專利名稱：一種制備裂褶菌多糖的方法及專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備裂褶菌多糖的方法及專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
裂褶菌CSb/^op力^ 7咖co鵬"/2e Fr.)，又名白參菌、樹花菌，是一種具有很 高食用和藥用價(jià)值的白色腐生擔(dān)子綱真菌。裂褶菌在自然界中分布相當(dāng)廣泛，它能 有效降解纖維基質(zhì)中的木質(zhì)素、半纖維素以及部分纖維素，可以在相對(duì)惡劣的條件 下良好生長，是一種易于培養(yǎng)的藥用真菌。裂褶菌多糖是存在于裂褶菌子實(shí)體、菌 絲體或發(fā)酵液中的一種水溶性胞外多糖，具有藥用真菌多糖典型的e -(1 ， 3)-D-葡 聚糖主鏈、0-(1， 6)-D-葡萄糖分支結(jié)構(gòu)。有關(guān)裂褶菌多糖的抗腫瘤、抗菌消炎、 抗輻射、提高機(jī)體免疫力等多種生理活性已得到國內(nèi)外研究者的證實(shí)。此外，裂褶 菌多糖的高粘度、高持水性也使得其可能作為增稠劑、穩(wěn)定劑而廣泛用于食品、日 用品及石油化工等領(lǐng)域，發(fā)展?jié)摿薮蟆?br> 裂褶菌多糖的生產(chǎn)工藝目前以液體發(fā)酵法為主，通過分批或連續(xù)液體發(fā)酵生產(chǎn) 工藝，國內(nèi)外已有個(gè)別公司實(shí)現(xiàn)了裂褶菌多糖的商業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品主要用于高附加 值的制藥及化妝品行業(yè)。液體發(fā)酵技術(shù)是實(shí)現(xiàn)微生物及其產(chǎn)物工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn) 的良好途徑。但是，由于裂褶菌是一種大型絲狀真菌，而該多糖又具有超高粘度特 性，液體發(fā)酵法生產(chǎn)過程中存在著傳質(zhì)難、能耗大等問題。這也是導(dǎo)致目前其工業(yè) 化生產(chǎn)規(guī)模不大、產(chǎn)品生產(chǎn)成本高的重要原因。固體(態(tài))發(fā)酵技術(shù)是一項(xiàng)古老的 生物技術(shù)，過去主要應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造業(yè)(酒、醬油、醋等)。固體發(fā)酵技術(shù)具有設(shè) 備簡單、原材料成本與能耗低、污染少等優(yōu)點(diǎn)，亦是現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展方向 之一。國內(nèi)已有個(gè)別研究者和生產(chǎn)廠家利用固體發(fā)酵來生產(chǎn)靈芝多糖、茶樹菇多糖、 灰樹花多糖等真菌多糖，但是目前未見以固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖的報(bào)道，其中原 因可能與適宜菌種和培養(yǎng)條件的研究開發(fā)不足有關(guān)。
作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，我國有著豐富的農(nóng)作物秸稈、玉米芯、麩皮、米糠、蔗渣 等農(nóng)副產(chǎn)品資源。而目前這些資源并沒有得到充分利用，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。如何對(duì)上 述農(nóng)副產(chǎn)品資源開展深加工高附加值轉(zhuǎn)化，是近年來農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，其組成為每千克培養(yǎng)基中含有玉米芯、玉米秸稈和 /或玉米皮400-450g，小麥麩皮、米糠和/或蔗渣50-100g，促生長因子VB1 0. 05-0. lg， L-谷氨酸0. 05-0. lg，其余為水。
上述培養(yǎng)基中，每千克培養(yǎng)基中含有玉米芯、玉米秸稈和/或玉米皮450g，小 麥麩皮、米糠和/或蔗渣50g，促生長因子l 0. lg， L-谷氨酸O. lg，其余為水。
上述任一所述培養(yǎng)基中，所述玉米芯、玉米秸稈或玉米皮可以是被粉碎且過 20-40目篩后得到的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖的方法。
本發(fā)明所提供的制備裂褶菌多糖的方法，包括如下步驟用上述任一所述培養(yǎng) 基發(fā)酵裂褶菌(5b力izc^力/77咖co/ffizw/ e Fr.)，得到裂褶菌多糖。
其中，所述裂褶菌(5b力&o; A^7鵬co鵬me Fr.)具體可為如下保藏編號(hào)的裂 褶菌CFCC N0. 6812 、 CFCC N0. 83457或ACCC NO. 50875。
上述發(fā)酵過程中，溫度可為26-30°C。
上述發(fā)酵過程中，時(shí)間可為7-10天。
上述發(fā)酵過程中，液體菌種接種量可為50m1-100ml液體菌種1000g培養(yǎng)基。
上述制備方法中，在所述發(fā)酵后，還可包括提取的步驟；所述提取的方法可包 括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵物進(jìn)行破碎，然后加入水，在60-8(TC的溫度 下攪拌，離心，收集上清液。
上述提取過程中，所述破碎的方法可以是先將發(fā)酵物倒入攪拌機(jī)中，進(jìn)行破碎， 再向其中加入水用打漿機(jī)進(jìn)行破碎。
上述提取過程中，所述水與所述破碎后的發(fā)酵物的比例為(15-25) L水lkg 破碎后的發(fā)酵物。
上述提取過程中，所述攪拌的時(shí)間為40-60min。
上述提取過程中，所述離心的時(shí)間為15-25min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3000rpra。 上述制備方法中，在所述提取后，還可包括去蛋白的步驟；所述去蛋白的方法
可包括如下步驟調(diào)節(jié)所述提取得到的上清液pH值至4.5-5.0，靜置0.5-1.5h，
離心、收集上清液。
上述制備方法中，在所述去蛋白后，還可包括脫色的步驟；所述脫色的方法可 包括如下步驟將所述去蛋白得到的上清液依次用活性炭和大孔樹脂進(jìn)行吸附，收集洗脫液；所述活性炭與上清液的比例可為lkg活性炭(80-120) L上清液；所 述D301大孔樹脂柱與用活性炭吸附后獲得的洗脫液的比例可為1 kg大孔樹脂 (120-150) L洗脫液。
本發(fā)明的固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖的方法，是以富含纖維基質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品資源 (玉米秸稈、玉米芯、玉米皮、小麥麩皮、蔗渣等)作為原料進(jìn)行發(fā)酵的，大大降 低了原料成本，又實(shí)現(xiàn)了農(nóng)副產(chǎn)品資源的高效轉(zhuǎn)化，既環(huán)保又具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值； 該方法制備裂褶菌多糖的得率可達(dá)4.5-5.8% (質(zhì)量百分含量)，得到的多糖除具備 典型藥用真菌多糖的增強(qiáng)免疫、抗腫瘤活性外，還具有極高分子量(平均相對(duì)分子 質(zhì)量達(dá)到20000KDa)、高粘度(表觀特性粘度超過食用級(jí)黃原膠)等物化特性，可 開發(fā)為一種具有良好生理功能與應(yīng)用功能的天然食用膠新產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、 日化、食品等行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容


圖1為多糖濃度對(duì)溶液粘度的影響。
圖2為體系pH值對(duì)溶液粘度的影響。
圖3為溫度對(duì)溶液粘度的影響。
圖4為裂褶菌固體發(fā)酵及多糖提取工藝流程。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
本發(fā)明裂褶菌固體發(fā)酵及多糖提取工藝流程如圖4所示。
下述實(shí)施例中所使用的裂褶菌(5"c力hop力/77咖co鵬朋e Fr.)具體可為如下保 藏編號(hào)的裂褶菌:CFCC N0. 6812 、 CFCC N0, 83457或ACCC NO. 50875。裂褶菌 (5b^。/7力/W鵬co鵬〃72e Fr. )CFCC N0. 6812禾口裂褶菌(5b^。/ / /77柳co腳朋e Fr.) CFCC N0. 83457購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，裂褶菌(5b力kop力W7"/Hco卿w"e Fr. )ACCC NO. 50875購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。 實(shí)施例1、裂褶菌多糖及其制備方法 一、制備方法
(一) 菌種活化
將裂褶菌(5b力izo/ 力^^鵬co歷M/"e Fr. )CFCC NO. 6812接種到PDA斜面培養(yǎng)基， 進(jìn)行復(fù)壯活化培養(yǎng)。
PDA斜面培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯20g、葡萄糖2g、酵母膏 0.5g、硫酸鎂O. 15g、磷酸氫鉀0. 3g和瓊脂2g，其余為水。
(二) 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)
取已培養(yǎng)好的斜面菌種，接種到液體PDA培養(yǎng)基中，在25-29"C、搖床轉(zhuǎn)速 150-180轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)48-52小時(shí)，得到菌絲球分布均勻、發(fā)酵液清澈透明的液體菌 種，此為一級(jí)液體菌種。
取一級(jí)液體菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，在25-29°C、搖床轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/ 分下培養(yǎng)48-52小時(shí)，獲得二級(jí)液體菌種。此過程中培養(yǎng)容器可采用液體發(fā)酵罐 (50-100L)或大三角瓶(5L)。
液體PDA培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯20g、葡萄糖2g、酵母膏 0.5g、硫酸鎂0. 15g和磷酸氫鉀0. 3g，其余為水。
(三) 菌種的固體發(fā)酵
在無菌操作環(huán)境中，將前發(fā)酵好的二級(jí)液體菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種比 例為二級(jí)液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基二70mL: 1000g;置于28X:下培養(yǎng)8天，待菌絲布滿 菌袋(或菌瓶)時(shí)，固體發(fā)酵結(jié)束，此發(fā)酵后的混合物被稱作發(fā)酵原料。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每千克培養(yǎng)基中含有玉米芯450g、小麥麩皮50g、促生 長因子IO. lg、 L-谷氨酸O. lg,其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下首先將干燥玉米芯粉碎，過20-40目篩，再與小 麥麩皮按比例混合均勻；促生長因子Vw稱重后溶于水中；將促生長因子-Vb,溶液和 玉米芯、小麥麩皮混合，加水，再向其中加入L-谷氨酸，加水補(bǔ)足至l公斤，攪拌
均勻，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基。將發(fā)酵培養(yǎng)基分裝入菌袋或菌瓶中，置于12rc下濕
熱處理2.5-4.0小時(shí)，殺菌；取出，冷卻至室溫待用。
(四) 裂褶菌多糖的提取及純化1、 粗提將發(fā)酵原料倒入攪拌機(jī)中，先破碎；再加少量水，加入的水占發(fā)酵 原料和水總體積的10-15%，過打漿機(jī)細(xì)磨、勻漿；然后向打漿后的原料中補(bǔ)加水至 打槳后的原料與水的比例達(dá)到lkg: 20L，在7(TC下攪拌提取50min;離心(3000rpm， 20min)，收集上清液，此上清液即為裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等電點(diǎn)沉淀法去除粗提取液中的雜蛋白，調(diào)節(jié)粗提取液pH值 至4.8，靜置lh，離心、收集上清液。
3、 脫色將步驟2得到的上清液依次通過活性炭柱(活性炭與上清液的比例 為lkg: 90L) 、 D301大孔樹脂柱(樹脂與活性炭吸附后洗脫液的比例為lkg: 150 L)做脫色處理。綜合脫色率達(dá)到93. 5%，多糖保留率84.2%。最后將溶液pH值調(diào) 至7.0，獲得裂褶菌多糖精制液。
脫色率溶液脫色前后吸光度的差值除以脫色前吸光度再乘以100%即得(吸光 度在426nm波長下測定)。
多糖保留率脫色前后溶液中多糖總量之比(多糖含量測定采用苯酚-硫酸法)。
(五) 液體產(chǎn)品和固體產(chǎn)品的制備
1、 液體產(chǎn)品的制備
調(diào)整濃度將裂褶菌多糖精制液中的多糖調(diào)整至1.0%的濃度。 滅菌采用5-25kg塑料桶分裝，然后進(jìn)行60Co-Y射線輻照殺菌處理(輻照 劑量3-5kGy);產(chǎn)品置于陰涼、避光處保存，貯藏期1年。
本發(fā)明所得液體裂褶菌多糖產(chǎn)品為一種無色、透明至乳白色粘稠液體.
2、 固體產(chǎn)品制備
濃度調(diào)整將裂褶菌多糖精制液進(jìn)行真空濃縮至固形物含量達(dá)到2. 5%;
采用醇析法獲得沉淀多糖，向濃縮物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇濃 度達(dá)到60-65%，得到多糖絮狀沉淀；室溫下靜置8-12小時(shí)，壓濾，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗滌沉淀2-3次，脫除多余液體獲得半干物料；將該半干物料置于真 空條件下低溫烘干，粉碎、包裝，密閉保存，貯藏期2年。此即裂褶菌多糖固體產(chǎn) 品，該產(chǎn)品為一種白色至灰白色粉末。
(六) 得率的計(jì)算
得率(％)=固體產(chǎn)品中葡聚糖的質(zhì)量/發(fā)酵原料的質(zhì)量乂100%
7上述發(fā)酵和固體產(chǎn)品制備的實(shí)驗(yàn)(即步驟(一)至(六))均重復(fù)3次，平均
得率為5. 8%。
二、裂褶菌多糖的鑒定 1、產(chǎn)物鑒定
1) 基本組成分析
將實(shí)驗(yàn)一得到的裂褶菌多糖固體產(chǎn)品進(jìn)行組成分析。用苯酚-硫酸法測其中多 糖含量，用凱氏定氮法測其中蛋白質(zhì)含量。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果總糖含量86. 8%;蛋白質(zhì)含量8. 0%;干燥失重10. 0%。 表明，本發(fā)明產(chǎn)品中的主成分為糖。
2) 單糖組成分析高效液相色譜(HPLC)法
取10rog本發(fā)明所得固體產(chǎn)品，在20ml、 1M貼04溶液中IO(TC水解3小時(shí)；冷 卻，加入BaC03中和至pH7.0;過濾、收集濾液；微濾(4> 0. 45 u m)，濾液備用。
HPLC條件Sugar pakl、 6. 8X300mm色譜柱(Waters公司)；流動(dòng)相為超純 水；流速O. 5ml/min;柱溫85'C;池溫3(TC;進(jìn)樣量10nl;檢測器為示差折光檢 測器。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為G5400;木糖標(biāo)準(zhǔn)品購Sigma公 司，產(chǎn)品目錄號(hào)為95729;阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為10860。
在如上色譜條件下，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為13.023min;木糖標(biāo)準(zhǔn)品的保 留時(shí)間為15.008min;阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為16. 285min。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。經(jīng)測定本發(fā)明所得產(chǎn)品中總糖的水解產(chǎn)物為葡萄糖85. 92%、 木糖8.52%、阿拉伯糖5.56%。表明，本發(fā)明所得產(chǎn)品中的糖水解后主要為葡萄糖， 其中含有少量以木糖和阿拉伯糖構(gòu)成的多糖物質(zhì)，但不影響其實(shí)際應(yīng)用。
3) 產(chǎn)物分子量分布測定高效凝膠過濾色譜法(HPSEC)法 將本發(fā)明所得產(chǎn)品配制成多糖濃度為5mg/ml的溶液，溶劑為0. 1M NaN03溶液；
微濾(4>0.45um)，濾液備用。
HPLC條件Ultrahydrogel LinearX2， 7. 8X300mm凝膠色譜柱(Waters公司， WAT011545);流動(dòng)相為0. 1MNaN03溶液；流速0. 9ml/min;柱溫45。C;池溫37。C; 進(jìn)樣量20ul;檢測器為示差折光檢測器。該色譜柱經(jīng)系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(Dextran， Fluka公司)標(biāo)定，保留時(shí)間(T)與平均相對(duì)分子質(zhì)量(MW)之間的關(guān)系為 LogMW二l. 37e-5. 33e—1 T。經(jīng)測定本發(fā)明所得產(chǎn)品出現(xiàn)兩個(gè)分子量相對(duì)較大的多糖峰，其中平均相對(duì)夯子
質(zhì)量(Mw)為23，140，680Da的多糖組分占總多糖含量的92. 72%;另有一平均相對(duì) 分子質(zhì)量為44，578Da的多糖組分占總多糖含量的7.28y。。表明，本發(fā)明產(chǎn)品中的葡 萄糖是以高分子形式存在的。
綜上，鑒定結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品的主成分為葡聚糖(即裂褶菌多糖)。 2、產(chǎn)品粘度特性分析
由烏氏粘度計(jì)(4)0.57 mm)測定裂褶菌多糖溶液的相對(duì)粘度、比粘度及表觀 特性粘度。在pH2. 0-10. 0的溶劑體系中，配制1. 5-3. 5mg/ml的多糖系列溶液，在 25-75'C下測定溶劑及溶液的流動(dòng)時(shí)間(t。、 t)。溶劑為去離子水，用裂褶菌多糖 固體樣品進(jìn)行配制。
粘度計(jì)算公式
相對(duì)粘度(nrel) 二t。/t;
比粘度(nsp) = nrel —1;
表觀特性粘度([n]app) =[2Usp — lnnrel)]°'5X1000/C，單位ml/g;其 中C為溶液濃度(mg/ml)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖l-3所示。結(jié)果表明，裂褶菌多糖粘度隨濃度的增 加而呈指數(shù)上升趨勢；多糖粘度隨體系pH值的增加略有下降，整體變化趨勢不明 顯；隨溫度的上升粘度呈線性下降。
另研究了同一濃度條件下本發(fā)明所得多糖的表觀特性粘度([n]app)與常用 食用膠-黃原膠的差別。結(jié)果顯示，在2.5mg/ml濃度下，本發(fā)明產(chǎn)品與黃原膠的 [n]app值分別為1500±32 ml/g、 2250± 120ml/g，約是后者的1. 5倍，表明本產(chǎn) 品具有更好的增稠性。
三、裂褶菌多糖的生理功能實(shí)驗(yàn)
1、免疫調(diào)節(jié)功能實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)程序參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003年)的方法對(duì)昆 明種小鼠進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)功能測定。檢測指標(biāo)包括①免疫器官臟/體重比值；②綿羊 紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠DTH (足跖增厚法)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH);③血凝法測 定血清溶血素抗體積數(shù)(血凝法)；④小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體 內(nèi)法)測定吞噬率及吞噬指數(shù)。具體方法和計(jì)算公式可見上述規(guī)范。
用裂褶菌多糖精制液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將裂褶菌多糖精制液加入基礎(chǔ)日糧中，制備成不同劑量多糖的試驗(yàn)日糧50、 100、 150 mg裂褶菌多糖/kg試驗(yàn)日糧。
小鼠分為4組，每組10只，作為對(duì)照組、低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組 (100mg/kg)、高劑量組(150mg/kg)，分別飼喂基礎(chǔ)日糧和不同多糖劑量的試 驗(yàn)日糧。實(shí)驗(yàn)設(shè)2次重復(fù)。
表l裂褶菌多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟/體重的影響
組別_劑量(mg/kg)_胸腺/體重_脾臟/體重
對(duì)照組 / 0.36 ±0.07 0.42 ±0.09
低劑量組 50 0.41±0.04 0.42±0.07
中劑量組 100 0.45±0.05* 0.49±0.04*
高劑量組 200 0.48 ±0.05* 0.52 ±0.05**
注與對(duì)照組相比的差異顯著性，*p<0.05， **p<0.01。
表2裂褶菌多糖對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)
組別劑量(mg/kg)DTH
對(duì)照組/0. 60±0. 10
低劑量組500. 76±0. 11
中劑量組1000. 94±0. 15*
高劑量組2000. 96±0.14*
注與對(duì)照組相比的差異顯著性，*p<0.05， **p<0.01。 表3裂褶菌多糖對(duì)小鼠血清溶血素抗體;識(shí)數(shù)的影響
組別劑量Ug/kg)抗體積數(shù)
對(duì)照組/28. 89 ±4. 62
低劑量組5029. 88±4. 25
中劑量組10030. 33±3.27
高劑量組20032. 66±3. 33
各劑量組有增高趨勢，但差異不顯著。
表4裂褶菌多糖對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響_
組別_劑量(mg/kg)_吞噬率(％)_吞噬指數(shù)
對(duì)照組 / 45.73±7.39 0.61 ±0.17
低劑量組 50 49.26 ±6.38 0.76±0.29
中劑量組 100 64.60±8.51* 0.95±0.21*高劑量組__75. 89±6. 92**_1.13±0. 36**
注與對(duì)照組相比的差異顯著性，*p<0.05， **p<0.01。
由上述結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，裂褶菌多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠的
胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)與單核巨噬細(xì)胞吞噬功能(p< 0.05， p<0.01)，由此判斷本發(fā)明所得裂褶菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能。
2、體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
考察了裂褶菌多糖溶液對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562及人 肝癌細(xì)胞H印G2的體外抑制率。上述三類人肺癌A549細(xì)胞、人慢性髓原白血病細(xì) 胞K562及人肝癌細(xì)胞H印G2均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。將裂褶菌多糖精 制液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其濃度控制在ltng/ml、 0.5 mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. 125mg/ml、 0. 0625mg/ml、 0. 03125mg/ml;然后向其中接種腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)一段 時(shí)間后，在570 nm測定吸光值，計(jì)算裂褶菌多糖的抑瘤率。
裂褶菌多糖的體外抑瘤率(％) =(1—藥物組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)X 100%。
實(shí)驗(yàn)設(shè)2次重復(fù)。結(jié)果顯示當(dāng)培養(yǎng)基中裂褶菌多糖的濃度達(dá)到lmg/ml時(shí)， 對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為33. 5% (p<0.01)，對(duì)K562細(xì)胞的抑制率為73. 7% (p< 0.01)，對(duì)H印G2細(xì)胞的抑制率為59.4。/。 (p<0.01)，由此推斷，裂褶菌多糖的體 外抑瘤率表現(xiàn)為極顯著水平。
實(shí)施例2、裂褶菌多糖及其制備方法 一、制備方法
(一) 菌種活化
采用裂褶菌(5b/L^o/ 力777M2 co鵬w eFr.) CFCC NO. 83457菌株，方法同實(shí)施 例1中所述一致。
(二) 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 方法同實(shí)施例1中所述一致。
(三) 菌種的固體發(fā)酵
在無菌操作環(huán)境中，將前發(fā)酵好的二級(jí)液體菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種比 例為二級(jí)液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基:50mL: 1000g;置于26'C下培養(yǎng)10天，待菌絲布 滿菌袋(或菌瓶)時(shí)，固體發(fā)酵結(jié)束，此發(fā)酵后的混合物即作為發(fā)酵原料。
11發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有玉米皮400g、米糠100g、促生長因 子-VB,0.08g、 L-谷氨酸0.05g，其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1中所述一致。
(四) 裂褶菌多糖的提取及純化
1、 粗提將發(fā)酵原料倒入攪拌機(jī)中，先破碎；再加少量水，加入的水占發(fā)酵 原料和水總體積的13%，過打漿機(jī)細(xì)磨、勻漿；然后向打漿后的原料中補(bǔ)加水至打 漿后的原料與水的比例達(dá)到lkg: 15L，在6(TC下攪拌提取40min;離心(3000rpm， 15min)，收集上清液，此上清液即為裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等電點(diǎn)沉淀法去除多糖粗提液中的雜蛋白，調(diào)節(jié)多糖粗提液 pH值至4.5，靜置0.5h，離心、收集上清液。
3、 脫色將步驟2得到的上清液依次通過活性炭柱(活性炭與上清液的比例 為lkg: 80L) 、 D301大孔樹脂柱(樹脂與活性炭吸附后洗脫液的比例為lkg: 120 L)做脫色處理。綜合脫色率達(dá)到92. 5%，多糖保留率85.4%。最后將溶液pH值調(diào) 至6.5，獲得裂褶菌多糖精制液。
(五) 液體產(chǎn)品和固體產(chǎn)品的制備
1、 液體產(chǎn)品的制備
調(diào)整濃度將裂褶菌多糖精制液中的多糖調(diào)整至1. 0%的濃度。 滅菌采用5-25kg塑料桶分裝，然后進(jìn)行60Co-Y射線輻照殺菌處理(輻照 劑量3-5kGy);產(chǎn)品置于陰涼、避光處保存，貯藏期1年。
本發(fā)明所得液體裂褶菌多糖產(chǎn)品為一種無色、透明至乳白色粘稠液體。
2、 固體產(chǎn)品制備
濃度調(diào)整將裂褶菌多糖精制液進(jìn)行真空濃縮至固形物含量達(dá)到2. 5%;
采用醇析法獲得沉淀多糖，向濃縮物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇濃 度達(dá)到60-65%，得到多糖絮狀沉淀；室溫下靜置8-12小時(shí)，壓濾，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗滌沉淀2-3次，脫除多余液體獲得半干物料，將該半干物料置于真 空條件下低溫烘干，粉碎、包裝，密閉保存，貯藏期2年。此即裂褶菌多糖固體產(chǎn) 品，該產(chǎn)品為一種白色至灰白色粉末。
(六) 得率的計(jì)算 方法同實(shí)施例1中所述一致。 實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，平均得率為4.5%。二、 裂褶菌多糖的鑒定
1、 產(chǎn)物鑒定
方法同實(shí)施例l中所述一致。
結(jié)果表明，本發(fā)明得到的裂褶菌多糖固體產(chǎn)品中多糖含量86.5%，蛋白質(zhì)含量 8. 3%，干燥失重8. 0%。裂褶菌多糖水解后單糖組成為葡萄糖84. 28%、木糖8. 40%、 阿拉伯糖4.96%。多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)分布為23， 240， 180Da的多糖組 分占總多糖含量的91. 23%，另有一平均相對(duì)分子質(zhì)量為45， 508Da的多糖組分占總 多糖含量的8. 77%。鑒定結(jié)果表明本發(fā)明的裂褶菌多糖固體產(chǎn)品的主成分為葡聚糖 (即裂褶菌多糖)。
2、 粘度特性分析
方法同實(shí)施例1中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，裂褶菌多糖粘度隨濃度的增加而呈指數(shù)上升趨勢; 多糖粘度隨pH值的增加略有下降，整體變化趨勢不明顯；隨溫度的上升粘度呈線 性下降；同一濃度條件下本發(fā)明所得多糖的粘度值較黃原膠的大，為黃原膠的1. 8 倍；[il ]app平均達(dá)到2460ml/g。
三、 裂褶菌多糖的生理功能實(shí)驗(yàn) 1、體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
方法同實(shí)施例l中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示當(dāng)培養(yǎng)基中裂褶菌多糖的濃度為lmg/ml時(shí)，對(duì) A549細(xì)胞的抑制率為35.4%"<0.01)，對(duì)1(562細(xì)胞的抑制率為72. l%(p<0.01)， 對(duì)H印G2細(xì)胞的抑制率為60. 5% (p<0. 01)，裂褶菌多糖的體外抑瘤率表現(xiàn)為極顯 著水平。
實(shí)施例3、裂褶菌多糖的制備方法
一、 菌種活化
采用裂褶菌(^5bWzo/7力/77w/i7 co鵬rae Fr. )ACCC NO. 50875，方法同實(shí)施例1中 所述一致。
二、 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)
13方法同實(shí)施例1中所述一致。
三、 菌種的固體發(fā)酵
在無菌操作環(huán)境中，將前發(fā)酵好的二級(jí)液體菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種比
例為二級(jí)液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基400mL: 1000g;;置于29。C下培養(yǎng)7天，待菌絲
布滿菌袋(或菌瓶)時(shí)，固體發(fā)酵結(jié)束，此發(fā)酵后的混合物被稱作發(fā)酵原料。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有玉米秸稈430g、蔗渣70g、促生長因 子-^0.05g、 L-谷氨酸0.07g，其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下同實(shí)施例1中所述一致。
四、 裂褶菌多糖的提取及純化
1、 粗提將發(fā)酵原料倒入攪拌機(jī)中，先破碎；再加少量水，加入的水占發(fā)酵 原料和水總體積的15%，過打漿機(jī)細(xì)磨、勻漿；然后向打漿后的原料中補(bǔ)加水至打 漿后的原料與水的比例達(dá)到lkg: 25L，在80。C下攪拌提取60min;離心(3000rpm， 25min)，收集上清液，此上清液即為裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等電點(diǎn)沉淀法去除多糖粗提液中的雜蛋白，調(diào)節(jié)多糖粗提液 pH值至5.0，靜置1.5h，離心、收集上清液。
3、 脫色將步驟2得到的上清液依次通過活性炭柱(活性炭與上清液的比例 為lkg: 120L) 、 D301大孔樹脂柱(樹脂與活性炭吸附后洗脫液的比例為lkg: 150 L)做脫色處理。綜合脫色率達(dá)到95. 0%，多糖保留率81.5%。最后將溶液pH值調(diào) 至7.0，獲得裂褶菌多糖精制液。
五、 液體產(chǎn)品和固體產(chǎn)品的制備
1、 液體產(chǎn)品的制備
調(diào)整濃度將裂褶菌多糖精制液中的多糖調(diào)整至1.0%的濃度。
滅菌采用5-25kg塑料桶分裝，然后進(jìn)行60Co-Y射線輻照殺菌處理(輻照
劑量3-5kGy);產(chǎn)品置于陰涼、避光處保存，貯藏期1年。本發(fā)明所得液體裂褶菌
多糖產(chǎn)品為一種無色、透明至乳白色粘稠液體。
2、 固體產(chǎn)品制備
濃度調(diào)整將裂褶菌多糖精制液進(jìn)行真空濃縮至固形物含量達(dá)到3. 0%;
采用醇析法獲得沉淀多糖，向濃縮物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇濃 度達(dá)到60-65%，得到多糖絮狀沉淀；室溫下靜置8-12小時(shí)，壓濾，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗滌沉淀2-3次，脫除多余液體獲得半干物料；將該多糖半干物料置于真空條件下低溫烘干，粉碎、包裝，密閉保存，貯藏期2年。固體產(chǎn)品為一種灰 白色至淺灰色粉末。
(六)得率的計(jì)算
同實(shí)施例1中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，平均得率為5.5%。 其中多糖含量85.0%，蛋白質(zhì)含量13.0%，干燥失重9.0%。
二、 裂褶菌多糖的鑒定
1、 產(chǎn)物鑒定
方法同實(shí)施例l中所述一致。
結(jié)果表明，本發(fā)明得到的裂褶菌多糖固體產(chǎn)品中多糖含量85.0%，蛋白質(zhì)含量 13. 0%，干燥失重9. 0%。裂褶菌多糖水解后單糖組成為葡萄糖84. 08%、木糖8. 95%、 阿拉伯糖4.74%。多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)分布為23，256，100Da的多糖組 分占總多糖含量的90. 13%，另有一平均相對(duì)分子質(zhì)量為45， 400Da的多糖組分占總 多糖含量的8.42%。鑒定結(jié)果表明本發(fā)明的裂褶菌多糖固體產(chǎn)品的主成分為葡聚糖 (即裂褶菌多糖)。
2、 粘度特性分析
方法同實(shí)施例l中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，裂褶菌多糖粘度隨濃度的增加而呈指數(shù)上升趨勢; 多糖粘度隨pH值的增加略有下降，整體變化趨勢不明顯；隨溫度的上升粘度呈線 性下降；同一濃度條件下本發(fā)明所得多糖的粘度值較黃原膠的大，為黃原膠的1.7 倍；[ri]app平均達(dá)到2415ml/g。
三、 裂褶菌多糖的生理功能實(shí)驗(yàn) 1、體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
方法同實(shí)施例l中所述一致。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果顯示當(dāng)培養(yǎng)基中裂褶菌多糖的濃度為lmg/ml時(shí)，對(duì) A549細(xì)胞的抑制率為34. 3%(p<0. 01)，對(duì)K562細(xì)胞的抑制率為70. 9%(p<0. 01)， 對(duì)H印G2細(xì)胞的抑制率為60. 1% (p<0. 01)，裂褶菌多糖的體外抑瘤率表現(xiàn)為極顯 著水平。
權(quán)利要求
1、一種培養(yǎng)基，其組成為每千克培養(yǎng)基中含有玉米芯、玉米秸稈和/或玉米皮400-450g，小麥麩皮、米糠和/或蔗渣50-100g，促生長因子VB1 0.05-0.1g，L-谷氨酸0.05-0.1g，其余為水。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于每千克培養(yǎng)基中含有玉米芯、 玉米秸稈和/或玉米皮450g，小麥麩皮、米糠和/或蔗渣50g，促生長因子VB1 0. lg， L-谷氨酸O. lg，其余為水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述玉米芯、玉米秸稈 或玉米皮是被粉碎且過20-40目篩后得到的。
4、 一種制備裂褶菌多糖的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-3中任一所述 培養(yǎng)基發(fā)酵裂褶菌(5b力^o/ 力/77咖co鵬朋e Fr.)，得到裂褶菌多糖。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述裂褶菌(5b/L^邵力i^/w^ co順朋e Fr.)為如下保藏編號(hào)的裂褶菌CFCC N0. 6812 、 CFCC N0. 83457或ACCC NO. 50875。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為26-30。C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的時(shí)間為7-10天。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 發(fā)酵后，包括提取的步驟；所述提取的方法包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵 物進(jìn)行破碎，然后加入水，在60-8(TC的溫度下攪拌，離心，收集上清液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 提取后，包括去蛋白的步驟；所述去蛋白的方法包括如下步驟調(diào)節(jié)所述提取得到 的上清液的pH值至4.5-5.0，靜置0.5-1.5h，離心、收集上清液。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 去蛋白后，包括脫色的步驟；所述脫色的方法包括如下步驟將所述去蛋白得到的 上清液依次用活性炭和大孔樹脂進(jìn)行吸附，收集洗脫液；所述活性炭與上清液的比 例為lkg活性炭(80-120) L上清液；所述D301大孔樹脂柱與用活性炭吸附后獲 得的洗脫液的比例為1 kgD301大孔樹脂(120-150) L洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備裂褶菌多糖的方法及專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的組成為每公斤培養(yǎng)基中含有玉米芯、玉米秸稈或玉米皮400-450g、小麥麩皮、米糠或蔗渣50-100g、促生長因子V_B1 0.05-0.1g、L-谷氨酸0.05-0.1g，其余為水。本發(fā)明的固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖的方法，是以富含纖維基質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品資源(玉米秸稈、玉米芯、玉米皮、小麥麩皮、蔗渣等)作為原料進(jìn)行發(fā)酵的，大大降低了原料成本，又實(shí)現(xiàn)了農(nóng)副產(chǎn)品資源的高效轉(zhuǎn)化，既環(huán)保又取得了經(jīng)濟(jì)價(jià)值；該方法制備裂褶菌多糖的得率高，發(fā)酵原料中的多糖含量可達(dá)4.5-5.8％(質(zhì)量百分含量)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101643759SQ20091009040
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者劉紅芝, 周素梅, 強(qiáng) 王, 昕 鐘, 聰 陳, 高利忠 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所