專利名稱：狂犬病街毒株hn10全基因組序列及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狂犬病街毒序列，具體的說是狂犬病街毒株HNIO全基因組序列，
及其 inj備力法和用途。
背景技術(shù)：
狂犬病是死亡率為100%的疾病，對(duì)人們的健康構(gòu)成了很大的威脅，了解狂犬病毒分子流行病學(xué)有助于控制狂犬病毒流行，對(duì)狂犬病街毒株進(jìn)行核苷酸的測(cè)序并進(jìn)行分析成為分子流行病學(xué)的有力工具。目前，狂犬病街毒株的基因組全長(zhǎng)序
列的測(cè)定是一個(gè)很難的技術(shù)，主要是狂犬病毒基因組全長(zhǎng)約12kb，堿基突變的比例較大，在既要保證序列準(zhǔn)確性，又要在以盡量很少步驟的情況下得到全長(zhǎng)基因組序列，兩者之間一直很難平衡。
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，目前急需一種有效、準(zhǔn)確可靠的全基因組測(cè)序方法，并通過該方法得到狂犬病街毒全基因組序列。
發(fā)明內(nèi)容
為了改進(jìn)和彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種可靠準(zhǔn)確的測(cè)序方法，并提出該方法測(cè)序得到的狂犬病街毒株HN10全基因組序列。
本發(fā)明的另一目的在于提出一種所述狂犬病街毒株HN10全基因組序列的用途。
本發(fā)明的發(fā)明思路為本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究，利用分子生物學(xué)的方法，對(duì)病毒的基因組全長(zhǎng)進(jìn)行了分段，并針對(duì)該分段設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增引物，通過對(duì)多個(gè)狂犬病毒全基因組序列的比對(duì)，選擇狂犬病毒保守區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物3'末端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置且最后一個(gè)堿基終止在氨基酸密碼子的第二堿基，共設(shè)計(jì)24對(duì)引物用來擴(kuò)增狂犬病毒HN10的全基因組，引物擴(kuò)增片段一般不超過1. lkb;引物設(shè)計(jì)完成后針對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行測(cè)序，最終得到了準(zhǔn)確的狂犬病街毒株的全長(zhǎng)序列。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下具體技術(shù)方案狂犬病街毒株HN10全基因組序列，該序列如序列表SEQIDNo.l所示，狂犬病街毒株HNIO的基因組全長(zhǎng)包括11923個(gè)核苷酸。
上述狂犬病街毒株HN10全基因組序列擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物如序列表SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24個(gè)引物對(duì)。
一種制備上述狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法，其具體步驟如下
(1) 病毒的分離；
(2) 病毒RNA的提?。?br>
(3) 病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄；
(4) 引物合成如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，針對(duì)所示引物將病毒基因組序列分段，分為24個(gè)段；
(5) 利用SEQ IDNo.2至SEQ ID No.49所示引物分別對(duì)分段基因序列進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增；
(6) 目的基因片段的回收；
(7) 目的基因序列測(cè)序。
所述步驟(1)病毒RNA的提取具體步驟為取經(jīng)BHK-21細(xì)胞傳至第四代的病毒HNIO，反復(fù)凍融3次；離心，取病毒懸液，先加入0.2ml總RNA提取試劑(TRIzolLS Reagent)勻漿后，再加入0.8ml總RNA提取試劑(TRIzolLSReagent),混勻；-20°(:放置30min，加氯仿，混勻，室溫放置5min，離心；取離心后上層水相，加入與上層水相等體積的異丙醇，混合，室溫放置10min;離心，棄上清，留沉淀，加入75%冰預(yù)冷的乙醇，振蕩洗滌，離心，棄上清，室溫干燥沉淀后將沉淀溶于無核酸酶的超純水中。上述步驟中離心均在4t:下。
所述步驟(2)病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄具體步驟為將隨機(jī)引物稀釋至0.2 u g/ u 1，取33iU總RNA液，65。C水浴10min，取出后立即冰浴，離心，將32 u 1液體轉(zhuǎn)移至cDNA第一鏈合成試劑(Ready-To-GoYou-Prime First-Strand Beads)反應(yīng)管中，再向反應(yīng)管中加入llU隨機(jī)引物，使總體積達(dá)到33ul，室溫lmin，混勻，離心，37"C水浴60min，即得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
所述步驟(3)病毒基因組序列分段為將步驟(2)病毒逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA分為24個(gè)片段，每片段不超過l.lkb。
所述步驟(4) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為H20 34.5ul， 10xPfx擴(kuò)增緩沖液5ul，10mM dNTPmix 1.5ul， 50mMMgSO4 lul，正向引物Flul，反向引物Rlul，cDNA5ul， PfxDNA聚合酶lul;
PCR循環(huán)條件參數(shù)先用94°C 2min進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，然后用94°C 15sec; 50°C30sec; 68°C 40sec進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再進(jìn)行一個(gè)68°C 10min的延伸。
本發(fā)明的用途狂犬病街毒株HN10的全基因組序列確定后，可根據(jù)該基因組的序列進(jìn)行狂犬病毒反向遺傳技術(shù)的研究，例如，首先根據(jù)全基因組序列設(shè)計(jì)能將全長(zhǎng)基因分割成幾段的酶切位點(diǎn)，然后根據(jù)這些酶切位點(diǎn)將全基因組制備成載體(制備載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知內(nèi)容)，該載體對(duì)于某些特殊用途的蛋白有相當(dāng)大的作用，如，利用狂犬病毒載體的嗜神經(jīng)特性，將治療老年癡呆癥的某些蛋白連上該狂犬病毒載體，狂犬病毒載體將這些蛋白運(yùn)載到神經(jīng)組織的特殊位置，發(fā)揮作用，從而可有效治療老年癡呆癥?？蛇\(yùn)用模型小鼠(即患老年癡呆癥的小鼠)進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益
本發(fā)明將病毒基因組序列分為24個(gè)片段，用PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA，再利用擴(kuò)增該片段的引物進(jìn)行直接測(cè)序，在擴(kuò)增中所用引物是根據(jù)狂犬病毒保守區(qū)域的核苷酸序列所設(shè)計(jì)的，引物3'末端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置，且最后一個(gè)堿基終止在氨基酸密碼子的第二位堿基。本發(fā)明可以有效地?cái)U(kuò)增出目的片度，提供了全基因序列，有利于了解病毒的分類、進(jìn)化、致病性及分子流行病學(xué)等，本病毒可以作為反向遺傳系統(tǒng)的載體使用，而該病毒序列的測(cè)定為病毒載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)，因此，本發(fā)明具備潛在的應(yīng)用前景。
上述內(nèi)容己經(jīng)充分的說明了本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，下面結(jié)合附圖
和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，具體實(shí)施方式
的實(shí)施例均為最佳的技術(shù)方案，而并非對(duì)本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l狂犬病街毒株HN10全基因組序列的制備
(1)病毒的分離
取狂犬病人死后腦組織海馬回部位樣品(樣品來源于湖南省一患狂犬病死亡
的人腦組織，經(jīng)患者家屬同意)約0.3g，加含青霉素(500U/mL)與鏈霉素(2mg/mL)及2%胎牛血清的PBS (pH7.4)研磨成30%懸液，4°C 2000rpm離心20min，后取上清接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)己形成單層的BHK-21細(xì)胞上，2h后補(bǔ)加含2%胎牛血
5清的DMEM液，37°C 5 %C02培養(yǎng)。
(2) 病毒RNA的提取
取經(jīng)BHK-21細(xì)胞傳至第四代的病毒HNIO，反復(fù)凍融3次。4°C 12000r/min 離心10min，取病毒懸液放于1.5ml EP管中，先加入0.2ml TRIzol LS Reagent (Invitrogen公司)勻漿后，再加入0.8mlTRIzo1 LS Reagent?；靹颍?20。C冰箱 中放置30min，加200iU氯仿，快速顛倒充分混勻，室溫放置5min， 4。C離心， 12000rpm離心15min，取離心后上層水相加入新1.5ml EP管中，每管加入與上 清等體積的異丙醇，輕柔混合，室溫放置10min， 4°C12000rpm離心10min，棄 上清，留沉淀，加入lml 75%新配制的冰預(yù)冷的乙醇，振蕩洗滌，4°C12000rpm 離心10min，棄上清，室溫干燥沉淀，后將沉淀溶于70iU無核酸酶的超純水中。
(3) 病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄
將隨機(jī)引物Pd(N)6 (大連寶生物公司)稀釋至0.2wg/ul，將水浴箱預(yù)熱至 65°C，吸取33 "1總RNA液加入EP管中，放入65°C中水浴10min，取出后立即 冰浴2min，瞬時(shí)離心，將32 u 1液體轉(zhuǎn)移至Ready-To陽Go You-Prime First-Strand Beads (AMERSHAM公司)反應(yīng)管中，再向反應(yīng)管中加入1 u 1隨機(jī)引物Pd(N)6 (0.2 " g/ u 1)，使總體積達(dá)到33 w 1，室溫lmin，混勻，瞬時(shí)離心，37。C水浴60min， 即得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
(4) 病毒基因序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成 通過對(duì)多個(gè)狂犬病毒全基因組序列的比對(duì)，選擇狂犬病毒保守區(qū)域的核苷酸
序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物3'末端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置且 最后一個(gè)堿基終止在氨基酸密碼子的第二堿基，共設(shè)計(jì)24對(duì)引物用來擴(kuò)增狂犬 病病毒HN10的全基因組，引物擴(kuò)增片段一般不超過l.lkb。具體引物序列及其 對(duì)應(yīng)位點(diǎn)如表1所示，SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3為正反引物對(duì)，SEQ IDNo.4 和SEQIDNo.5為正反引物對(duì)，SEQIDNo.6禾卩SEQIDNo.7為正反引物對(duì)，SEQ IDNo.8禾卩SEQIDNo.9為正反引物對(duì)，SEQIDNo.lO和SEQIDNo.ll為正反引 物對(duì)，SEQIDNo.12和SEQIDNo.13為正反引物對(duì)，SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15為正反引物對(duì)，SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17為正反引物對(duì)，SEQ ID No. 18 和SEQIDNo.l9為正反引物對(duì)，SEQIDNo.20和SEQIDNo.21為正反引物對(duì)， SEQ ID No.22和SEQ ID No.23為正反引物對(duì)，SEQ ID No.24和SEQ ID No.25為正反引物對(duì)，SEQ ID No.26和SEQ ID No.27為正反引物對(duì)，SEQ ID No.28和SEQ IDNo.29為正反引物對(duì)，SEQIDNo.30和SEQIDNo.31為正反引物對(duì)，SEQ ID No.32禾P SEQIDNo.33為正反引物對(duì)，SEQIDNo.34和SEQ ID No.35為正反引 物對(duì)，SEQIDNo.36和SEQIDNo.37為正反引物對(duì)，SEQ ID No.38和SEQ ID No.39為正反引物對(duì)，SEQ ID No.40和SEQ ID No.41為正反引物對(duì)，SEQ ID No.42 和SEQIDNo.43為正反引物對(duì)，SEQIDNo.44和SEQ ID No.45為正反引物對(duì)， SEQ ID No.46和SEQ ID No.47為正反引物對(duì)，SEQ ID No.48和SEQ ID No.49為 正反引物對(duì)。引物的位置以狂犬病毒PV株(GenBank登錄號(hào)M13215)的基因 組為參考。
表1
片 段 序 號(hào)引物名稱a序列(5'-3')位置b擴(kuò)增 長(zhǎng)度 (bp)
1RV1-F RV1-R(SEQ IDNo.2) (SEQIDNo.3)GTACCTAGACGCTTAACAA CGTGACCAACAGCATTTGAT1-992992
2RV2-F RV2-R(SEQ IDNo,4) (SEQ IDNo.5)TTAGTCGGTCTTCTCTTGAGTCTT GGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATG488-14951008
RV3-F RV3-R(SEQ IDNo.6) (SEQ IDNo.7)GTTGGTCACGTGTTCAATCTCATT GGTTTCCTTCTTAAGTTCTCTTCC983-19851003
4RV4-F RV4-R(SEQ IDNo.8) (SEQ IDNo.9)TAACACCCCTCCTTTTGAACCAT GTGGTGTTGCCTGTTTTTTTCAC1485-24871003
RV5-F RV5-R(SEQ ID No.10) (SEQ IDNo.ll)AAACCCCATCAGCTTCTTCT TTGCACTCACTCTTATCTGC1981-2972992
6RV6-F RV6-R(SEQ ID No. 12) (SEQ ID No. 13)AAACAGGCAACACCACTGAT ATCCTTCATCTTCCACAACC2472-34741003
7RV7-F RV7-R(SEQ ID No. 14) (SEQ IDNo.15)CGGAGTGAGTGCAAGACAATGTCAT TTGCTCCCTTTGGATGCTCTCTT2959-39851027
8RV8-F(SEQIDNo.16)CCTGGTTGTGGAAGATGAAGG3452-4448997
7RV8-R (SEQIDNo.n)AAACACCCCGTTCACATGG
9RV9-F (SEQIDNo.18) RV9-R (SEQIDNo.19)AACAGCAGAGGGAAGAGAGCAT GGATGAGATCTTCGGGACTT3951-4934984
10RV10-F (SEQIDNo.20) RV10-R(SEQ ID No.21)AGGCAGATGTCATCCCCAT TCGGATCTACCGGGTCATCAT4415-54511037
11RV1卜F (SEQIDNo.22) RV11-R(SEQ ID No.23)ATCTCATCCCCTTGAGTTGAAG TGGAGAGATACCTTCCAAATGC4926-5913988
12RV12-F (SEQ IDNo.24) RV12-R(SEQ ID No.25)AGGAGAGGTTTATGATGACC ATCGAGTTGACTCACCTTGT5420-64221003
13RV13-F (SEQ IDNo.26) RV13-R(SEQ ID No.27)GACTATGATAAGGCATTTGGAAGG CTAGTCTTGTTCTGGTGAAAGAGT5880-68791000
14RV14-F (SEQ IDNo.28) RV14-R(SEQ ID No.29)TAAAGGACAAGGTGAGTCAACT TCTGGAAAAACTCATGAGTCCT6397-7377981
15RV15-F (SEQIDNo,30) RV15-R(SEQ ID No,31)TAGATGACAAGTCGCACTCTT GAGGTTGACTATTTGGTCGTT684卜78771037
16RV16-F (SEQ IDNo.32) RV16-R(SEQ ID No.33)CTCATGAGTTTTTCCAGAAGTC TTGCATCCTTGAGCAAGATAGT7360-8355996
17RV17-F (SEQ IDNo.34) RV17-R(SEQ ID No.35)CAGAGTCTCTTGCATCTCGAAC GACACTGAGACTCTAGGATTCC7838-88481011
18RV18-F (SEQ IDNo.36) RV18-R(SEQ IDNo.37)TCTTGCTCAAGGATGCAATCAGG TAGAGTCCTTCAGCCTTGTGTCT8338-9336999
19RV19-F (SEQ IDNo.38) RV19-R(SEQ ID No.39)TAGAGTCTCAGTGTCTGTGCTC CAGAGACGGTTCTCTGAGCATT8834-98361003
20RV20-F (SEQ IDNo.40) RV20-R(SEQ lDNo.41)GACTCTACATTTCACTGGCACCTTC AGCAGAGCAAACCCACTCAGAACAT9330-10325996
21RV2卜F (SEQ IDNo.42) RV21-R(SEQ ID No.43)ACATAATGCTCAGAGAACCGT CTGCATCACAAATGATGAGGT9811-10803993
22RV22-F (SEQ IDNo.44) RV22-R(SEQ ID No.45)TGTCTCAGAGCTTGACATAAG CCGTCAATGGTTTAGAGACAT10364-113701007
8RV23-F (SEQ ID No.46 ) CATCATTTGTGATGCAGAAGT
23 10787-11662 876 RV23-R (SEQ ID No,47 ) GTCTTCACTATCTTGTAGATC
RV24-F (SEQ ID No.48 ) AGGGACTCTATCTAAAATGTC
24 11285-11932 639 RV24-R (SEQ ID No.49) TTCTGAGTACACGCTTAACAA
"F"代表正向引物，"R"代表反向引物。引物的位置以狂犬病毒PV株
(GenBank登錄號(hào)M13215)的基因組為參考
(5) 目的基因的PCR擴(kuò)增，將全基因分為24個(gè)片段分別擴(kuò)增并直接測(cè)序，引 物和對(duì)應(yīng)擴(kuò)增位點(diǎn)如表1所示。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為在0.2ml EP管中加入以下試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)ddH20 34.5ul， 10 X Pfx Amplification Buffer 5ul， 10mM dNTP mix 1.5ul， 50mM MgS04 lul，正向引物Flul，反向引物Rlul， cDNA5ul， PfxDNAPolymerase (Invitrogen 公司)lul。
PCR用以下程序循環(huán)先用94°C 2min進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，然后用94°C 15sec; 50°C 30sec; 68°C 40sec進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再進(jìn)行一個(gè)68°C lOmin的延伸。
(6) 目的基因片段的回收
回收基因片段的試劑盒購自QIAgen公司。具體回收方法如下 使用TAE緩沖液制作1 %瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳。在長(zhǎng)波紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的 液體。切碎膠塊。將膠塊放入一無色離心管中，稱其重量(100mg 100tU)。 加3倍膠塊體積的Buffer QG, 5(TC水浴lOmin (或直到膠塊完全溶解)?？梢悦?隔2-3min震蕩離心管以助溶解。膠塊完全溶解后，混合物應(yīng)該為黃色(如同沒 溶解膠之前Buffer QG的顏色)，將QIAquick spin column放置于2ml收集管上， 小心將溶液轉(zhuǎn)移到QIAquick column中，使DNA結(jié)合到膜上，13000rpm離心lmin， 棄濾液，將QIAquick column再放回同一收集管中，力卩0.75ml Buffer PE，洗結(jié)合 到膜上的DNA。棄濾液，13000rpm再離心lmin，將QIAquick放入干凈的1.5ml 離心管中，力B 30 ul的洗脫液到QIAquick膜的中心部位，并靜置lmin，然后 13000rpm離心lmin。
(7) 序列測(cè)序?qū)⑺厥盏哪康幕蚱嗡椭帘本┎┻~德科技發(fā)展有限公司，
用上述表l中的引物進(jìn)行分段測(cè)序，最后對(duì)所測(cè)定的序列利用BioEdit生物軟件
9進(jìn)行序列拼接，利用該軟件對(duì)各段序列重疊部分的比對(duì)作用，將24個(gè)片段首尾
相接，最終得到狂犬病街毒株HN10全基因組序列，如SEQIDNo.l所示。
為了保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確，將每個(gè)片段進(jìn)行了三次獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，并將 擴(kuò)增結(jié)果分別送至測(cè)序，然后再將這三次的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，并結(jié)合測(cè)序峰圖 進(jìn)行堿基的校對(duì)，這樣盡可能避免了由于堿基的偶然變異而使序列發(fā)生變化。
狂犬病街毒株HN10的全基因組序列確定后，可根據(jù)該基因組的序列進(jìn)行狂 犬病毒反向遺傳技術(shù)的研宄。序列表
<110>
<120>
中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 狂犬病街毒株HN10全基因組序列及其制備方法和用途
<130> <160〉 49
<170〉 Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 11923 <212> DNA
<213>狂犬病街毒株HN10全基因組序列，人工序列 <400〉 1
acgcttaaca accagatcag agaagaagca gacagtgtca tttgcaaaac aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctccct 120
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gtgtatcaac atgaattcta gagcatgtca gttatggtct gacatgtctc ttcagacaca 3060
aaggtcggag gaggacaagg actcttccct gctcctagag tagtcaaatt atgtcccaca 3120
gacttatcac ttgtttacct ctggaggaga gagcatacgg gcttaactcc aacctttggg 3180
agcaatagaa caaaaatatg ttatggtgcc attaaaccgc tgcatttcat caaaatcaga 3240
ttaattacct ttacattttg agcctcttgg atgtgaaaaa aacttttaac atccctcaaa 3300
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tgtgttttgg gaaattcccc atttacacga taccagacaa acttggtccc tggagtccca 3420
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acgggttcac ttgtacgggt gtggtgacgg aagcagaaac ctacactaac tttgttggct 3600
atgtcaccac cacgtttaag agaaagcact ttcgaccaac tccggatgca tgcagatccg 3660
catacaattg gaagatggct ggtgacccca ggtacgaaga gtctctgcac aatccctatc 3720
ctgattatca ttggctccgg actgtaaaaa ccaccaaaga gtcctttgtt atcatatctc 3780
caagtgtggc agatctagat ccgtacgata aatcccttca ttcgagagtt tttcctagag 3840
gaaaatgctc aggaataacg gtgtcttcta cctactgctc tactaaccat gactacacca 3900
tctggatgcc tgaaaatccc agactgggga cctcttgtga tattttcacc aacagcagag 3960
ggaagagagc atccaaaggg agcaagacct gtggatttgt agatgagaga ggcttgtaca 4020
aatctctaaa aggagcatgc aaactgaagc tgtgtggggt tcttggactt agacttatgg 4080
atggaacatg ggtcgcgatt cagacatcag acgagaccaa gtggtgccct cctgaccagc 4140
tagtgaatct acatgacttt cattcagatg agattgaaca tcttgttgtg gaggagttgg 4200
tcaagaaaag ggaagagtgt ctagatgcac tggagtccat catgaccacc aagtccgtga 4260
gtttccgacg tctcagtcac ttgaggaaac ttgtgcccgg gttcggaaaa gcatacacca 4320
爐caataa gaccttgatg gaggctgatg ctcactacaa atcggtccgg acttggaacg 4380
agatcatccc ctctaaaggg tgtttgagag ttggaggcag atgtcatccc catgtgaacg 4440
13gggtgttttt taatggtatt atcctaggcc ctgacggcca tgtcttgatc ccggaaatgc 4500
agtcatctct ccttcagcaa catatggagt tgttggaatc ctcggtcatc cccttaatgc 4560
atcctttggc agatccatca acggtgttta aagatggtga cgaggcggag gattttgttg 4620
aggttcacct tccagatgtg cataagcagg tctcaggggt cgatctcggt ctcccaagct 4680
gggggaagta tgtgttgatg agcgcaggca ttttgactgc actgatgttg acga認(rèn)ct 4740
taatgacgtg ttgccgaagg actaatagag cagaatcgat acaacacagt cttggagaga 4800
cagggaggaa agtgtcggta acctcccaaa gcgggagggt catatcttca tgggagtcat 4860
acaaaagcgg aggtgagacc aagctgtaag ggcaggtcag ctcctttata tctcaagtcc 4920
cgaagatctc atccccttga gttgaagggg acatctctgg attcgacggt cctccttgga 4980
ctcctcgcaa cagggtagat tcaagattct tgagacctcc attaatcatc tcaatctatc 5040
agacattgtc atgtggattc ttataacaca agaaatcttc tagcagttcc agtgactaac 5100
ggtgctttta ccctccaaga actgacacca aaggtgatgg acagacctag agatatctca 5160
gacaacgttg tgtttaaaca cagacagaga ttgtggtgag cccccagata ctagactggg 5220
taagagtctg ttaagaaaga atacttgcct cctatgaagg acataagcaa tagatcacca 5280
tcatcttgca tctcagcgaa gtgtgcacaa ttataaaggg ctgggtcatt catgattttc 5340
agtcgagaaa aaaactatag aacagaagga caactagcaa cacttctcat cttgagactg 5400
tcaccatgat gattgatcca ggagaggttt atgatgaccc ggtagatccg attgagtcag 5460
aggctgaacc cagagggact cccactgtcc ccaacatctt gaggaactcc gactataatc 5520
tcaactctcc tctaatagag gatccggcca aattaatgtt agaatggttg aagacaggaa 5580
atagacctta ccgaatgacc ttgacagaca attgctctag gtcttacaaa gtcctgaagg 5640
attacttcaa gaaggtagat ctgggttccc taaaagtggg tggagccgca gcccagtcaa 5700
tgatctccct ctggttatac ggtgctcact ccgaatcaaa caggagccga aaatgtatga 5760
ctgacttagc ccatttctat tccaagtctt cccccataga gaagctgttg aattgcacac 5820
ttggaaatag agggttaaga atccctccag agggggtgtt aaattgtctt gaaagagttg 5880
actatgataa ggcatttgga aggtatctct ccaacacgta ttcctcttat ctgtttttcc 5940
acgtaattac cctatacatg aatgccctcg actgggagga agagaagacc atcttagctt 6000
tatggaaaga cttgacgtca gttgatgttg ggaaagattt agtcaagttc agagatcaaa 6060
tatggggact cctaattgtg acgaaagact ttgtgtactc tcagagctct aattgtcttt 6120
ttgacaggaa ctatacactt atgctgaaag accttttttt gtctcgtttc aactctctaa 6180
14tgattttgct ttctccccct gagccccggt attcagacga tctgatatcc caactttgcc 6240
aactatacat cgccggagat caagtattgt ctatgtgtgg aaattcgggt tatgaagtca 6300
ttaagatact ggaaccctat gtcgtgaaca gcttagtcca gagggcagaa aagtttaggc 6360
ccctcatcca ctctttaggg gactttcctg tttttataaa ggacaaggtg agtcaactcg 6420
aggggacatt tggtcctagt gcaaaaaggt tttttcgggt attggatcag ttcgacaaca 6480
tacatgatct agtattcgtg tatggctgtt ataggcattg ggggcatcct tatatagatt 6540
atagaaaggg tctgtcaaag ttatatgatc aggttcacat caagaaggtg atagacaagt 6600
cctaccagga gtgtttggcg agcgacctgg cccggaggat ccttaggtgg ggatttgaca 6660
agtactctaa atggtatatt gattcgcgac tcctccccag agaccacccc ttgactcctt 6720
atatcaaaac tcagacatgg ccacccaaac atgtcgtgga tctggtggga gatgcatggc 6780
ataagctccc aatcacacag atatttgaga tccctgagtc aatggatcct tcagaaatac 6840
tagatgacaa gtcgcactct ttcaccagaa caagactagc ttcttggcta tcagagaaca 6900
gaggggggcc tgttcctagt gagaaggtca ttatcacagc tctgtccaag ccgcctgtca 6960
accccaggga gttcttaaaa tctatcgacc tcggagggtt acccgatgaa gacttgataa 7020
ttggcctcaa gccgaaagaa agggagctga agattgaagg tcgattcttt gccttgatgt 7080
cttggaattt gagactgtac ttcgttatca ctgaaaagct cctagctaat tatatcttgc 7140
cactctttga tgcgctgact atgacagaca acctgaacaa ggtgtUaaa aagttgatcg 7200
atcgagtaac cgggcaaggg cttttggact actcaagggt tacatatgct ttccacctgg 7260
actatgagaa gtggaacaat catcaaaggt tagagtcaac agaagatgta ttttctgtcc 7320
tagatcaggt gtttggatta aaaagggtat tctcgaggac tcatgagttt ttccagaagt 7380
cttggatcta ttattcggac agatcagacc tcatcgggct atgggaggac caaatatact 7440
gcttggatat gtctaacggc ccgacctgct ggaatggcca agatggcggg ctggaaggct 7500
tacgacagaa aggctggagt ctggtcagcc tgttaatgat agacagagag tctcagacta 7560
ggaacacaag aaccaagata ctggcgcaag gagacaacca agttctatgt ccaacatata 7620
tgttatcgcc tgggctgtcg agggaggggc ttctttatga actggagagt atatcaagaa 7680
atgccctttc aatataccga gctatcgagg agggagcagc aaagctaggg ctgattatca 7740
agaaggaaga gaccatgtgt agctatgact ttctcatcta cgggaaaact ccattatttc 7800
gaggcaacat cttggtgcct gagtcaaaaa gatgggccag agtctcttgc atctcgaacg 7860accaaatagt caacctcgcc aatataatgt cgacagtgtc caccaacgct ttaactgtgg 7920
cacaacactc tcaatctttg atcaagccga tgagggactt tctgcttatg tcagtgcagg 7980
cagtctttca ctacttgctg ttcagcccca tcttaaaggg tagagtctac aaaattctaa 8040
gtgctgaggg ggacaacttt ctcctagcga tgtcaagaat aatctattta gacccttcct 8100
taggaggagt gtctggaatg tctttgggga gatttcatat acgccagttc tcagaccctg 8160
tctcagaggg gttgtccttc tggagagaga tctggctgag ctctcacgag tcctggattc 8220
acgcgttgtg tcaagaggca gggaaccctg atctcggaga gagaacactc gagagcttca 8280
ctcggcttct cgaggaccct actactttaa atatcaaggg aggggcaagc cccactatct 8340
tgctcaagga tgcaatcagg aaagccctgt atgacgaagt agataaggtg gagaactctg 8400
agttcagaga ggcaatcctc ttgtccaaaa cccataggga taattttata cttttcttga 8460
aatctgttga gcctctattt ccccgatttc tcagtgagct tttcagctcc tccttcttgg 8520
ggattcctga gtcaatcatc ggattgatac aaaactctcg gacaataagg agacagttta 8580
gaaaaagcct ctcaagaact ttggaggagt ctttttacaa ctcagagatc catgggatca 8640
accgaatgac tcagacacct cagcgagttg ggagggtgtg gacctgctcc tcggagaggg 8700
cagatctttt gagggaaatc tcttggggga ggaaagtagt gggtacaaca gttccccacc 8760
cttctgagat gttgggactg cttcctaagt cctccatctc ttgtacttgc ggggcaaccg 8820
gaggagggaa tcctagagtc tcagtgtctg tgctcccgtc ctttgatcag tcattttttt 8880
cacgaggccc tctaaaagga tacttgggat catccacctc catgtcgacc cagctgttcc 8940
atgcctggga gaaggtcacc aatgttcatg tggtgaaaag ggccctctca ctaaaagaat 9000
ccataaactg gttcatcaca agaaactcga atttggctca gactctgatt agaaacatca 9060
tgtctctaac tggccctgat tttcctctag aagaggcccc tgtgttcaag aggacagggt 9120
cagcattgca taggttcaag tccgctagat acagtgaggg gggatattct tctgtatgcc 9180
ccaatctcct ctctcatatc tccgtaagta cagacaccat gtctgatttg acccaagacg 9240
ggaagaacta tgatttcatg ttccagccct tgatgcttta tgcgcagaca tggacctccg 9300
aactggtaca aagagacaca aggctgaagg actctacatt tcactggcac cttcgatgta 9360
acaggtgtgt aaggccaatc gacgatatca cactggagac ctctcaggtc ttcgagtttc 9420
cggatgtgtc gaaaagaata tctaggatgg tctctggggc cgtgcctcac ttccaaaaac 9480
tccctgatat cegcctgaaa cctggagatt ttgaatcttt aagtggtagg gaaaaatccc 9540
gtcacatagg gtctgctcaa gggctcctat attcgatctt ggtcgcaata catgactcag 9600gatacaatga cggaactatc ttccctgtca acatatatgg caaggtctct cctagagact 9660
atttgagggg gctcgcaaga ggagtcctca tagggtcgtc catctgcttt ttgaccagaa 9720
tgactaatat caacattaac aggcctctcg agttgatctc aggcgtgatc tcatatatcc 9780
tcttgaggct ggataatcac ccatctttgt acataatgct cagagaaccg tctctgagag 9840
gagagatatt ttctataccc cagaaaattc cagctgctta cccaaccacg atgagggagg 9900
gtaatagatc tatcctatgt tacctccaac atgtgctgcg ctatgagcga gaggttatta 9960
cagcatctcc agagaatgac tggttgtgga tcttctcaga ctttaggagc tccaagatga 10020
cgtacctaac tctcatcact tatcagtccc atcttctact tcagagggtc gaaagaaatc 10080
tgtcgaagag tatgagagct aacctgcgac agatgagttc cttgatgagg caggtgctag 10140
gagggcatgg agaggacacg ttagagtcag atgatgacat tcaaaggcta ttaaaggact 10200
ctctgcgtag aacgaggtgg gtggatcaag aagtgcgcca tgcagccagg actatgacgg 10260
gggattacag ccccaataaa aagatgtcac gcaaggcggg atgttctgag tgggtttgct 10320
ctgctcagca ggttgcagtc tccacctcgg ctaatccggc ccctgtctca gagcttgaca 10380
taagggccct ctctaggagg tttcagaacc ctctcatctc gggattaaga gtggttcagt 10440
gggcgactgg tgctcattat aaacttaagc caattttgga tgatctcaat gtttttccat 10500
ctttatgtct tgtggtcgga gacggatcag ggggaatatc gagagcagta ctcaacatgt 10560
ttccagatgc taggcttgta ttcaatagct tgttggaggt gaatgacctg atggcctccg 10620
gaacacatcc attacctcct tcagcaatca tgagtggagg agatgacatt gtctccagag 10680
taatagactt cgactcaatc tgggagaaac catcggatct caggaacttg accacatgga 10740
agtacttcca gtcagtccag aggaaggtga acatgtctta tgacctcatc atttgtgatg 10800
cagaagttac tgacatagca tcaattaatc ggataacact gttgatgtct gacttcgcat 10860
tgtctataga tggcccgctg tatttggtct tcaaaactta tgggactatg ctggtaaatc 10920
cagaatatag agcaattcaa cacctgtcaa gggcattccc ttcagtcaca ggatttataa 10980
cccagatgac ttcgtccttc tcatctgagc tataccttcg attctccaaa cggggaaaat 11040
tcttccgaga tgccgagtac ttaacctctt ctacccttcg agagatgagc ctcgtcttgt 11100
tcaactgtag cagccctaag agtgagatgc agagggctcg ctctttgaat taccaagatc 11160
ttgtaagagg attcccagag gagattatat ccaatcctta caatgagatg atcataacct 11220
tgattgacag tgatgtggaa tccttcctgg ttcacaagat ggtagatgat ctcgaattac 11280
aaagagggac tctatctaaa atgtctatca ttatagccat catgatagtt ttctccaata 11340
17gagtctttaa tgtctctaaa ccattgacgg accctttgtt ttatccacca tctgacccca 11400
aaatcttgag gcacttcaac atatgctgca gtacaatgat gtatttggca actgctctag 11460
gtgatgtccc cagctttgct aggcttcatg acttgtacaa tagacccata acttattact 11520
tcaagaagca ggttattcga gggagtattt atctgtcttg gagttggtct gatgatacct 11580
ctgtgttcaa gagggtggca tgcaactcta gcttgagtct gtcgtctcac tggatcaggc 11640
tgatctacaa gatagtgaag accactagac tcatcgggag cattgaagac ttatctggag 11700
aggtggtgag acatcttcaa gggtataaca ggtggattac cctcgaggac atcagatcta 11760
gatcatctct attagactac agctgcttat gagctgaata ttgttgaggc ttgtaaatac 11820
tgaagctctt ggatggtgta ccctgaaaaa aaacaagatc ccaaatcaga acctctggtt 11880
gcttgattgt ttttttcatc tttatggttt atttgttaag cgt 11923
<210〉 2 <211〉 19 <212> DNA <213〉正向引物 <400> 2
gtacctagac gcttaac犯 19
<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213〉反向引物 <400> 3
cgtgaccaac agcatttgat 20
<210〉 4
<211> 24
<212〉 DNA
<213> 正向引物
18<formula>formula see original document page 19</formula>taacacccct ccttttgaac cat 23
<210> 9 <211> 23 <212> DNA <213>反向引物 <400> 9
gtggtgttgc ctgttttttt cac 23
<210> 10 <211> 20 <212〉 DNA <213〉正向引物 <400> 10
咖ccccatc agcttcttct 20
<210> 11 <211〉 20 <212> DNA <213〉反向引物 <400〉 11 ttgcactcac tcttatctg
20
<210〉 12 <211〉 20 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 12
aa3c3ggc3a caccsctgat 20<210> 13 <211〉 20 <212> DNA <213>反向引物 <400> 13
atccttcatc ttccacaacc 20
<210> 14 <211> 25 <212> DNA <213〉正向引物 <400> 14
cggagtgagt gcaagacaat gtcat 25
<210> 15 <211> 23 <212> DNA <213>反向引物 <400> 15
ttgctccctt tggatgctct ctt 23
<210> 16 <211> 21 <212〉 DNA <213>正向引物 <400> 16
cctggttgtg gaagatgaag g 21
21<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213>反向引物 <400> 17
aaacaccccg ttcacatgg 19
<210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 18
aacagcagag ggaagagagc at 22
<210〉 19 <211> 20 <212> DNA <213>反向引物 <400> 19
ggatgagatc ttcgggactt 20
<210> 20 <211〉 19 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 20
aggcagatgt catccccat 19 <210〉 21
22<211> 21 <212> DNA <213>反向引物 <400> 21
tcggatctac cgggtcatca t 21
<210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 22
atctcatccc cttgagttga ag 22
<210〉 23 <211> 22 <212> DNA <213〉反向引物 <400> 23
tggagagata ccttccaaat gc 22
<210> 24 <211〉 20 <212> DNA <213> 正向引物 <400〉 24
aggagaggtt tatgatgacc 20
<210> 25 <211〉 20
23<212> DNA <213>反向引物 <400〉 25
atcgagttga ctcaccttgt 20
<210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 26
gactatgata aggcatttgg aagg 24
<210> 27 <211> 24 <212> DNA <213>反向引物 <400> 27
ctagtcttgt tctggtgaaa gagt 24
<210〉 28 <211> 22 <212> DNA <213〉 正向引物 <400〉 28
taaaggacaa ggtgagtcaa ct 22
<210〉 29 <211> 22 <212> DNA
24<213>反向引物
<400> 29
tctggaaaaa ctcatgagtc ct 22
<210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 30
t卿tgacaa gtcgC3ctct t 21
<210> 31 <211> 21 <212〉 DNA <213>反向引物 <400〉 31
gaggttgact atttggtcgt t 21
<210> 32 <211> 22 <212> DNA <213>正向引物 <400> 32
ctcatgagtt tttccagaag tc 22
<210〉 33 <211> 22 <212> DNA <213>反向引物<400> 33
ttgcatcctt gagcaagata gt 22
<210〉 34 <211> 22 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 34
cagagtctct tgcatctcga ac 22
<210〉 35 <211> 22 <212> DNA <213>反向引物 <400〉 35
gacactgaga ctctaggatt cc 22
<210> 36 <211〉 23 <212〉 DNA <213> 正向引物 <400〉 36
tcttgctcaa ggatgcaatc agg 23
<210> 37 <211> 23 <212> DNA <213>反向引物 <400> 37tagagtcctt cagccttgtg tct 23
<210> 38 <211〉 22 <212> DNA <213〉 正向引物 <400> 38
tagagtctca gtgtctgtgc tc 22
<210> 39 <211〉 22 <212> DNA <213〉反向引物 <400> 39
cagagacggt tctctgagca tt 22
<210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> 正向引物 <400> 40
gactctacat ttcactggca ccttc 25
<210> 41 <211> 25 <212> DNA <213>反向引物 <400> 41
agcagagcaa acccactcag aacat 25
27<210〉 42 <211> 21 <212> DNA <213>正向引物 <400> 42
acataatgct cagagaaccg t 21
<210> 43 <211> 21 <212> DNA <213>反向引物 <400> 43
ctgcatcaca aatgatgagg t 21
<210> 44 <211> 21 <212> DNA <213>正向引物 <400> 44
tgtctcagag cttgacataa g 21
<210> 45 <211> 21 <212> DNA <213>反向引物 <400> 45
ccgtcaatgg tttagagaca t 21<formula>formula see original document page 29</formula>
權(quán)利要求
1、一種狂犬病街毒株HN10全基因組序列，其特征在于，該序列如SEQ ID No.1所示。
2、 權(quán)利要求1所述狂犬病街毒株HN10全基因組序列擴(kuò)增引物，其特征在于， 所述擴(kuò)增引物如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24個(gè)引物對(duì)。
3、 一種制備狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法，其特征在于，引物合成 如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，針對(duì)所示引物將病毒基因組序列分為 24段；利用SEQIDNo,2至SEQIDNo.49所示引物分別對(duì)分段基因序列進(jìn)行 目的基因的PCR擴(kuò)增；目的基因片段的回收，測(cè)序；對(duì)所測(cè)定的序列利用生 物軟件對(duì)各段序列重疊部分的比對(duì)作用進(jìn)行序列拼接，將24個(gè)片段首尾相接， 最終得到狂犬病街毒株HN10全基因組序列，如SEQ ID No.l所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法， 其特征在于，所述病毒基因組序列分段為根據(jù)SEQ ID No.2至SEQIDNo.24 所示引物將病毒逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA分為24個(gè)片段，每片段不超過l.lkb。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備狂犬病街毒株HNIO全基因組序列的方法， 其特征在于，所述步驟PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為H20 34.5ul， 10xPfx擴(kuò)增緩 沖液5ul， 10mM dNTPmix 1.5ul， 50mMMgSO4 lul，正向引物Flul，反 向引物Rlul， cDNA5ul， PficDNA聚合酶lul;PCR循環(huán)條件參數(shù)先用94°C 2min進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，然后用94°C 15sec; 50°C 30sec; 68°C 40sec進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再進(jìn)行一個(gè)68°C lOmin的延伸。
全文摘要
本發(fā)明公開了狂犬病街毒株HN10全基因組序列，該序列如SEQ ID No.1所示。還提供了該全基因組序列擴(kuò)增引物，如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示。本發(fā)明將病毒基因組序列分為24個(gè)片段，用PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)cDNA，利用片段引物進(jìn)行直接測(cè)序，所用引物根據(jù)狂犬病毒的保守區(qū)域核苷酸序列所設(shè)計(jì)，引物3’末端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置，且最后一個(gè)堿基終止在氨基酸密碼子第二位堿基。本發(fā)明有效地?cái)U(kuò)增出目的片度，提供了全基因序列，有利于了解病毒的分類、進(jìn)化、致病性及分子流行病學(xué)等，該病毒有可能作為反向遺傳系統(tǒng)載體使用，而該病毒序列的測(cè)定為病毒載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/47GK101463355SQ20091007711
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者青 唐, 浩 李 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所