844.3%Sendai81.4%YAB81.8%PD498的蛋白質(zhì)結構公布于W098/35026(NovoNordisk)中。Savinase的結構可發(fā)現(xiàn)于文獻BETZEL等，J.MOL.BIOL.,第223巻，第427頁，1992年(1svn.pdb)?？扇缥墨I所述測定枯草桿菌酶和枯草桿菌酶變體的活性"酶分析方法"(MethodsofEnzymaticAnalysis)，第三版,1984，VerlagChemie，Weinheim,第5巻。免疫原性本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶分別與親本枯草桿菌酶和Savinase相比具有改變的免疫原性。"免疫反應"在本發(fā)明中應理解為生物體對化合物的反應，該反應才艮據(jù)四種標準反應(Coombs&Gell所述的類型I、II、III和IV)中任一種涉及免疫系統(tǒng)。相應的，術語化合物的"免疫原性"在本發(fā)明中指該化合物在包括人在內(nèi)的動物體內(nèi)誘導免疫反應的能力。術語"(已)改變的免疫原性"在涉及本發(fā)明的枯草桿菌酶變體或枯草桿菌酶時是指分別與生物體對親本枯草桿菌酶/Savinase的同類型免疫反應相比較，生物體對于所說枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶的免疫反應是不同的，即降低或增加。通常只是蛋白質(zhì)的一部分，也稱為表位的部分，參與免疫反應的誘導，如抗體結合或T-細胞激活。通常表位由一套非連續(xù)的氨基酸組成，即，在一級序列中氨基酸相互間并不毗連，但在蛋白質(zhì)的三維結構中則相互接近。鑒別抗體結合中所涉及的表位的一個特別有用的方法是，篩選肽-噬菌體膜蛋白融合物文庫，并選擇那些與相關抗原特異性抗體結合的融合物，對融合基因的隨機化部分進行測序，將結合中所涉及的序列進行比對，基于這些序列比對確定共有序列，并將這些共有序列作圖定位于抗原表面或序列和/或結構中，從而確定抗體結合中所涉及的表位。鑒別表位的方法如文獻WO01/83559和WO99/53038中所述。變態(tài)反應通常理解為由于先前存在的抗體和T細胞的出現(xiàn)而對無害的外源物質(zhì)產(chǎn)生的不利免疫反應(Janeway和Travers,免疫學，當代生物學(Immunology,CurrentBiology)，Blackwell,Garland,1994年，第ll章)。大部分變態(tài)反應涉及IgE介導的應答，且在本發(fā)明的上下文中術語"變態(tài)反應"應理解為生物體對化合物的反應，該反應涉及IgE介導的應答(Coombs&Gdl所述的類型I反應)。應理解由于與某化合物接觸而致敏(即，產(chǎn)生化合物特異的IgE抗體)是包括在"變態(tài)反應"的定義范圍內(nèi)的。相應的，術語化合物的"變應原性"在本發(fā)明中是指該化合物在包括人在內(nèi)的動物體內(nèi)誘導變態(tài)反應的能力。變態(tài)反應背后的一般機制可以劃分為致敏階段和有癥狀的階段。致敏階段包括個體與變應原的首次接觸，取決于施用方法這可以通過吸入、直接與皮膚和眼睛接觸或注射而發(fā)生。此事件激活了特異的T-和B-淋巴細胞，并導致了變應原特異的IgE抗體，即，免疫球蛋白E的產(chǎn)生。這些IgE抗體最終促進了在有癥狀階段開始時變應原的俘獲及向T-淋巴細胞的呈遞。此癥狀階段由與同一抗原或類似抗原的二次接觸而起始。特異的IgE抗體與處于例如肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的特異IgE受體結合，并同時俘獲變應原。當IgE抗體是多克隆抗體時，結果是IgE受體的橋接和成簇，這樣就激活了肥大細胞和嗜堿性粒細胞。此激活作用觸發(fā)了變態(tài)反應有癥狀階段的早期及晚期反應中所涉及的各種化學介質(zhì)的釋放。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶尤其可以具有降低了的免疫原性，如降低了的變應原性。在本發(fā)明的上下文中變應原性應依照按如下方法產(chǎn)生于Balb/C小鼠中的IgE反應的程度來衡量持繼20周每周用50[xl0.9%(重量/體積)NaCl(對照組)或含10fig蛋白質(zhì)的50pl0.9%(重量/體積)NaCl皮下免疫接種小鼠，每隔一周在下次免疫接種前從眼部采集血清，并隨后用特異于小鼠IgE的ELISA測定IgE的水平。因此，術語"降低了的變應原性"在涉及本發(fā)明的枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶時應理解為分別與親本枯草桿菌酶/Savinase相比，在所說的試驗中20IgE反應減少或消失了。具體而言,在此試驗中檢測到的由應答所說枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶而獲得的IgE水平可以分別是應答親本枯草桿菌酶/Savinase所獲得的IgE水平的35°/。，如30%或25%或20%或15%或10%。因此，分別與親本枯草桿菌酶/Savinase相比，應答本發(fā)明枯草桿菌酶變體和/或枯草軒菌酶的lgE反應可以降低至少3倍，如5倍或10倍?？捎糜跍y試對蛋白質(zhì)的免疫反應/變態(tài)反應的其它方法包括體外試驗，如檢測蛋白質(zhì)的抗體結合和/或功能性的測定法(這可以用劑量反應曲線和如直接或竟爭性ELISA(C-ELISA)進行詳細的測定，如文獻W099/47680中所述)，基于細胞因子表達概況的測定法和基于上皮細胞和包括B細胞和T細胞在內(nèi)的其它細胞的增殖或分化反應的測定法。用于檢測變應原性的體內(nèi)模型的例子包括豚鼠氣管內(nèi)模型(GPIT)(Ritz等，F(xiàn)und.Appl.Toxicol.，^i，第31-37頁，1993)、小鼠皮下模型(小鼠-SC)(WO98/30682)、大鼠氣管內(nèi)模型(大鼠-IT)(WO96/17929)和小鼠鼻內(nèi)模型(MINT)(Robinson等,Fund.Appl.Toxicol.,M，第15—24頁，1996)?？煞謩e用本發(fā)明枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶的純化制品來檢測本發(fā)明枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶的改變了的變應原性和/或免疫原性。因此在測試枯草桿菌酶變體或枯草桿菌酶是否具有改變的變應原性和/或免疫原性之前，可以先將它們大量表達并/或用常規(guī)方法進行純化。其它的修飾本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶可通過如突變和/或化學綴合等方法進行進一步的修飾。其目的是為了進一步降低酶的變應原性或增強其性能、穩(wěn)定性，耐熱性或酶的任何其它特性。在本發(fā)明的一個實施方案中，枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶可通過蛋白質(zhì)內(nèi)的替代而被進一步修飾，如用適于化學修飾的氨基酸替代諸如表位區(qū)域內(nèi)已有的氨基酸。所述替代尤其可以是保守性的以限制其對蛋白質(zhì)結構的影響，例如所述替代可以是精氨酸對賴氨酸、天冬酰胺對天冬氨酸、谷氨酰胺對谷氨酸、蘇氨酸或絲氨酸對半胱氨酸的替代。也可在未首先用其它氨基酸替代一個或多個氨基酸的情況下對本發(fā)明枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶中存在的氨基酸進行化學修飾。有關化學修飾的化學法如上所述。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶可進行另外的修飾以進一步降低所說酶的變應原性。特別地，可用文獻WO99/00489中所述的方法對本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶進行另外的修飾，其中將分子量100Da-750Da以下的聚合物分子，特別是分子量IOO-500Da的聚合物分子，如300Da左右的聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，包括天然的和合成的均聚物，如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)，以及別的雜聚物，即含一個或多個不同偶聯(lián)基團，如羥基和胺基的聚合物。具體的例子包括聚乙二醇(PEG)、曱氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇。可以用本領域熟練技術人員已知的任何方法將聚合物與枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶偶聯(lián)。一般而言，可將4-50個聚合物分子，如5-35個聚合物分子與所說的酶偶聯(lián)。進一步修飾本發(fā)明枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶的其它方法包括在例如枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶的表位區(qū)域中引入用于翻譯后修飾的識別位點。然后應在能進行相應的翻譯后修飾的合適宿主生物體內(nèi)表達此枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶。這些翻譯后修飾可用于掩蔽表位并由此進一步降低枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶分別相對于親本枯草桿菌酶/Savinase的變應原性和/或免疫原性。翻譯后修飾包括糖基化、磷酸化、N-末端加工、?；?、核糖基化和硫酸酯化。N-糖基化作用是一個好例子。N-糖基化作用發(fā)生于序列Asn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Cys的位點處，其中Xaa殘基和位于此三肽共有序列后的氨基酸都不是脯氨酸(T.E.Creighton,蛋白質(zhì)一結才勾和分子凈爭'l"生(Proteins—StructuresandMolecularProperties)，第二版，W.H.Freeman和Co.，紐約，1993年，第91-93)。糖基化蛋白質(zhì)變體的糖基鏈的特性可以是線性的或分支的，這取決于蛋白質(zhì)和宿主細胞。另一例子是磷酸化作用蛋白質(zhì)序列可以被修飾以引入具識別序列arg-arg-(xaa)n-ser(其中n=0、l或2)的絲氨酸磷酸化位點(它可被cAMP-依賴型激酶磷酸化)，或者具有識別序列-lys/arg-(xaa)3-asp/glu-(xaa)3-tyr的酪氨酸磷酸化位點(它通?？杀焕野彼崽禺惖募っ噶姿峄?(T.E,Creighton,蛋白質(zhì)-結構和分子特性(Proteins-StructuresandMolecularProperties),第二版，F(xiàn)reeman,紐約，1993年)。22化學修飾本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶可以被化學修飾。本領域技術熟練人員已知的任何方法都可用于化學修飾所說的酶。制備共價生物綴合體的化學反應可在文獻中找到"生物綴合技術"(BioconjugateTechniques),Hermanson,G.T.(1996),AcademicPressInc。如果通過將第57、170、181和/或241位的氨基酸替代成適于化學修飾的氨基酸來修飾枯草桿菌酶變體，則這種替代可以特別是保守的以便保證所述替代對多肽結構的影響是有限的。就添加氨基基團來說，可通過將精氨酸替代成賴氨酸來達到此目的，這兩個殘基都帶正電荷，但只有賴氨酸具有適于作為附著基團的自由氨基基團。就添加羧酸基團來說，保守性替代可以是例如將天冬酰胺替代成天冬氨酸或將谷氨酰胺替代成谷氨酸。除了出現(xiàn)于酸性殘基上的羧基外，這些殘基在大小和性狀上彼此相似。就提供SH基團來說，可通過將蘇氨酸或絲氨酸改變成半胱氨酸來完成保守性替代?；瘜W綴合對于化學綴合而言，蛋白質(zhì)需要與活性或活化的聚合物一起孵育并隨后與未反應的聚合物分離。這可以在溶液中進行并隨后進行純化，或者這可以利用固定化蛋白質(zhì)很方便地進行，后者可以很容易地暴露于不同反應條件中而且易于漂洗。在聚合物分子將與所關心的多肽綴合且聚合物分子無活性的情況下，它們必須用適當?shù)募夹g加以激活。依照本發(fā)明也可以考慮通過接頭將聚合的。聚合物分子活化以及綴合多肽所用的方法和化學反應在文獻中有透徹的描述。不溶性聚合物活化通常所用的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、雙環(huán)氧化物(biepoxide)、表氯醇、二乙烯砜(divinylsulfone)、碳二亞胺、磺酰卣、三氯三溱等活化官能基團(參閱"生物綴合技術"(BioconjugateTechniques)，Hermanson，G.T.(1996)，AcademicPressInc.;"蛋白質(zhì)固定化。基本原理和應用，，(Proteinimmobilization.Fundamentalandapplications),R.F.Taylor(1991),Marcel，Dekker，N.Y.;"蛋白質(zhì)綴合禾口交聯(lián)的化學反應，，(ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking)，S.S.Wong(1992),CRC出版社，BocaRaton;"固定化親合配體技術"(ImmobilizedAffinityLigandTechniques)，G.T.Hermanson等(1993)，學術出版社，紐約)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但也可應用于可溶性聚合物的活化，如高碘酸、三氯三溱、磺酰卣、二乙烯砜、碳二亞胺等。在選擇活化和綴合化學反應時必須考慮聚合物上的氨基、羥基、硫醇、羧基、醛基或巰基官能基團和蛋白質(zhì)上所選擇的附著基團，化學反應通常由i)聚合物的活化，ii)綴合，以及iii)封閉剩余的活性基團所組成。下文將簡述多種適宜的聚合物活化方法。不過，應當理解其它的方法也是可以應用的?？梢岳枚啺芳袄绨被?PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Am.Chem.Soc.，98，289,291)或重氮乙酸鹽/酰胺(Wong等,(1992)"蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)化學，，(ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking)，CRC出版社)的幫助進行聚合物分子與多肽自由酸性基團的偶聯(lián)。將聚合物分子與羥基偶聯(lián)通常很困難，因為這必須在水中進行。水解作用常常勝過了與羥基的反應。用馬來酰亞胺或鄰吡咬基二硫化物等特殊基團可以完成聚合物分子與自由巰基的偶聯(lián)。乙烯砜(美國專利5414135(1995),Snow等)也優(yōu)選用于巰基，但它的選擇性不如所提及的其它試劑。用含兩個鄰近羰基的基團可以作用于多肽鏈中易接近的精氨酸殘基。涉及將親電子活化的PEG與賴氨酸的氨基偶聯(lián)的技術也是有用的。用于醇的許多通常的離去基團都可造成胺鍵。例如，可利用烷基磺酸酯，如Mesylates(Nilsson等，(1984)，酶學方法(MethodsinEnzymology),第104巻，Jacoby,W.B,，編輯，Academic出版社Orlando,第56-66頁；Nilsson等，(1987),酶學方法(MethodsinEnzymology)，第135巻，Mosbach,K.,編輯，Academic出版社:Orlando,第65-79頁;Scouten等，(1987)，酶學方法(MethodsinEnzymology)，第135巻，Mosbach，K.，編輯，Academic出版社Orlando，1987;第79-84頁；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971,93，第4217—4219頁)、曱磺酸酉旨(Harris,(1985)，同上引文；Harris等(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，第341-352頁)、芳基磺酸酯如曱苯磺酸酯和對-硝基苯磺酸酯。如Tresyl酰氯等有機磺酰氯可以有效地將PEG等許多聚合物中的羥基轉換成好的離去基團(磺酸酯)，當這些離去基團與多肽中的氨基等親核基團反應時可在聚合物和多肽之間形成穩(wěn)定的鍵接。除了高綴合物產(chǎn)量之外，此反應條件通常都是溫和的(中性或弱堿性pH,以避免變性且使活性幾乎不損失或不損失)，而且滿足對多肽不具有破壞性的要求。曱苯磺酸酯比甲磺酸酯更具有反應性，但同時也更不穩(wěn)定，它可以分解為PEG、二？悉烷和磺酸(Zalipsky,(1995),生物綴合物化學(BioconjugateChem.)，6,150-165)。環(huán)氧化物也可用于建立胺4建，但其反應性比上述基團低得多。用光氣將PEG轉變成氯曱酸酯可以導致與賴氨酸的氨基曱酸酯鍵接。在用N-羥基琥珀酰亞胺(美國專利5122614，(1992);Zalipsky等，(1992),Biotechnol.Appl.Biochem.,15,第100-114頁；Mon-fardini等，(1995),BioconjugateChem.，6，62-69)、咪哇(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213,第309-319頁)、對-硝基酚、DMAP(EP632082Al,(1993)，Looze，Y.)等取代氯的許多變通方案中都可以進行基本上相同的反應。通常通過將氯曱酸酯與所期望的離去基團反應來制備這些衍生物。所有這些基團都導致了與肽的氨基曱酸酯鍵接。此外，也可應用異氰酸酯和異硫氰酸酯，分別產(chǎn)生脲和硫脲。酰胺可以用上述相同的離去基團和環(huán)亞胺thrones乂人PEG酸獲得(美國專利5，349,001，(1994)，Greenwald等)。這些化合物的反應性很高，但可能使水解加快。還可應用從與琥珀酸酐反應中得到的PEG琥珀酸酯。由此組成的酯基使綴合物更易受到水解作用的影響(美國專利5，122,614,(1992)，Zalipskyl)。此基團可以用N-羥基琥珀酰亞胺激活。此外，可以引入特殊的接頭。研究最多的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1997)，J.Biol.Chem.,252,3578-3581;美國專利4,179，337,(1979),Davis等;Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。將PEG與芳香胺偶聯(lián)，然后進行重氮化，產(chǎn)生了很活躍的重氮鹽，它可以在原位與肽反應。也可以通過與PEG的二氫唑酮4汙生物(美國專利5，321，095，(1994),Gree證ald，R.B.)再反應另外引入一個酰胺鍵，從而得到酰胺鍵的聯(lián)接。當某些肽沒有包含多個賴氨酸時，將一個以上的PEG附著于同一個賴氨酸上可能是有利的。可通過例如使用l，3-二氨基-2-丙醇來達到此目的。PEG還可以通過氨基曱酸酯鍵與酶的氨基連接(WO95/11924，Greenwald等)。還可將賴氨酸殘基用作骨架。實施例中所用的偶聯(lián)技術是WO90/13590(Enzon)中所述的N-琥珀酰亞胺碳酸酯綴合技術。在一個具體的實施方案中，活化的聚合物是曱基-PEG，它已用WO90/13590(Enzon)中所述的N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化。在堿性條件下該偶聯(lián)具有高產(chǎn)率。對于聚合物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，尤其可以使用與文獻W096/17929和WO99/00489(NovoNordiskA/S)所述相似的條件，如，分子量100-5000Da的單或雙活化的PEG。例如，可用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化曱基-PEG350并與蛋白質(zhì)變體以大于5的摩爾比一起保溫，所說的摩爾比是用目的蛋白質(zhì)中賴氨酸的摩爾數(shù)除活化PEG的當量計算得到的。對于與固定化蛋白質(zhì)變體的偶聯(lián)來說，PEG:蛋白質(zhì)的比率應進行最優(yōu)化，以便使PEG濃度對于緩沖液的緩沖能力來說足夠低以保持整個反應階段的堿性pH;但PEG濃度仍然要足夠高以保證對蛋白質(zhì)有足夠程度的修飾。此外，將PEG保持在防止水解的條件下(即，溶于酸或溶劑中)且將其直接稀釋于堿性的反應緩沖液中是重要的?；旧?，一級胺僅存在于蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基中。這可以通過用硼酸鹽緩沖液徹底洗滌得以保證。通過將含未反應PEG的液相與含蛋白質(zhì)和衍生蛋白質(zhì)的固相分離而終止反應。任選的，隨后可以用Tris緩沖液洗固相，以封閉可能仍存在的PEG鏈上的任何未反應位點。生產(chǎn)枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶的方法
技術領域：
：本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶可以用本領域內(nèi)的任何已知方法生產(chǎn)，且本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體或枯草桿菌的核酸、含所說核酸的DNA構建體和含所說核酸序列的宿主細胞。一般而言，天然存在的蛋白質(zhì)可以通過培養(yǎng)表達該蛋白質(zhì)的生物體且隨后純化該蛋白質(zhì)而產(chǎn)生，或者可以通過將編碼該蛋白質(zhì)的核酸如基因組DNA或cDNA克隆入表達載體中，然后將所說的表達載體引入宿主細胞中，培養(yǎng)此宿主細胞并純化所表達的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生。通常，可以通過親本蛋白質(zhì)的定點誘變以及引入表達載體、宿主細胞中等步驟產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體。親本蛋白質(zhì)可以克隆自產(chǎn)生所說多肽的株系或26表達文庫，即，它可以分離自基因組DNA或從cDNA制備而來，或者使用兩種方法相結合而獲得。一般而言，為了獲得親本枯草桿菌酶或本發(fā)明的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體，可以利用基因克隆和/或在所說基因中引入突變(隨機的和/或定點的)的標準方法。有關合適的技術的進一步描述，參閱以下文獻分子克隆實驗室手冊(Molecularcloning:Alaboratorymanual)(Sambrook等，(1989),冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯))；分子生物學通用方法(CurrentprotocolsinMolecularBiology)(JohnWiley和Sons，1995;Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編輯))；有關芽孢桿菌的分子生物學方法(MolecularBiologicalMethodsforBacillus)(JohnWileyandSons,1990);DNA克隆實用方法(DNAClonging:APracticalApproach),巻I和II(D.N.Glover編輯，1985);寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M丄Gait編輯，1984);核酸雜交(NucleicAcidHybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯(1985));轉錄和翻譯(TranscriptionAndTranslation)(B.D.Hames&S.J.Higgins，編輯(1984));動物細胞培養(yǎng)(AnimalCellCulture)(R.I.Freshney，編輯(1986));固定化細胞和酶(ImmobilizedCellAndEnzymes)(IRL出版社，(1986));分子克隆實用指南(APracticalGuideToMolecularCloning)(B.Perbal，(1984))和WO96/34946。表達載體含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的核酸序列的重組表達載體可以是便于進行重組DNA操作且可以引起所說核酸序列表達的任何載體。載體的選擇通常取決于它要導入的宿主細胞。適宜載體的例子包括線性或閉環(huán)質(zhì)?；虿《?。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復制是不依賴于染色體的復制的，如，質(zhì)粒，染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含用于保證自我復制的任何元件。細菌的復制起點的例子有質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMpi的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的例子有2p復制起點、CEN6和ARS4的聯(lián)合以及CEN3和ARS1的聯(lián)合。復制起點可以是具有使其在宿主細胞中具有溫度敏感功能的突變體(參閱,如,Ehrlich，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)。或者，載體可以在被引入宿主細胞后整合入基因組中并與所整合的染色體一起復制。待整合入宿主細胞基因組中的載體可以包含能使向基因組中的整合成為可行的任何核酸序列，尤其是它可以包含利于通過同源或非同源重組方式整合入基因組的核酸序列。載體系統(tǒng)可以是單個的載體，如質(zhì)?；虿《?，或者是兩個或多個載體，如多個質(zhì)?；蚨鄠€病毒(它們一起含有待引入宿主細胞基因組的全部DNA)或者是轉座子。載體尤其可以是表達載體，其中編碼本發(fā)明枯草桿菌酶的DNA序列與DNA轉錄所需的其它區(qū)段或調(diào)控序列可操作地連接。術語"可操作連接"指對區(qū)段進行排列，從而使它們?yōu)槠漕A期目的協(xié)同地發(fā)揮作用，如，轉錄起始于啟動子內(nèi)并沿著編碼枯草桿菌酶變體的DNA序列進行。其它區(qū)段或調(diào)控序列包括啟動子、前導序列、聚腺普酸化序列、前肽序列、信號序列和轉錄終止子。調(diào)控序列至少包括啟動子和轉錄及翻譯終止信號。啟動子可以是在所選擇宿主細胞內(nèi)顯示轉錄活性的任何DNA序列，并可以來自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適用于細菌宿主細胞中的啟動子的例子包括枯草桿菌(B.subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)a-淀粉酶基因(amyL)、淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、枯草桿菌堿性蛋白酶基因、或短小芽胞桿菌(B.pumilus)木糖苦酶基因、淀粉液化芽孢桿菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草桿菌xylA和xy舊基因和原核j3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)的啟動子。其它例子包括人噬菌體PR或Pt啟動子或大腸桿菌lac、trp或tac啟動子或天藍色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)瓊脂酶基因(dagA)。其它的啟動子如文獻所述"來自重組細菌的有用蛋白質(zhì)"(UsefUlproteinsfromrecombinantbacteria)，《ScientificAmerican》，1980,242:74-94;和Sambrook等，1989，見上引文。在絲狀真菌宿主細胞中使用的適宜啟動子的例子有來自編碼米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉石咸性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、構巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶、尖鐮孢(FusariumOxyspomm)胰蛋白酶樣蛋白酶(如美國專利4288627所述，該文件在此收編作為參考)的基因的啟動子及其雜合物。尤其優(yōu)選用于絲狀真菌宿主細胞中的啟動子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(來自編碼黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構酶的基因的啟動子的雜合物)和glaA啟動子。另外的適用于絲狀真菌宿主細胞的啟動子是ADH3啟動子(McKnight等，TheEMBOJ.4(1985)，2093-2099)或tpiA啟動子。適用于酵母宿主細胞的啟動子的例子包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080;Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl,Gen.l(1982)，419-434)或醇脫氫酶基因(Young等，化學制品中所用的樣吏生物遺傳工程(GeneticEngineeringofMicroorganisamsforChemicals)(Hollaender等編輯)，Plenum出版社，紐約，1982)的啟動子,或TPIl(US4599311)或ADH2-4c(Russell等，Nature304(1983)，652-654)啟動子。其它的有用啟動子可以獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸鹽激酶基因。對于酵母宿主細胞來i兌有用的其它啟動子如文獻所述Romanos等，1992，Yeast8:423-488。在哺乳動物宿主細胞中，有用的啟動子包括病毒啟動子，如那些來自猿猴病毒40(SV40)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳頭瘤病毒(BPV)的啟動子。適用于哺乳動物細胞的啟動子的例子有SV40啟動子(Subramani等，Mol.CellBiol.l(1981)，854-864)、MT-1(金屬斬u蛋白基因)啟動子(Palmiter等，Sciences222(1983),809-814)或腺病毒2主要晚期啟動子。適用于昆蟲細胞的啟動子的例子是多角體蛋白啟動子(US4745051;Vasuvedan等,FEBSLett311,(1992)7-11)、P10啟動子(J.M.Vlak等,J.Gen.Virology69，1988,第765-776頁)、苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒堿性蛋白啟動子(EP397485)、桿狀病毒立即早期基因l啟動子(US5155037;US5162222)或桿狀病毒39K延遲早期基因啟動子(US5155037;US5162222)。29如果有必要，編碼本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的DNA序列還可以與適當?shù)慕K止子可操作地連接。本發(fā)明的重組載體可以進一步含有使載體能在所關心的宿主細胞內(nèi)復制的DNA序列。所說的載體還可以包含選擇性標記，如，其產(chǎn)物補充了宿主細胞中的不足的基因，或者抗性基因，如抗氨卡青霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素、新霉素、潮霉素、氨曱蝶呤等抗生素的抗性基因，或者抗重金屬、病毒或除草劑的抗性基因，或其產(chǎn)物造成原養(yǎng)型或營養(yǎng)缺陷型的基因。細菌選擇標記的例子是來自枯草桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，具抗性。常常使用的哺乳動物標記是二氫葉酸還原酶基因(DHFR)。適用于酵母宿主細胞的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記可選自以下，但不局限于此amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨曱?；D移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、trpC(氨基苯曱酸合酶)和glufosinate抗性標記，以及來自其它物種的等j介物。具體而言，用于曲霉細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標記以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar才示i己。jt匕夕卜，可以通過共專爭4匕完成選擇，如W091/17243所述，其中的選擇性標記在分開的載體上。為了指引本發(fā)明的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體進入宿主細胞的分泌途徑，可在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導序列、前原序列或前序列)。分泌信號序列在正確的閱讀框中與編碼所述酶的DNA序列連接。分泌信號序列通常置于編碼該酶的DNA序列的5，端。分泌信號序列可以是正常與所說酶相關的序列，或者可以來自編碼另一分泌蛋白質(zhì)的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動子以及任選地終止子和/或分泌信號序列，或者通過適當?shù)腜CR擴增方案裝配這些序列并將它們插入含復制或整合所必需信息的合適載體的技術都是本領域技術熟練人員眾所周知的(參閱，例如，Sambrook等的著作)?？梢詫⒁粋€以上拷貝的編碼本發(fā)明酶的核酸序列插入宿主細胞中以擴增核酸序列的表達。用本領域眾所周知的方法將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞中并對轉化體進行選擇可以實現(xiàn)核酸序列的穩(wěn)定擴增。本發(fā)明的核酸構建體還可包含編碼一種或多種有利于多肽表達的因子的一個或多個核酸序列，所述因子如，激活物(如，反式作用因子)、陪伴分子和加工蛋白酶。在所選宿主細胞內(nèi)起作用的任何因子都可用于本發(fā)明中。編碼一個或多個這樣因子的核酸不一定與編碼本發(fā)明多肽的核酸串聯(lián)。宿主細胞編碼本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的DNA序列對于其所進入的宿主細胞來說可以是同源或異源的。如果它與宿主細胞同源，即，由宿主細胞天然產(chǎn)生，它通?？刹僮鞯剡B接非其天然環(huán)境中的另一啟動子序列，或者，如果適當?shù)脑挘硪环置谛盘栃蛄泻?或終止序列。術語"同源的"意圖包括所編碼酶對于所述宿主生物體是天然酶的DNA序列。術語"異源的"意圖包括不是由宿主細胞天然表達的DNA序列。從而，該DNA序列可以來自另一生物體，或者可以是合成的序列。本發(fā)明的DNA構建體或重組載體所導入的宿主細胞可以是能生產(chǎn)本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的任何細胞，諸如原核生物如細菌等或真核生物，如酵母或絲狀真菌等真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物纟田月包。培養(yǎng)時能產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的細菌宿主細胞的例子是革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌，如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽胞桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(B.cimlans)、杣爛芽孢桿菌(B.lautus)、巨大芽孑包桿菌(B.megaterium)或蘇云金芽孑包桿菌(B.thuringiensis)等，或變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)等鏈霉菌(streptomyces)菌株，或者是大腸桿菌(E.cdi)或假單胞菌(Pseudomonassp.)等革蘭氏陰性細菌?？赏ㄟ^原生質(zhì)體轉化、電穿孔、接合或通過用感受態(tài)細胞以本質(zhì)已知的方式完成細菌的轉化(參閱，Sambrook等人，見上引文)。當枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體在大腸桿菌等細菌內(nèi)表達時，所說的酶可以保留在細胞質(zhì)內(nèi)，通常作為不溶性顆粒(稱作包涵體)，或者可以在細菌分泌序列的引導下進入周質(zhì)間隙。在前一種情況下，裂解細胞，回收顆粒并進行變性，然后通過稀釋變性劑使酶重折疊。在后一種情況下，可以通過用超聲波或滲壓休克法等方法破壞細胞，釋放周質(zhì)間隙內(nèi)容物并回收所說的酶，乂人而乂人周質(zhì)間隙中回收到所i兌的酶。當在芽孢桿菌或鏈霉菌菌株等革蘭氏陽性菌中表達枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體時，所il的酶可以保留在細胞質(zhì)中，或者可以在細菌分泌序列的指引下到達細胞外培養(yǎng)基。在后一種情況下，如下所述從培養(yǎng)基中回收所說的酶。宿主酵母細胞的例子包括假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、酵母屬(saccharomyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)、假絲酵母(Candida)、畢赤氏酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)或Yarrowia屬種的細胞。在一個具體的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母(S.carlsbergensis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母(S.diastaticus)、saccharomycesdouglasii、克魯弗酵母(S.kluyveri)、諾地酵母(saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(S.oviformis)纟田胞。其它有用的酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、Yarrowialipolytica、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilgomaylis)、Candidamaltose、季爾蒙氏畢赤酵母(Pichiaguillermondii)和Pichiamethanolio細胞(參閱，Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132,1986，第3459—3465頁；US4882279和US4879231)。因為酵母的分類在未來有可能會改變，就本發(fā)明的目的而言，應按如下文獻所述定義酵母酵母的生物學和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.，和Davenport,R.R.,編輯,Soc.App.Bacteriol.學術會議系列號9，1980)。酵母的生物學和酵母遺傳操作是本領域眾所周知的(參閱，如，酵母的生化和遺傳學(BiochemistryandGeneticsofYeast)，Bacil，M.，Horecker,B丄，和Stopani,A.O.M.，編輯，第二版，1987;酵母(TheYeasts)，Rose,A.H.,和Harrison，J.S.,編輯，第二版，1987;和酵母屬的分子生物學(TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces),Strathem等，編輯，1981)?？梢杂靡韵挛墨I所述的方法轉化酵母Becker和Guarente，InAbelson,J.N.和Simon,M.I.編輯，酵母遺傳學和分子生物學指南，酶學方法(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology),第194巻，第182-187頁，AcademicPressInc.,紐約；Ito等,1983，JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等,1978，ProceedingoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。絲狀真菌細胞的例子包括絲狀形式的真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門(Oomycota)(按文獻所定義的Hawksworth等，1995，同上引文)，尤其是它可以是以下菌屬的細胞枝頂孢屬(Acremonium)，如A.chrysogenum等；曲霉屬(Aspergillus),如泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、曰本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(A.niger)、構巢曲霉(A.nidulans)或米曲霉(Aoryzae);嫌孑包霉(Fusarium)，如桿孑包狀錄孑包(F.bactridioides)、F.cerealis、F.crookwellense、大刀嫌孑包(F.culmorum)、禾本牙牛錄孑包(F.graminerarum)、禾赤嫌孑包(F.graminum)、異孑包嫌孑包(F.heterosporum)、合5t欠木嫌孑包(F.negundi)、多枝鐮孢(F.reticulatum)、粉紅鐮孢(F.roseum)、接骨木鐮孢(F.sambucinum)、膚色錄孑包(F,sarcochroum)、石危色嫌孑包(Fsulphureum)、F.trichothecioides或尖嫌孑包(F.oxysporum);腐質(zhì)霉屬(Humicola),如H.insolens或H,lanuginose;毛霉屬(Mucor)，如米黑毛霉(M.miehei);毀絲霉屬(Myceliophthora),如M.thermophilum;脈孢霉屬(Neurospora),如粗糙脈孢霉(N.crassa);青霉屬(Penicillium)，^口產(chǎn)紫青審(P.purpurogenum);才炎孑包殼屬(Thielavia)，^口T.terrestris;Tolypocladium;或木霉屬(Trichoderma)，^口T.harzianum、康寧木霉(T.koningii)、T.longibrachiatum、T.reesei或綠色木霉(T.viride),或者其有性型或同物異名。利用曲霉屬菌種表達蛋白質(zhì)可參見如文獻EP272277、EP230023所述。昆蟲細胞的例子包括鱗翅目細胞系，如秋粘蟲細胞(spodopterafrugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞(參閱US5077214)。培養(yǎng)條件可適宜地如WO89/01029或WO89/01028所述?？砂次墨I所述進行昆蟲細胞的轉化和異源多肽的生產(chǎn)US4745051;US4775624;US4879236;US5155037;US5162222;EP397485。哺乳動物細胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞或可來自如美國典型培養(yǎng)物保藏中心等機構的其它永生化細胞系。轉染哺乳動物細胞并表達引入該細胞的DNA序列的方法參閱以下文獻Kaufinan和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982)，601-621;Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341;Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982)，422國426;Wigler等，Cell14(1978),725;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7(1981)，603;A腿bel等，分子生4勿學通用方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWileyandSons,Inc.,紐約，1987，Hawley-Nelson等，F(xiàn)ocus15(1993)，73;Ciccarone等，F(xiàn)ocus15(1993),80;Graham和vanderEb，Virology52(1973)，456;和Neumann等，EMBOJ.l(1982)，841-845?？梢杂肎raham和VanderEb的磷酸4丐沉淀法(1978,Virology52:546)通過直接攝取轉染哺乳動物細胞。表達和分離蛋白質(zhì)的方法為了表達本發(fā)明的酶，通常將用含有編碼本發(fā)明酶的核酸序列的載體所轉化或轉染的上述宿主細胞在允許期望分子產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)于適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后從細胞或培養(yǎng)液中回收這些分子。用于培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基可以是適于宿主細胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如含適當補充物的基本或復雜培養(yǎng)基。適當?shù)呐囵B(yǎng)基可獲自供應商或可以按已公布的配方制備(如，參閱美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。培養(yǎng)基也可以用本領域已知的方法制備(參閱，如，有關細菌和酵母的文獻；Bennett,J.W.和LaSure，L.編輯，真菌中更多的基因操作(MoreGeneManipulationsinFungi),AcademicPress,CA,1991)。如果本發(fā)明的酶分泌至營養(yǎng)培養(yǎng)基中，它們可以直接從培養(yǎng)基中回收。如果它們不分泌，則可以^^細胞裂解物中回收。本發(fā)明的酶可以用常M^方法回收自培養(yǎng)基，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細胞，用硫酸銨等鹽沉淀上清液或濾液中的蛋白質(zhì)性組分，用各種層析方法進行純化，如，離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析等等，具體方法取決于目的酶。本發(fā)明的酶可以用本領域已知對這些蛋白質(zhì)特異的方法進行檢測。這些檢測方法包括特異抗體的使用、產(chǎn)物的形成或底物的消失。例如，酶檢測法可以用于測定所說分子的活性。用于測定各種活性的方法是本領域所已知的。本發(fā)明的酶可以用本領域已知的各種方法進4亍純化，包括但不局限于，層析法(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，制備型等電聚焦(IEF))、差異溶解(如，硫酸銨沉淀)或提取(參閱，如，蛋白質(zhì)純4匕(ProteinPurification)，J—CJanson和LarsRyden，編輯，VCHPublishers,紐約，1989)。當含有編碼本發(fā)明酶的DNA序列的表達載體被轉化/轉染入異源宿主細胞后，可以實現(xiàn)該酶的異源重組生產(chǎn)。使用異源宿主細胞的優(yōu)勢是，可以產(chǎn)生高度純化的酶組合物，其特征是不含有同源雜質(zhì)(當?shù)鞍踪|(zhì)或肽表達于同源宿主細胞中時常常存在這些同源雜質(zhì))。在此上下文中，同源雜質(zhì)指來源于本發(fā)明酶最初來自的細胞的同源細胞的任何雜質(zhì)(如，除了本發(fā)明酶之外的其它多肽)。商品化的酶應用本發(fā)明還涉及含本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的組合物。例如，可以將枯草桿菌酶/枯草桿菌酶變體應用于個人護理用的組合物，如洗發(fā)香波、皂條、潤膚液、潤膚霜、染發(fā)劑、牙膏、隱形眼鏡、化妝品(cosmetics)、化妝用品(toiletries)，或者是處理紡織品的組合物、制備食品的組合物(如烘焙的食物或飼料)，或者是清潔組合物，如洗滌劑、洗盤組合物或清潔硬表面的纟且合物。洗滌劑本發(fā)明的枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體可用于如洗滌劑組合物中。它可以以無粉塵顆粒、穩(wěn)定液體或受保護的酶的形式包含于洗滌劑組合物中。無^)=分塵顆粒可以*接，如US4106991和4661452所述產(chǎn)生，且可任選的用本領域已知方法進行包衣。蠟樣包衣材料的例子有平均分子量IOOO-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);含16-50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；其中的醇具有12-20個碳原子且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯和甘油三酯。適于通過流化床技術應用的形成薄膜的包衣材料的例子可見于專利GB1483591。例如，按照已建立的方法通過添加多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸可以穩(wěn)定液體枯草桿菌酶/枯草桿菌酶制品。其它的酶穩(wěn)定劑是本領域眾所周知的。受保護的枯草桿菌酶/枯草桿菌酶變體可以按EP238216中所公布的方法制備。洗滌劑組合物可以制備成任何方便的形式，如粉、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含多達70%的水和0-30%的有機溶劑，或35者是非水性的。洗滌劑組合物可以包含一種或多種表面活性劑，其中每一種都可以是陰離子的、非離子的、陽離子的或兩性離子的。洗滌劑通常含0-50%陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、a-烯烴磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)(AS)、醇乙氧基硫酸鹽(AEOS或AES)、仲型鏈烷磺酸鹽(SAS)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。它還可以包含0-40%的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧基化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二曱胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺或多羥基烷基脂肪酸酰胺(如,WO92/06154中所述)。洗滌劑組合物可另外含有一種或多種其它酶，如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪分解酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶和其它抗微生物多肽。洗滌劑可以含有l(wèi)-65%的助洗劑或絡合劑，如，沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基-琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(如，來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑也可以是未復配的，即，基本上不含助洗劑。洗滌劑還可以包含一種或多種聚合物。例如，羧曱基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸鹽、聚丙烯酸鹽、馬來酸/丙烯酸共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其中可以包括過硼酸鹽或過碳酸鹽等過氧化氫來源，它們可以與四乙?；叶?TAED)或壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS)等形成過酸的漂白活化劑組合?；蛘撸左w系中可以含有酰胺、酰亞胺或^5風類等過氧酸。洗滌劑組合物可以用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定，如，丙二醇或丙三醇等多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸衍生物，且可以按例如WO92/19709和或WO92/19708所述配制所說的組合物。洗滌劑中還可以包含其它常規(guī)的洗滌劑成分，如織物調(diào)理劑，包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺細菌劑、焚光增白劑或香料。pH(在使用濃度的水溶液中檢測到的)值通常是中性或堿性的，如，在7-ll的范圍內(nèi)。洗盤組合物此外，本發(fā)明的枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體還可用于洗盤洗滌劑中。洗盤洗滌劑組合物通常含有表面活性劑，該表面活性劑可以是陰離子的、非離子的、陽離子的、兼性的或這些類型的混合物。該洗滌劑可以含有0-卯％的非離子表面活性劑，如低泡至無泡型乙氧基化丙氧基化直鏈醇。劑可以細分為含磷和不含磷的類型。所說的洗滌劑組合物通常含l-90%的助洗劑。當存在含磷無機堿性助洗劑時，其例子包括水溶性鹽，尤其是堿金屬焦磷酸鹽、正磷酸鹽和多磷酸鹽。當存在含磷有機堿性助洗劑時，其例子包括膦酸的水溶性鹽。當存在不含磷的無機助洗劑時，其例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽以及各種類型的水不溶性結晶的或無定形的硅鋁酸鹽，其中沸石是最熟知的代表。適宜的有機助洗劑的例子包括(堿金屬、銨和取代的銨的)檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸鹽、脂肪酸磺酸鹽、羧曱氧基琥珀酸鹽、聚乙酸銨鹽、羧酸鹽、多羧酸鹽、氨基多羧酸鹽、聚乙酰基羧酸鹽和多羥基磺酸鹽。其它合適的有機助洗劑包括已知具有助洗劑特性的較高分子量的聚合物和共聚物，例如，適當?shù)木郾┧帷⒕垴R來酸和聚丙烯酸/聚馬來酸共聚物及它們的洗盤洗滌劑組合物可以包含氯型/溴型或氧型的漂白劑。無機氯/溴型漂白劑的例子是鋰、鈉或4丐的次氯酸鹽和次溴酸鹽以及氯化磷酸三鈉。有機氯/溴型漂白劑的例子是雜環(huán)N-溴和N-氯酰亞胺如三氯異氰尿酸、三溴異氰尿酸、二溴異氰尿酸和二氯異氰尿酸，以及它們與鉀和納等水溶性陽離子的鹽。乙內(nèi)酰脲化合物也是適合的。氧漂白劑可以是無機過酸鹽的形式，尤其是與漂白前體一起或作為過氧酸化合物。合適的過氧漂白劑化合物的例子包括石咸金屬過硼酸鹽，如四水化物和一水化物，以及堿金屬過碳酸鹽、過硅酸鹽和過磷酸鹽。活化劑37物質(zhì)尤其可以是TAED和甘油三乙酸酯。洗盤洗滌劑組合物可用常規(guī)的酶穩(wěn)定劑進行穩(wěn)定，如多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸書于生物。洗盤洗滌劑組合物還可包含其它的常規(guī)洗滌劑成分，如，抗絮凝劑物質(zhì)、填充物質(zhì)、抑泡劑、防蝕劑、污垢懸浮劑、螯合劑、抗污垢再沉積劑、脫水劑、染料、殺細菌劑、熒光增白劑、增稠劑和香料。最后，本發(fā)明的枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體可用于常規(guī)的洗盤洗滌劑中，如用于以下專利文獻所述的任何洗滌劑中EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP516554、EP516555、GB2200132、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、WO93/17089、DE4205071、WO52/09680、W093/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、EP429124、W093/21299、US5141664、EP561452、EP561446、GB2234980、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP346137、US5112518、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、GB2228945、CA2006687、W093/25651、EP530635、EP414197、US5240632。個人護理應用本發(fā)明枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體的另一應用領域是個人護理領域，其中目的用戶與蛋白質(zhì)有緊密的接觸，且在實驗設置中已遇到了某些變應原性問題(Kelling等，J.All.Clin.Imm.，1998，第101巻，第179-187頁，和Johnston等，Hum.Exp.Toxicol.,l"9,第18巻，第527頁)。首先，本發(fā)明的綴合物或組合物可以有利地用于個人護理產(chǎn)品，如頭發(fā)護理和頭發(fā)處理產(chǎn)品。這包括香波、香膏、頭發(fā)調(diào)理劑、巻發(fā)劑、染發(fā)組合物、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、洗發(fā)水、護發(fā)素、噴發(fā)膠等產(chǎn)品。此外所考慮的是口腔護理產(chǎn)品，如潔齒劑、漱口水、口香糖。還考慮的是皮膚護理產(chǎn)品和化妝品，如護膚霜、護膚乳、清潔霜、清潔露、清潔蜜、冷霜、皂膏、滋養(yǎng)精華、皮膚洗液、乳狀洗液、爐甘石洗液、護手霜、皂粉、透明皂、曬黑油(sunoil)、防曬劑、剃須泡沫、剃須膏、嬰兒潤膚油、唇膏、唇霜、膏狀粉底、搽臉粉、眼影粉、脂粉、粉底、化妝底霜、香精4分(essencepowder)、增白4分。本發(fā)明的枯草桿菌酶和/或枯草桿菌酶變體還可有利地用于隱形眼鏡衛(wèi)生產(chǎn)品中。這些產(chǎn)品包括清潔和消毒隱形眼鏡的產(chǎn)品。食品和飼料本發(fā)明的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶還可用于食品或飼料產(chǎn)品中。例如，所說的枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶可用于改變生面團的面筋狀態(tài)，如，用蛋白酶使硬的小麥面粉變軟。另一例子是在釀酒工業(yè)中，其中所說的枯草桿菌酶變體/枯草桿菌酶可用于未制成麥芽的谷物一起釀造并/或用于控制氮含量。在動物飼料工業(yè)中，所說的枯草桿菌酶變體和/或枯草桿菌酶可用于好比擴大動物的消化系統(tǒng)。材泮+和方法材料ELISA試劑標記了辣根過氧化物酶的豬抗兔Ig(Dako,DK,P217，稀釋度l:1000)小鼠抗大鼠IgE(SerotecMCA193;稀釋度l:200)生物素標記的小鼠抗大鼠IgGl單克隆抗體(Zymed03-9140;稀釋度l:1000)生物素標記的大鼠抗小鼠IgGl單克隆抗體(SerotecMCA336B;稀釋度1:2000)鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Kirkegard&Perry14-30-00;稀釋度l:1000)OPD:鄰苯二胺(Kementec目錄號4260)常規(guī)方法制備的兔抗Savinase多克隆IgG常規(guī)方法制備的大鼠抗Savinase多克隆IgE緩沖液和溶液-PBS(pH7.2(l升))NaCl8.00gKC10.20gK2HP041.04gKH2P040.32g-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-對硝基-酰苯胺(Sue-AAPF-pNP)Sigma編號S-7388,Mw624.6g/mol。方法用ELISA測量s.c.小鼠中特異性IgE的濃度按照以下步驟用三層夾心ELISA法測定小鼠中應答皮下(S.C.)注射的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的特異IgE血清抗體的相對濃度1)用10jxg大鼠抗小鼠IgE(SerotechMCA419;稀釋度l:100)緩沖液l包被ELISA-平板(50pL/孔)。在4。C保溫過夜。2)傾去平板中的溶液并用含2°/。(重量/體積)脫脂奶的PBS在室溫封閉至少半小時(200laL/孔)。輕輕搖晃。用含0.05%(體積/體積)Tween20的PBS洗平板3次。3)平板與小鼠血清一起保溫(50pL/孔)，所述血清從未稀釋的濃度開始并持繼作2倍稀釋。保留某些孔不加血清而僅加入緩沖液4(空白)。室溫保溫30分鐘。輕輕搖晃。用含0.05%(體積/體積)Tween20的PBS漂洗平板3次。4)用含0.05%(體積/體積)Tween20、0.5%(重量/體積)脫脂奶的PBS將枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體稀釋至適當?shù)牡鞍诐舛取Ｒ?0pL/孔的量室溫保溫30分鐘。輕輕搖晃。用含0.05%(體積/體積)Tween20的PBS漂洗平板3次。5)將用于檢測所結合抗體的特異多克隆抗枯草桿菌酶或抗枯草桿菌酶變體抗血清的血清(plg)稀釋于含0.05%(體積/體積)Tween20、0.5%(重量/體積比)脫脂奶的PBS中。以50jxL/孔的量室溫保溫30分鐘。輕輕搖晃。用含0.05%(體積/體積)Tween20的PBS漂洗平板3次。6)將綴合了辣根過氧化物酶的抗plg抗體稀釋于含0.05。/。(體積/體積)Tween20、0.5%(重量/體積比)脫脂奶的PBS中。以50jaL/孔的量室溫保溫30分鐘。輕輕搖晃。用含0.05°/。(體積/體積)Tween20的PBS漂洗平板3次。7)將0.6mgODP/ml+0.4jiLH202/ml于pH5.2的檸檬酸鹽緩沖液中混合。8)溶液在臨用前制備并保溫10分鐘。9)50pL/孔。10)加入50jxL2NH2S(V孔終止反應。11)平板在492nm波長處讀數(shù)，以620nm的讀數(shù)為參照。用抗小鼠-IgG和標準大鼠IgG試劑可以進行IgG的類似測定。用ELISA測定在MINT試驗中特異IgE的濃度按照以下步驟用三層夾心ELISA法測定小鼠體內(nèi)應答鼻內(nèi)施用的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的特異IgE血清抗體的相對濃度1)用100[iL/孔大鼠抗小鼠IgE重鏈(1:100稀釋于0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.6中的HD—212—85—IgE3)包被ELISA—平板(NuncMaxisorp)。在4。C保溫過夜。2)傾去平板中的溶液并用200[xL/孔含2。/。脫脂奶的0.15MPBS緩沖液(pH7.5)在4。C封閉1小時。用含0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液漂洗平板3次。3)平板與小鼠血清稀釋物一起保溫(100(iL/孔)，所述稀釋物從8倍稀釋開始并由此2倍稀釋于含0.5。/。脫脂奶和0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液中。包括適當稀釋度的陽性和陰性對照血清樣品加上緩沖液對照。室溫保溫l小時。輕輕搖晃。用含0.05Q/。Tween20的0.15MPBS緩沖液漂洗平板3次。4)將在含0.5。/o脫脂奶和0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液中稀釋至lfig蛋白/ml的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體以100^iL/孔的量加入平板中。將平板在4。C保溫1小時。用含0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液漂洗平板3次。5)將用于檢測所結合抗原的特異多克隆抗枯草桿菌酶或抗枯草桿菌酶變體抗血清的血清(plg)稀釋于含0.5。/。脫脂奶和0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液中。以100ixL/孔的量在4。C保溫l小時。用含0.05。/oTween20的0.15MPBS緩沖液漂洗平板3次。6)將l:1000稀釋于含0.5。/。脫脂奶和0.05。/。Tween20的0.15MPBS緩沖液中且與辣根過氧化物酶綴合的豬抗兔Ig以100nL/孔的量加入平板中。4°C保溫1小時。用含0.05。/oTween20的0.15MPBS緩沖液漂洗平板3次。7)在平板中加入250fiL/孔0.1M檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH5.0。41保溫約1分鐘。然后傾空平板。8)在平板中加入100[iL/孔的鄰苯二胺(OPD)溶液(10mgOPD稀釋于12.5ml杵檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液pH5.0中，臨用前加入12.5pL30%過氧化氫)。室溫保溫4分鐘。9)加入150pL/孔的1MH2S04終止反應。10)平板在490nm波長處讀數(shù)，以620nm的讀數(shù)為參照。蛋白質(zhì)工程通過對相應核酸序列進行定點誘變獲得Savinase/枯草桿菌酶變體，方法參閱例如文獻Sambrook等，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，(MolecularCloning.ALaboratoryManual),冷泉港，紐約?？贵w結合能力的檢測CovaLink平板的活化將丙酮中的10mg/ml氰尿酰氯新鮮貯液攪拌下在PBS中稀釋至終濃度lmg/ml并立即等分至CovaLinkNH2平板(Nunc)中(100^!7孔)且室溫保溫5分鐘。用PBS漂洗3次后，將平板在50。C干燥30分鐘，用密封膠密封，然后在塑料袋中室溫保存不超過3周?？贵w/竟爭性抗原的固定已活化的CovaLinkNH2平板用PBS中的期望蛋白質(zhì)(5嗎/ml)100pL在4°C包被過夜，隨后用含2%(重量/體積)脫脂奶的PBS室溫保溫30分鐘并用含0.05%(體積/體積)Tween20的PBS漂洗4次。蛋白酶活性用Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的鍵產(chǎn)生在405nm處有吸收的可見黃色。簡而言之，將1OOmgsue-AAPF-pNa溶于lml二曱亞砜(DMSO)中。1OOiiL此溶液用Britton和Robinson緩沖液，pH8.3稀釋至10ml并用作蛋白酶的底物。在分光光度計上對反應進行動力學檢測。結合抗Savinase抗體的能力的測定通過如下方法比較枯草桿菌酶/枯草桿菌酶變體與Savinase之間結合抗Savinase抗體的能力用小鼠抗大鼠IgE單克隆抗體包被CovaLinkNH2平板并隨后用抗Savinase特異性大鼠多克隆IgE飽和這些抗體。將平板與抗原一起保溫，所述抗原即Savinase(對照)、待測試結合能力的枯草桿菌酶(如，表達枯草桿菌酶變體的枯草桿菌酶文庫)。通過與抗野生型Savinase多克隆兔抗血清一起保溫測定已結合的抗原的量?；钚晕稽c的功能性的測定將"主鏈蛋白酶"抑制劑固定于孔中并與過量的蛋白質(zhì)變體和已標記的抗體一起保溫。測定所結合的抗體的水平。將25fxL樣品和25iaL抗Savinase抗體(均稀釋于含0.05%(V/V)Tween20、0.5%(重量/體積比)脫脂奶的PBS中)加入已包被的孔中并室溫保溫(30分鐘)。去除上清液并用含0.05%(V/V)Tween20的PBS洗孔3次。加入50pL標記了HRP的物種特異性抗Ig抗體并保溫30分鐘，然后用含0.05%(V/V)Tween20的PBS洗孔3次。最后，加入50(iLODP-H202混合物并對A492進行動力學測量以確定已結合的抗體的水平。調(diào)整稀釋度使"主鏈蛋白質(zhì)"不產(chǎn)生或產(chǎn)生極低水平的結合抗體。分析獨立樣品的功能性并將兩個值進行比較。期望的蛋白質(zhì)變體顯示出與"主鏈抗體"相比結合抗體的水平至少高2倍或低2倍(5抗體結合值至少為2)且同時功能性水平與"主鏈蛋白質(zhì)"的相似。實施例實施例lSavinase中表位序列和表位模式的鑒別按先前WO01/83559實施例1中所述沖企測表位序列和模式。從作為膜蛋白的一部分表達隨機六肽、九肽或十二肽的高度多樣性噬菌體文庫(1012)中篩選它們結合純化的特異兔IgG、及純化的大鼠和小鼠IgGl和IgE抗體的能力。噬菌體文庫按現(xiàn)有技術得到(參閱在此收編作為參考的WO9215679)。通過皮下注射、皮內(nèi)注射或氣管內(nèi)注射包括溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)的Savinase和其它枯草桿菌酶在內(nèi)的所選擇把蛋白(N=75)，在相應的動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體。通過用承載有豬抗兔IgG、小鼠抗大鼠IgGl或IgE或大鼠抗小鼠IgGl或IgE抗體的順磁性免疫珠(DynalAS)進行親和層析從被免疫動物的血清中純化相應的抗體。將相應的噬菌體文庫與IgG、IgGl和IgE抗體包裹的珠子一起保溫。通過將這些順磁性珠子暴露于磁場中收集所表達的寡肽與兔IgG或大鼠或小鼠IgGl或IgE抗體具有親和力的噬菌體。用溫和的酸處理將收集到的噬菌體從固定化的抗體上洗脫下來，或者用完整的酶進行洗脫。按本領域技術所知道的方法擴增分離的噬菌體?；蛘?，用固定的噬菌體直接與大腸桿菌一起保溫進行感染。簡而言之，在輔助噬菌體(如，M13K07)存在的條件下用M13來源的載體感染F-因子陽性的大腸桿菌(如，XL-1Blue、JM101、TG1)并進行保溫，通常在含葡萄糖或IPTG的2xYT培養(yǎng)基中，且其中含適當?shù)目股匾员阌糜谶x擇。最后，離心除去細胞。在相應的細胞上清液上重復此事件周期2-5次。在2、3、4和5輪選擇循環(huán)后，將部分被感染的大腸桿菌在選擇性2xYT瓊脂平板上孵育，并對出現(xiàn)的噬菌體的特異性進行免疫學評估。由此，噬菌體被轉移到硝酸纖維素(NC)膜上。對于每個平板，做兩張NC復制膜。將一張復制膜與篩選抗體一起保溫，另一張復制膜與篩選抗體和用作竟爭者的用于得到抗體的免疫原一起保溫。在免疫原存在下缺失的那些噬菌斑纟皮i/v為是特異的，并按上述方法對其進行擴增。在聚乙二醇存在下通過離心從細胞上清液中分離特異的噬菌體克隆。分離DNA，PCR擴增編碼所說寡肽的DNA序列，測定此DNA序列，以上所有步驟均按標準方法進行。從DNA序列中推斷相應寡肽的氨基酸序列。由此得到了對上述的蛋白質(zhì)特異抗體具有特異性的許多肽序列。這些序列收集于數(shù)據(jù)庫中，并通過序列比對進行分析以鑒定表位模式。對于此序列比對而言，保守性替代(如，天冬氨酸替代谷氨酸、賴氨酸替代精氨酸、絲氨酸替代蘇氨酸)被認為是一種。結果顯示大部分序列特異于抗體所抗的蛋白質(zhì)。不過，從只進行了2輪篩選的噬菌體中得到了幾個交叉反應的序列。在此第一輪中鑒定了22個表位模式。在更多輪的噬菌體展示中，得到了更多的抗體結合序列，從而獲得了更多的表位模式。此外，查找了文獻中已發(fā)現(xiàn)的結合環(huán)境變應原特異性抗體的肽序列(JAllClinImmunol93(1994)第34-43頁；IntArchApplImmunol103(1994)第357-364頁;ClinExpAllergy24(1994)第250-256頁；MolImmunol29(1992)第1383-1389頁；JImmunol121(1989)第275-280頁；JImmunol147(1991)第205—211頁；MolImmunol29(1992)第739—749頁；MolImmunol30(1993)第1511—1518頁；MolImmunol28(1991)第1225-1232頁；J.Immunol151(1993)第7206—7213頁)。這44些抗體結合肽序列均被包括在數(shù)據(jù)庫中。將這些序列收集在數(shù)據(jù)庫中，并通過序列比對進行分析以鑒定表位模式。對于此序列比對而言，保守性替代(如，天冬氨酸替代谷氨酸、賴氨酸替代精氨酸、絲氨酸替代蘇氨酸)被認為是一個。結果顯示大部分序列特異于抗體所抗的蛋白質(zhì)。不過，表位模式顯示出可交叉適用于蛋白質(zhì)、抗體類型和動物物種。到目前為止鑒定了75個表位模式。在Savinase的3D-結構上對這些表位才莫式進行自動評估(如WO01/83559中所述)并計算各氨基酸是其中一部分的潛在表位的數(shù)目(在表l中稱為頻率)(表l)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實施例2潛在IgE表位中所涉及的氨基酸位置在Savinase三維結構上的定位用適當?shù)能浖?如SwissPortPdbViewer,WebLiteViewer)將發(fā)現(xiàn)的最有可能包含于潛在IgE表位中的氨基酸位置(通常這些氨基酸是被發(fā)現(xiàn)有可能至少涉及3個IgE表位的氨基酸)手工定位于Savinase的三維結構上(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫登錄號1SVN;Betzel,C.,Klupsch，S.，Papendorf,G.，Hastrup，S.，Branner，S.，Wilson,K.S.:來自遲緩芽孢桿菌的堿性蛋白酶Savinase在1.4^矣分，碎率的晶體結構(CrystalstructureofthealkalineproteinaseSavinasefromBacilluslentusat1.4Aresolution),JMolBiol223第427頁(1992))。通過將氨基酸定位于三維結構上，發(fā)現(xiàn)可能涉及IgE表位的氨基酸簇集于3個主要區(qū)域參區(qū)域l:P14、A15、R19、G20、T22、A272、R275參區(qū)域2:A48、F50、P52、E54、P55、S57、D60、G61、K94、V104、Q109*區(qū)域3:P129、S130、E136、N140、S161、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、L196、R247、T260、L262*位置P39和N218是孤立存在的實施例3將蛋白質(zhì)工程所選擇的氨基酸位置在Savinase三維結構上定位基于結構和酶活性相關的考慮因素選擇用于表位蛋白質(zhì)工程的氨基酸，這意味著優(yōu)先選擇通過3D分析或來自其它蛋白質(zhì)工程設計的經(jīng)驗提示將對酶的活性和/或穩(wěn)定性有有益作用的位置。所選擇的氨基酸在以下區(qū)域中*區(qū)域l:A15、R19、R275*區(qū)域2:S57區(qū)域3:E136、N140、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、R247、T260、L262*位置N218將這些位置分別或相互聯(lián)合進行人工改造。基于各個突變的性能和/或拓樸圖式樣(以盡可能少的突變覆蓋盡可能大的區(qū)域)選擇位置聯(lián)合。以這些考慮為基礎，發(fā)現(xiàn)表2中所示的位置和位置的聯(lián)合將與為獲得免疫原性改變/變應原性降低的枯草桿菌酶而進行的改造相關。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>實施例4檢測抗體結合能力降低了的Savinase變體通過評估表達于芽孢桿菌屬種中的實施例3的酶活性變體的抗體結合能力改變對有希望的變體進行鑒定。至少2倍的抗體結合能力改變(A結合)被認為是顯著的改變(PO.05)。子克隆實-瞼室手冊(Molecularcloning:Alaboratorymanual)(Sambrook等(1989)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯))。A結合值至少為2.0的枯草桿菌酶變體及其抗體結合能力如表3中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>E136R+N140D2.1N140D+A172D3.8Y167I+R170L+N218S4.8Yl67I+R170L+A194P+N218S3.2R170F2.4R170L+Q206E2.1D181N2.9R247E2.0R247H2.0R247K2.0R247Q2.0R275E2.0S57P+Y167F+R247Q3.0S57P+R170L+R247Q2.1實施例5檢測Savinase變體在皮下注射小鼠模型中降低了的變應原性用50nL0.9%(重量/體積)NaCl(對照組)或含10嗎蛋白質(zhì)的50pL0.9%(重量/體積)NaCl每周皮下注射免疫小鼠，共20周。每一組中含10只購自Bomholdtgaard,Ry，丹麥的雌性Balb/C小鼠(約20克)。每隔一周在下一次免疫前從眼部收集血液樣品(100|iL)。通過血液凝結和離心得到血清。對于各個變體和Savinase,計算20周后在同一組每只小鼠中所4企測到的IgE水平的總和(綜合IgE水平)。將Savinase的綜合IgE水平設為100。/。，參照Savinase計算變體的綜合IgE水平。表4顯示了這些變體的綜合IgE水平比Savinase至少低33。/。，這被發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計學上不同于Savinase。表4:變體與Savinase相比的綜合IgE百分數(shù)S57P+R170L13S57P+R170L+R247Q5Y167I+R170L+N218S15R170F11D181N17R247E30R247H26R247Q17實施例6檢測Savinase變體在體內(nèi)降低了的變應原性(MINT試驗)小鼠鼻內(nèi)(MINT)模型(Robinson等，F(xiàn)und.Appl.Toxicol.M,第15-24頁，1996年)。在實驗的第一天和第三天用蛋白質(zhì)對小鼠進行鼻內(nèi)施藥，隨后每周給藥，持續(xù)6周。收集研究開始后第15、31和45天的血液樣品。隨后分析血清的IgGl或IgE水平。將變體S57P+R170L+R247Q、S57P+R247Q和S221C(無活性)與Alcalase⑧和Savinase⑧(在0.9。/oNaCl中)進行比較。平均效價如表5中所示IgGl和IgE效價表示為給出陽性ELISA讀數(shù)的最高稀釋度的倒數(shù)(轉換成log2)。如果讀數(shù)高于陰性對照的平均OD值+2x標準差，此讀數(shù)被認為是陽性的。每個劑量水平用了6只小鼠且結果表示為組平均效價。表5IgGl第15天__劑量(嗎蛋白質(zhì)/只動物)S57P+R170L+R247QS221CS57P+R247QSavinase10n.d.1.762n.d.n.d.314.83003.83315.8300.50.8300.31.1700000.10010.500.030n.d.n.d.1.17049IgE第31天<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>IgE第45天<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>n.d.=未測定,人表5中可以推斷，與基準蛋白質(zhì)Alcalase和Savinase相比，變體S57P+R170L+R247Q、S221C和S57P+R247Q引起抗原特異性IgGl和IgE抗體產(chǎn)生的潛能要低得多。實施例7檢測Savinase變體的洗滌性能以下實施例提供了在所示條件下進行的多個洗滌試驗的結果。洗滌劑是失活的商品化洗滌劑，即，制備洗滌劑溶液并在微波爐中85。C加熱5分鐘使其失活。pH值為目前洗滌劑溶液中的pH，未調(diào)節(jié)。通過在milli-Q水中添加CaCl/2H20、MgCl2*6H20、NaHC03(Ca2+:Mg2+:HC03-=2:1:6)調(diào)節(jié)水的硬度。洗滌條件是1)失活的商品化Tide粉lg/1，30°C，12分鐘洗滌，6dH。2)失活的商品化Tide液1.5g/1,30°C,12分鐘洗滌，6dH。試驗材料是污染了血/奶/炭黑的聚酯/棉布樣。洗后，用J&MTidasMMS分光光度計在460nm處測定試驗材料的反射率(reflectance,R)。按制造商說明書進行測定。Rs體用變體洗滌的試驗材料的反射率R空白不用酶洗滌的試驗材料的反射率A反射率R變體-R空白A反射率越高，洗滌性能越好。以5nM酶的劑量計算A反射率。表6顯示了在小鼠體內(nèi)展現(xiàn)變應原性最低(根據(jù)IgE產(chǎn)量)的4種枯草桿菌酶變體在Tide粉末洗滌劑中的洗滌性能結果。表6變體A反射率性能空白0.0Savimse5.0R170F6.42S57P+R170L7.02S57P+R170L+R247Q8.92Y167I+R170L+N218S7.32表7顯示了在小鼠體內(nèi)展現(xiàn)變應原性最低(根據(jù)IgE產(chǎn)量)的4種枯草桿菌酶變體在Tide液體洗滌劑中的洗滌性能結果。表751<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>性能-1:比Savinase差0:與Savinase相似1:比Savinase好2:比Savinase好得多序列表<110>NovozymesA/S<120>具有改變的免疫原性的枯草桿菌酶和枯草桿菌酶變體<130>10194.OOO-DK<160>1<170>Patentlnversion3-1<210>1<211>269<212>PRT<213>遲緩芽孢桿菌<220><221>M工SC一FEATURE<222>(3)..(4)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(27)，.(27)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(55)..(55)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(74〕.(74)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(85)..〔85)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>〔97).,(97)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(99)..(99)<223>X<220><221>MISC_F￡ATUR￡<222>(101)..(101)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(102)..(102)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(121).(121)<223>X<220>54<:221>M工SCFEATURE<222>(157)..(157)<223>X《220><221>M工SC—FEATURE<222>(164).(164)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(175).■(175)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(188)..(188)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(193),(193)<223>X<220><22i>m:csc_feauire<223>X<220><221>MISC一FEATURE<222>(211)..(211)<223>X55<:220><223>misc_feature<222>(216〕..(216)<223>X<220><22i>m:csc_feature<222>(226).(226)<223>X<220><221>miscufea丁ure<222>(230),.(230)<223>x<220><221>misc_feature<222>(239),.(239)<223>X<220><221>misc—feature<222>(241)..〔241)<223>X<220>《221>MISC_FEATimE<222>(242).,(242)<223>X<220><221>MISC_FEATUR￡<222>(246).〔246)<223>X<220><221>MISC_FEATURE<222>(268)..(268)<223>X<400>1AlaGinxaaXaaProTrpGlylie1SSerArgVal10GinAlaProAlaA"U15HisAsnArgGl:yLeuThrG，.ySerGlyValXaavalAlavalLeuAsp202530ThrGlylieSerThrHisProAspLeuAsnlieArgGlyGlyAlaser354045PhevalProGlyGluProxaaThrGinAspGlyAsnGl:yHisGlyThr505560HisvalAlaGlyThrlieAlaAlaLeuXaaAsnserlieGlyvalLeu65707580GlyvalAlaProxaa.AlaGluLeuTyrAlavalLysValLeuGlyAla859095xaaGlyxaaGlyxaaxaaS:erserlieAlaGinGlyLeuGluTrpAla100105110GlyAsnAsnGlyMetHisvalAlaXaaLeu'SerLeuGlyserPro.Se:r115120125proserA，aThrLeuGluGinAlaval.ASnserAlaThrSerArgGly130135140valLeuvalvalAlaAla.SerGlyAsnSerGlyAl.axaaS.erlieSer145150155160TyrProAlaXaa丁yrAlaA幼Ala.Met:Ala.ValGlyAlaThrxaaGin165170175AsnAsnAsnArgAlaserPheSerGinTyrGlyxaaGlyLeuAsp'lie180185190xaaAlaProGlyValAsnxaaGinSerThrTyrProGlyserThrTyr195200205AlaserxaaAsnGlyThrserMetAlaThrProHisValAlaGlyAla21021S220AlaxaaLeuValLysxaaLysAsnproserTi"pserAsnva"IXaa工le22S230235240XaaxaaHisLeuLysXaaThrAlaThrserLeuGlySerThtAs:tlLeu2&250255Tyr'GlySerGlyLeuValAsnAlaG，uAlaAlaxaaArg260265.權利要求1.枯草桿菌酶變體，其中將位置247通過缺失或取代為如下殘基中的一個來進行修飾A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。2.權利要求1的變體，其中在位置247中的修飾是缺失或取代為如下殘基之一E、H、K、Q。3.枯草桿菌酶變體，其中修飾位置247與在如下位置中至少一個的修飾組合170和57。4.權利要求3的變體，其中在位置170中修飾是缺失或取代為如下殘基中的一個F、L。5.權利要求3的變體，其中在位置57中修飾是缺失或取代為如下殘基中的一個P。6.前述權利要求中任一項的變體，其中所述變體是如下之一X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q。7.枯草桿菌酶變體，其中將位置221通過取代為C來進行修飾。8.根據(jù)前述權利要求中任一項的變體，其中在枯草桿菌蛋白酶中進行所述修飾。9.前述權利要求中任一項的變體，其中在I-S1型或I-S2型枯草桿菌酶中進行所述修飾。10.權利要求9的變體，其中枯草桿菌酶選自枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶PB92、BLAP和K16、枯草桿菌蛋白酶BPN，、枯草桿菌蛋白酶amylosaccharitus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸系膜肽酶、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg和枯草桿菌蛋白酶DY。11.編碼前述權利要求中任一項的枯草桿菌酶變體的DNA序列。12.包含權利要求1-10中任一項的枯草桿菌酶變體的組合物。全文摘要本發(fā)明涉及具有改變的免疫原性的枯草桿菌酶和枯草桿菌酶變體，尤其是具有降低了的變應原性的枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶。枯草桿菌酶變體在第57位已修飾，而且在第170、181和247位中的至少一個位點也已修飾。所用的位置編號指來自淀粉液化芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶Novo(BPNAE)的位置。此外，本發(fā)明涉及所說枯草桿菌酶變體和枯草桿菌酶的表達及其在諸如洗滌劑和口腔護理產(chǎn)品中的應用。文檔編號C12N5/10GK101597601SQ20091013969公開日2009年12月9日申請日期2003年6月25日優(yōu)先權日2002年6月26日發(fā)明者C·安德森,E·L·羅根,N·T·尼爾松,N·W·貝格,S·恩斯特申請人:諾維信公司