專利名稱：一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法和裝置。
背景技術：
木霉是典型的絲狀真菌，屬于半知菌類絲孢綱，它的某些種和菌株己廣泛地用于纖維素 酶、抗生素和生物農(nóng)藥等的生產(chǎn)，其中液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)的分生孢子液，在纖維素酶、抗生 素的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化擴大生產(chǎn)以及生物農(nóng)藥生產(chǎn)中均有非常重要的應用。在生物農(nóng)藥的生產(chǎn) 中，直接用液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)的分生孢子液，如綠色木霉(Wc/^A/vwa wWJe)和哈茨木霉 (/Wc/zoAnMfl/ ara^"w附)制備液體或固體孢子制齊U，在纖維素酶和抗生素[綠色木霉素(viridin)、 木霉素(gliotoxin)和木霉菌脂素(trichoderma taxi)]的固態(tài)發(fā)酵中，特別是在纖維素酶的淺盤固 態(tài)發(fā)酵中，使用分生孢子液接種，可實現(xiàn)大批量接種的高速化和全自動化，為纖維素酶的純 培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)解決了長期未解決的關鍵性技術問題。
木霉的菌絲生長很快，成棉絮狀或致密狀，菌落表面多為綠色，菌絲透明，有隔膜，厚 垣孢子間生或頂生，無色，壁光滑，分生孢子梗是菌絲的短側枝，側枝又對生或互生分枝， 分枝乂繼續(xù)分枝，分枝成鋭角或近直角，分枝的末端即為小梗，分生孢子由小梗相繼生出， 分生孢子近球狀或橢圓形，壁光滑或粗糙，透明或殼黃色。在液體培養(yǎng)時，觀察到里氏木霉 的菌絲形成分生孢子的過程是屬于菌絲型的內(nèi)生孢子發(fā)育型。
將里氏木霉分別接種到土豆葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基和土豆葡萄糖三角瓶液體培養(yǎng)基上分 別培養(yǎng)，在土豆葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)5 7天，在土豆葡萄糖三角瓶液體搖床培養(yǎng)3 4天，就可以看到平板培養(yǎng)基上和三角瓶內(nèi)形成了綠色的分生孢子。如果將土豆葡萄糖三角 瓶液體搖床培養(yǎng)換成發(fā)酵罐液體深層培養(yǎng)，結果正如高培基等所說在液體深層培養(yǎng)時，絲 狀真菌通常都不發(fā)生分化和形成孢子(高培基等編著，微生物生長與發(fā)酵工程，1990， 142)， 在通常的發(fā)酵罐液體深層培養(yǎng)條件下，不具備如同三角瓶搖床培養(yǎng)一樣的產(chǎn)孢條件，若要創(chuàng) 造液體深層發(fā)酵培養(yǎng)條件下，絲狀真菌形成分生孢子的條件，則必需解決液體深層發(fā)酵培養(yǎng) 所帶來的關鍵性的技術難題，如同時解決菌絲附壁生長和大通氣量供氧、合適的培養(yǎng)基、生 產(chǎn)工藝及發(fā)酵設備改進等，絲狀真菌生長形式適于表面生長，發(fā)酵過程菌絲會不斷附著在發(fā) 酵罐內(nèi)壁、攪拌器葉片、換熱器等的表面上生長，通氣量愈大，附壁物愈多，發(fā)酵液中的菌 絲和養(yǎng)料愈來愈少，嚴重時將致使發(fā)酵不能正常進行，通氣量過低，附壁物可減少，但不易形成孢子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置。 本發(fā)明使用的菌種是里氏木霉(7Wc/zoAm"w"e/)6LZllA，已于2009年04月13日保藏
于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNo.3007。
本發(fā)明所述液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置設有發(fā)酵罐、空壓機、電磁閥和時間
控制器。
發(fā)酵罐設有清除附壁物功能的清壁系統(tǒng)、攪拌器、出料管、無菌空氣進氣管、無菌空氣 排氣管、無菌空氣分布器、夾套和液位計。
清壁系統(tǒng)設有循環(huán)泵、循環(huán)液管、法蘭軸承和清壁器；清壁器設有液體分布室和至少2 個液體噴射器，每個液體噴射器由噴液管和圓錐形的噴頭組成；法蘭軸承的內(nèi)套套在循環(huán)液 管出口的外部，液體分布室的上端口設有連接法蘭，清壁器固定在法蘭軸承上，循環(huán)泵用壓 縮空氣管依次與電磁闊和空壓機相連，電磁閥與時間控制器連接，出料管設于發(fā)酵罐的底部， 無菌空氣進氣管穿過發(fā)酵罐并與無菌空氣分布器連接，無菌空氣排氣管設于發(fā)酵罐的頂部， 無菌空氣分布器設于攪拌器的下部，夾套套在發(fā)酵罐外，液位計設在發(fā)酵罐上。
發(fā)酵罐內(nèi)壁的表面粗糙度最好為Ra0.42 0.01pm，發(fā)酵罐的徑高比最好為1 : (3 4)。 所述攪拌器最好為底部磁力驅動攪拌器。所述出料管的出料口最好朝上。所述循環(huán)泵可為不 銹鋼隔膜泵和不銹鋼磁力泵等，最好采用不銹鋼聚四氟乙烯隔膜泵，可進行在線滅菌。所述 液體噴射器最好沿水平方向均勻安裝在液體分布室靠近底部的外側。所述噴頭最好向下傾斜， 噴頭與水平方向成45。 60。角，噴頭與發(fā)酵罐的內(nèi)壁成45。 60。的入射角，噴頭與發(fā)酵罐的 內(nèi)壁相距1.5 10cm。所述液位計最好為視窗式玻璃液位計。
所述清壁器最好通過螺絲固定在法蘭軸承上，所述液體分布室最好為圓桶形液體分布室。
當工作時，打開電磁閥，由壓縮空氣起動循環(huán)泵，將發(fā)酵罐內(nèi)的液體吸出，經(jīng)循環(huán)液管 進入液體分布室，而后經(jīng)噴液管、噴頭高速噴出，以45。 60。的入射角噴射到發(fā)酵罐的內(nèi)壁 上，將附在發(fā)酵罐內(nèi)壁上的附壁物沖洗到發(fā)酵液內(nèi)，高速噴出液的反沖力作用在噴液管的力 臂上，推動噴頭沿水平方向作圓周運動，依次將罐壁上的附壁物全部沖洗下，沖洗的程度及 需要連續(xù)沖洗的時間，通過視窗式玻璃液位計即時觀察確定。
上述清壁器高速噴出液的反沖力作用在噴液管的力臂上，推動噴頭沿水平方向作圓周運 動。當噴頭設置較多時，清壁器也可以是直接固定在循環(huán)液管出口上，采用固定式清壁器， 可省去法蘭軸承，在此種情況下，可以達到同樣的清壁效果。所述清壁器的噴頭既可以是圓錐形噴頭，也可以是扇形噴頭等。通過清壁器沖洗罐壁上 的附壁物的介質，既可以是循環(huán)泵推動的發(fā)酵液，也可以是無菌壓縮空氣直接引入清壁器， 推動噴頭沿水平方向作圓周運動，通過高速噴出的氣流沖洗罐壁上的附壁物。
攪拌器為底部磁力驅動攪拌器，攪拌器的槳葉下部為環(huán)狀的無菌空氣分布器，無菌空氣 分布器的氣孔朝下，為了避免滅菌的死角，出料管的出料口朝上，出料時向罐內(nèi)充無菌空氣
將料液壓出。發(fā)酵罐的徑高比為i : (3 4)，以適當增加氣泡在發(fā)酵液中的路程和接觸時間。
本發(fā)明所述一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，采用所述液體深層發(fā)酵制備木
霉分生孢子的裝置，包括以下步驟
1) 制備種子的步驟；
2) 發(fā)酵罐生產(chǎn)木霉分生孢子的步驟采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為發(fā)酵罐容量的 70%，滅菌冷卻后，用種子罐培養(yǎng)的種子接種，在發(fā)酵罐中發(fā)酵5 7天，得木霉分生孢子。
在步驟1)中，所述制備種子可采用試管斜面接種培養(yǎng)、三角瓶種子培養(yǎng)或種子罐種子 培養(yǎng)的方法制備種子。
所述試管斜面接種培養(yǎng)可采用PDA培養(yǎng)基，滅菌接種后，28。C培養(yǎng)7 8天，斜面上可 長滿綠色的木霉分生孢子；
所述三角瓶種子培養(yǎng)可采用發(fā)酵培養(yǎng)基，將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基攪勻，分裝入250ml的三 角瓶中，每瓶裝100ml，滅菌后，用無菌水洗下試管斜面孢子接種，培養(yǎng)溫度為28 30。C， 搖床轉速120rpm，每隔8 12h，用人工方法將附在三角瓶瓶壁上的菌絲搖下，培養(yǎng)48 72h 后，即生長成豐滿綠色的木霉分生孢子；
所述種子罐種子培養(yǎng)，可采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為種子罐容量的70%，滅菌 冷卻后，用三角瓶種子培養(yǎng)的種子接種，接種量為10% 15%，培養(yǎng)條件為28 30。C，攪拌 速度為90 120rpm，通氣量(V/V) (V/V表示每分鐘的通氣量對發(fā)酵液的體積比)0 12h 時，為1 : (0.6 0.8)， 12h后，為1 : 1，培養(yǎng)時間為32 37h，菌絲體生長達到對數(shù)生長期， 即得發(fā)酵罐用的種子。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，按質量百分比的組成為脫皮后的馬鈴薯8% 16%，葡萄糖0.7% 2%， 余為水；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為
(1) 馬鈴薯用清洗脫皮機清洗脫皮后，用打漿機打漿，過濾去渣，濾液一邊攪拌一邊蒸 氣加熱，至淀粉呈分散于水中的溶膠態(tài)懸浮物；
(2) 按比例加入葡萄糖，以消泡劑消泡，加水沖稀到100%，調(diào)培養(yǎng)基的pH為6 10，
得種子培養(yǎng)基。在步驟(1)中，所述過濾最好為60 120目過濾，所述加熱的溫度最好為80 9(TC。 在步驟2)中，所述種子接種的接種量為10% 20%;所述在發(fā)酵罐中發(fā)酵的發(fā)酵過程 控制為發(fā)酵液的pH6 10，溫度28 30。C，攪拌速度80 120ipm，通氣量(V/V)， 0 6h 時，為l: (0.6 0.8)， 36h以后，為l: (1 1.6);罐壓控制，0 6h時，為80 100kPa， 36h以后，為120 180kPa，每4 6h進行一次清除附壁物處理，用無菌水補充通氣帶走的水 液，添加消泡劑消泡。
本發(fā)明針對解決液體深層發(fā)酵生產(chǎn)木霉分生孢子的的關鍵性技術難題，如菌絲附壁生長 和培養(yǎng)基附壁物的清除、生產(chǎn)用培養(yǎng)基配方、生產(chǎn)工藝和發(fā)酵裝置等，提供一種采用液體深 層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法和裝置。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的液體深層發(fā)酵制備 木霉分生孢子的裝置和方法，具有如下的突出優(yōu)點
1) 由于發(fā)酵罐設有清壁系統(tǒng)，能清除附壁物，因此解決了絲狀真菌液體深層發(fā)酵尚未根 本解決的技術難題，對絲狀真菌液體深層發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義；
2) 由于設有清壁系統(tǒng)，保證了可以使用高通氣量和高罐壓，為孢子的形成創(chuàng)造了關鍵性 的氧環(huán)境條件，因此不會發(fā)生絲狀真菌附壁生長和發(fā)酵物料掛壁的嚴重情況；
3) 由于磁力驅動攪拌器安裝在發(fā)酵罐底部，既可防止空氣污染，又為清壁器提供了合適 的安裝部位，而且清壁器選用的循環(huán)泵為耐高溫的不銹鋼隔膜泵，可進行在線滅菌，密封性 極好，無空氣泄漏污染，揚程高，因此可形成對罐壁掛壁物的高速沖洗效果，可進行工藝過 程的自動控制；
4) 由于出料管口朝上，出料時向罐內(nèi)充入無菌壓縮空氣將料液壓出，因此可以避免一般 安裝在罐底放料時存在的滅菌死角；
5) 由于在培養(yǎng)基配制時，革去了人工方法馬鈴薯去皮，切成小塊煮汁過濾的實驗室工藝， 而使用馬鈴薯清洗脫皮機對馬鈴薯進行清洗脫皮，用打漿機打漿過濾去渣，按比例加入葡萄 糖后，直接用蒸氣加熱濾液制成發(fā)酵培養(yǎng)基的機械化工藝，使經(jīng)典的僅適用于生物實驗室的 培養(yǎng)基配制方法， 一步成為適用于工業(yè)化生產(chǎn)的機械化工藝，因此工藝簡單可行，產(chǎn)孢率高， 產(chǎn)孢時間短，成本低；
6) 由于采用帶清壁器系統(tǒng)的發(fā)酵罐、改進的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基及其機械化制備工藝與 高罐壓大通氣量的發(fā)酵控制條件(這是本發(fā)明提供的液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法 和裝置的三大特點)，保證了液體深層發(fā)酵木霉菌絲形成分生孢子的條件，因此發(fā)酵周期短， 僅5 6天，平均產(chǎn)孢量既高又穩(wěn)定，可達1.31x108個/ml。
本發(fā)明提供的一種采用液體深層發(fā)酵制備木霉分 孢子的方法和裝置，不但可用于木霉 分生孢子的生產(chǎn)，而且可用于一般絲狀真菌的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)，如液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶和厚垣孢子等的生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明實施例的發(fā)酵罐結構示意圖。 圖2為本發(fā)明實施例的清壁器結構示意圖。 圖3為本發(fā)明實施例的平板式玻璃液位觀察窗結構示意圖。
在圖1 3中，各標記為循環(huán)泵1,循環(huán)液管2，第1連接法蘭3，第2連接法蘭4， 法蘭軸承5，清壁器與法蘭軸承的法蘭相固定螺絲6，液體分布室7，噴液管8，噴頭9，底 部磁力驅動攪拌器IO，出料管ll，無菌空氣進氣管12，無菌空氣排氣管13，無菌空氣分布 器14，夾套15，空壓機16，發(fā)酵罐17，電磁閥18，時間控制器19，視窗式玻璃液位計20。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
如圖1 3所示，液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置設有發(fā)酵罐17、空壓機16、時 間控制器19和電磁閥18。
發(fā)酵罐17設有清除附壁物功能的清壁系統(tǒng)、底部磁力驅動攪拌器IO、出料管ll、無菌 空氣進氣管12、無菌空氣排氣管13、無菌空氣分布器14、夾套15和視窗式玻璃液位計20， 清壁系統(tǒng)設有循環(huán)泵l、循環(huán)液管2、第1連接法蘭3、第2連接法蘭4、法蘭軸承5和清壁 器；清壁器設有液體分布室7和至少2個液體噴射器，每個液體噴射器由噴液管8和圓錐形 的噴頭9組成，液體分布室7的上端口焊有第2連接法蘭4，法蘭軸承5的內(nèi)套套在循環(huán)液 管2出口的外部。清壁器通過清壁器與法蘭軸承的法蘭相固定螺絲6固定在法蘭軸承5上。 循環(huán)泵1用壓縮空氣管依次與電磁閥18和空壓機16相連，電磁閥18與時間控制器19連接， 出料管11設于發(fā)酵罐17的底部，無菌空氣進氣管12穿過發(fā)酵罐17并與無菌空氣分布器14 連接，無菌空氣排氣管13設于發(fā)酵罐17的頂部，無菌空氣分布器14設于攪拌器10的下部， 夾套15套在發(fā)酵罐17外，液位計20設在發(fā)酵罐17上。
發(fā)酵罐內(nèi)壁的表面粗糙度為Ra0.42 0.01tim，發(fā)酵罐的徑高比為1 : (3 4)，以適當增 加氣泡在發(fā)酵液中的路程和接觸時間。
出料管11的出料口朝上，循環(huán)泵1為不銹鋼隔膜泵和不銹鋼磁力泵等，采用不銹鋼聚四 氟乙烯隔膜泵，可進行在線滅菌。液體噴射器沿水平方向均勻安裝在液體分布室7靠近底部 的外側。清壁器由圓桶形的液體分布室7和沿水平方向均勻安裝在液體分布室7靠近底部的 外側的至少2個液體噴射器組成，安裝時使噴頭9向下傾斜，與水平方向成45。 60。角，與 發(fā)酵罐的內(nèi)壁成45。 60。的入射角，且噴頭與發(fā)酵罐17的內(nèi)壁相距1.5 10cm。當工作時，打開電磁閥18，由壓縮空氣起動循環(huán)泵l，將發(fā)酵罐17內(nèi)的液體吸出，經(jīng)循 環(huán)液管2進入液體分布室7，而后經(jīng)噴液管8、噴頭9高速噴出，以45。 60。的入射角噴射到 發(fā)酵罐17的內(nèi)壁上，將附在發(fā)酵罐17內(nèi)壁上的附壁物沖洗到發(fā)酵液內(nèi)，高速噴出液的反沖 力作用在噴液管8的力臂上，推動噴頭9沿水平方向作圓周運動，依次將發(fā)酵罐17內(nèi)壁上的 附壁物全部沖洗下來，沖洗的程度及需要連續(xù)沖洗的時間，通過視窗式玻璃液位計20即時觀 察確定。
發(fā)酵罐內(nèi)具有清除附壁物功能的清壁器，既可以是如以上所述，高速噴出液的反沖力， 作用在噴液管8的力臂上，推動噴頭9沿水平方向作圓周運動式的，在噴頭9設置較多時，清 壁器也可以是直接固定在循環(huán)液管2出口上的固定式，采用固定式時可省去法蘭軸承5，在 此種情況下，可以達到同樣的清壁效果。清壁器的噴頭9既可以是圓錐形的，也可以是扇型 等。通過清壁器沖洗罐壁上的附壁物的介質，既可以是循環(huán)泵1推動的發(fā)酵液，也可以是無 菌壓縮空氣直接引入清壁器，推動噴頭沿水平方向作圓周運動，通過高速噴出的氣流沖洗罐 壁上的附壁物。
攪拌器10為底部磁力驅動攪拌器，攪拌器10的槳葉下部為環(huán)狀的無菌空氣分布器14， 無菌空氣分布器14的氣孔朝下，為了避免滅菌的死角，出料管ll的出料口朝上，出料時向 罐內(nèi)充無菌空氣將料液壓出。
以下給出本發(fā)明所述采用液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置制備木霉分生孢子的具 體方法。
本實施例使用的菌種是里氏木霉(7Wc/wc/ema reew/)6LZl 1A。
1)制備種子的步驟可采用試管斜面接種培養(yǎng)、三角瓶種子培養(yǎng)或種子罐種子培養(yǎng)的方 法制備種子。
所述試管斜面接種培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，滅菌接種后，28'C培養(yǎng)7 8天，斜面上可長 滿綠色的木霉分生孢子。
所述三角瓶種子培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)基，將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基攪勻，分裝入250ml的三角 瓶中，每瓶裝100ml，滅菌后，用無菌水洗下試管斜面孢子接種，培養(yǎng)溫度為28 3(TC，搖 床轉速120rpm，每隔8 12h，用人工方法將附在三角瓶瓶壁上的菌絲搖下，培養(yǎng)48 72h 后，即生長成豐滿綠色的木霉分生孢子。
所述種子罐種子培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為種子罐容量的70%，滅菌冷卻
后，用三角瓶種子培養(yǎng)的種子接種，接種量為10% 15%，培養(yǎng)條件為28 30。C，攪拌速度
為90 120rpm，通氣量(V/V) 0 12h時，為1 : (0.6 0.8)， 12h后，為1 : 1，培養(yǎng)時間
為32 37h，菌絲體生長達到對數(shù)生長期，即得發(fā)酵罐用的種子。
9所述發(fā)酵培養(yǎng)基，按質量百分比的組成為脫皮后的馬鈴薯8% 16%，葡萄糖0.7% 2%， 余為水。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為
(1) 馬鈴薯用清洗脫皮機清洗脫皮后，用打漿機打槳，60 120目過濾去渣，濾液一邊 攪拌， 一邊蒸氣加熱80 9(TC，至淀粉呈分散于水中的溶膠態(tài)懸浮物。
(2) 按比例加入葡萄糖，以消泡劑消泡，加水沖稀到100%，調(diào)培養(yǎng)基的pH為6 10, 得種子培養(yǎng)基。
2)發(fā)酵罐生產(chǎn)木霉分生孢子的步驟采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為發(fā)酵罐容量的 70%，滅菌冷卻后，用種子罐培養(yǎng)的種子接種，在發(fā)酵罐中發(fā)酵5 7天，得木霉分生孢子。
所述種子接種的接種量為10% 20%;所述在發(fā)酵罐中發(fā)酵的發(fā)酵過程控制為發(fā)酵液 的pH6 10，溫度28 30。C，攪拌速度80 120rpm，通氣量(V/V)， 0 6h時，為1 : (0.6 0.8)， 36h以后，為l : Q 1.6);罐壓控制，0 6h時，為80 100kPa， 36h以后，為120 180kPa，每4 6h進行一次清除附壁物處理，用無菌水補充通氣帶走的水液，添加消泡劑消 泡。
本發(fā)明制備的木霉分生孢子液可用于淺盤固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)纖維素酶高速接種器接種，也 可用于制備復合微生物肥和生物農(nóng)藥。在纖維素酶的中試中，共成功生產(chǎn)了6批次，所產(chǎn)的 木霉分生孢子液都用于淺盤固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的接種。本發(fā)明所述帶有清壁器系統(tǒng)的發(fā) 酵罐，可用于一般絲狀真菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)，例如生物酶制劑，生物醫(yī)藥、生物有機酸、生 物農(nóng)藥等的生產(chǎn)。
10
權利要求
1.液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于設有發(fā)酵罐、空壓機、電磁閥和時間控制器；發(fā)酵罐設有清除附壁物功能的清壁系統(tǒng)、攪拌器、出料管、無菌空氣進氣管、無菌空氣排氣管、無菌空氣分布器、夾套和液位計；清壁系統(tǒng)設有循環(huán)泵、循環(huán)液管、法蘭軸承和清壁器；清壁器設有液體分布室和至少2個液體噴射器，每個液體噴射器由噴液管和圓錐形的噴頭組成；法蘭軸承的內(nèi)套套在循環(huán)液管出口的外部，液體分布室的上端口設有連接法蘭，清壁器固定在法蘭軸承上，循環(huán)泵用壓縮空氣管依次與電磁閥和空壓機相連，電磁閥與時間控制器連接，出料管設于發(fā)酵罐的底部，無菌空氣進氣管穿過發(fā)酵罐并與無菌空氣分布器連接，無菌空氣排氣管設于發(fā)酵罐的頂部，無菌空氣分布器設于攪拌器的下部，夾套套在發(fā)酵罐外，液位計設在發(fā)酵罐上。
2. 如權利要求1所述的液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于發(fā)酵罐內(nèi)壁的表面粗糙度為Ra0.42 0.01pm，發(fā)酵罐的徑高比為1 : 3 4。
3. 如權利要求1所述的液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于所述出料管的出料口朝上。
4. 如權利要求1所述的液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于所述液體噴射器沿水平方向均勻安裝在液體分布室靠近底部的外側；所述噴頭向下傾斜，噴頭與水平方向成45。 60。角，噴頭與發(fā)酵罐的內(nèi)壁成45。 60。的入射角，噴頭與發(fā)酵罐的內(nèi)壁相距1.5 10cm。
5. 如權利要求1所述的液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于所述清壁器通過螺絲固定在法蘭軸承上；所述液體分布室為圓桶形液體分布室。
6. —種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，采用如權利要求1 5所述液體深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的裝置，其特征在于包括以下步驟-1) 制備種子的步驟；2) 發(fā)酵罐生產(chǎn)木霉分生孢子的步驟采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為發(fā)酵罐容量的70%,滅菌冷卻后，用種子罐培養(yǎng)的種子接種，在發(fā)酵罐中發(fā)酵5 7天，得木霉分生孢子。
7. 如權利要求6所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于在步驟1)中，所述制備種子采用試管斜面接種培養(yǎng)、三角瓶種子培養(yǎng)或種子罐種子培養(yǎng)的方法制備種子。
8. 如權利要求7所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于所述試管斜面接種培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，滅菌接種后，28'C培養(yǎng)7 8天，斜面上長滿綠色的木霉分生孢子。
9. 如權利要求7所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的力—法，其特征在于所述三角瓶種子培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)基，將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基攪勻，分裝入250ml的三角瓶中，每瓶裝100ml，滅菌后，用無菌水洗下試管斜面孢子接種，培養(yǎng)溫度為28 30°C，搖床轉速120rpm，每隔8 12h，用人工方法將附在三角瓶瓶壁上的菌絲搖下，培養(yǎng)48 72h后，即生長成豐滿綠色的木霉分生孢子。
10. 如權利要求7所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于所述種子罐種子培養(yǎng)，采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝料為種子罐容量的70%，滅菌冷卻后，用三角瓶種子培養(yǎng)的種子接種，接種量為10% 15%，培養(yǎng)條件為28 30'C，攪拌速度為90 120rpm，通氣量(V/V) 0 12h時，為1 : (0.6 0.8)， 12h后，為1 : 1，培養(yǎng)時間為32 37h，菌絲體生長達到對數(shù)生長期，即得發(fā)酵罐用的種子。
11. 如權利要求6或10所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，按質量百分比的組成為脫皮后的馬鈴薯8% 16%，葡萄糖0.7% 2%，余為水。
12. 如權利要求6或10所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法包括以下步驟1) 馬鈴薯用清洗脫皮機清洗脫皮后，用打漿機打漿，60 120目過濾去渣，濾液一邊攪拌一邊蒸氣加熱，至淀粉呈分散于水中的溶膠態(tài)懸浮物，所述加熱的溫度為80 9(TC;2) 按比例加入葡萄糖，以消泡劑消泡，加水沖稀到100%，調(diào)培養(yǎng)基的pH為6 10，得種子培養(yǎng)基。
13. 如權利要求6所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于在步驟2)中，所述種子接種的接種量為10°/。~20%。
14. 如權利要求6所述的一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法，其特征在于在步驟2)中，所述在發(fā)酵罐中發(fā)酵的發(fā)酵過程控制為發(fā)酵液的pH6 10，溫度28 3(TC，攪拌速度80 120rpm，通氣量(V/V)， 0 6h時，為1 : 0.6 0.8， 36h以后，為1 : 1 1.6;罐壓控制，0 6h時，為80 100kPa， 36h以后，為120 180kPa，每4 6h進行一次清除附壁物處理，用無菌水補充通氣帶走的水液，添加消泡劑消泡。
全文摘要
一種液態(tài)深層發(fā)酵制備木霉分生孢子的方法和裝置。裝置設有發(fā)酵罐、空壓機、電磁閥和時間控制器，發(fā)酵罐設有清壁系統(tǒng)、攪拌器、出料管、無菌空氣進氣管、無菌空氣排氣管、無菌空氣分布器、夾套和液位計。先制備種子，再采用發(fā)酵罐生產(chǎn)木霉分生孢子，采用發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，用種子罐培養(yǎng)的種子接種，在發(fā)酵罐中發(fā)酵得木霉分生孢子。解決了絲狀真菌液體深層發(fā)酵尚未根本解決的技術難題，不會發(fā)生絲狀真菌附壁生長和發(fā)酵物料掛壁的嚴重情況；可形成對罐壁掛壁物的高速沖洗效果，可進行工藝過程的自動控制；可以避免一般安裝在罐底放料時存在的滅菌死角；工藝簡單可行，產(chǎn)孢率高，產(chǎn)孢時間短，成本低；發(fā)酵周期短，平均產(chǎn)孢量既高又穩(wěn)定。
文檔編號C12M1/00GK101671625SQ20091011260
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權日2009年9月28日
發(fā)明者吳永慧, 周維金, 彭立娥, 李星洪, 王多祥 申請人:廈門北大泰普科技有限公司